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Articolo metodologico

Saggi di migrazione cellulare e adesione cellulare per studiare l'interazione Leishmania-cellula ospite

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DOI:

10.3791/62461

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4 agosto 2021

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1Laboratory of Host - Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui studiamo le implicazioni dell'interazione Leishmania-ospite esplorando la migrazione delle cellule dendritiche infettate da Leishmania. Vengono descritti il differenziamento e l'infezione delle cellule dendritiche, l'analisi della migrazione e la valutazione dei complessi di adesione e della dinamica dell'actina. Questo metodo può essere applicato ad altri studi sulla migrazione delle cellule ospiti quando infettati da Leishmania o da altre specie di parassiti intracellulari.

Abstract

La leishmania è un parassita protozoo intracellulare che causa un ampio spettro di manifestazioni cliniche, che vanno da lesioni cutanee localizzate auto-risolutive a una forma viscerale altamente fatale della malattia. Si stima che circa 12 milioni di persone in tutto il mondo siano attualmente infette e altri 350 milioni siano a rischio di infezione. È noto che le cellule ospiti infettate da parassiti della Leishmania , come i macrofagi o le cellule dendritiche, possono migrare in diversi tessuti ospiti, ma il modo in cui la migrazione contribuisce alla disseminazione e all'homing del parassita rimane poco compreso. Pertanto, la valutazione della capacità di questi parassiti di modulare la risposta, l'adesione e la migrazione delle cellule ospiti farà luce sui meccanismi coinvolti nella disseminazione e nella visceralizzazione della malattia. La migrazione cellulare è un processo complesso in cui le cellule subiscono polarizzazione e protrusione, consentendo loro di migrare. Questo processo, regolato dalla dinamica dei microtubuli a base di actina e tubulina, coinvolge diversi fattori, tra cui la modulazione dell'adesione cellulare al substrato. I processi di adesione e migrazione cellulare sono stati studiati utilizzando diversi modelli. Qui, descriviamo un metodo per caratterizzare gli aspetti migratori delle cellule ospiti durante l'infezione da Leishmania . Questo protocollo dettagliato presenta la differenziazione e l'infezione delle cellule dendritiche, l'analisi della motilità e della migrazione delle cellule ospiti, la formazione di complessi di adesione e la dinamica dell'actina. Questo protocollo in vitro mira a chiarire ulteriormente i meccanismi coinvolti nella disseminazione della Leishmania all'interno dei tessuti ospiti dei vertebrati e può anche essere modificato e applicato ad altri studi sulla migrazione cellulare.

Introduzione

La leishmaniosi, una malattia tropicale trascurata causata da protozoi parassiti appartenenti al genere Leishmania, provoca un ampio spettro di manifestazioni cliniche, dalle lesioni cutanee localizzate auto-cicatrizzanti alle forme viscerali fatali della malattia. È stato stimato che ogni anno si verificano fino a un milione di nuovi casi di leishmaniosi, con 12 milioni di persone attualmente infette in tutto ilmondo1. La leishmaniosi viscerale (VL), che può essere fatale in oltre il 95% dei casi se non trattata, causa più di 50.000 decessi all'anno, colpendo milioni di persone in Sud America, Africa orientale, Asia meridionale e nella regione mediterranea2. Il principale agente eziologico della VL nel nuovo mondo, Leishmania infantum, viene trasmesso all'uomo dalle femmine di flebotomi infette durante l'alimentazione del sangue3. Questi parassiti sono riconosciuti e internalizzati dai fagociti, ad esempio macrofagi e cellule dendritiche 3,4,5. All'interno di queste cellule, i parassiti si differenziano nelle loro forme intracellulari, note come amastigoti, che poi si moltiplicheranno e saranno trasportati attraverso il sistema linfatico e il flusso sanguigno a diversi tessuti ospiti 6,7. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali i parassiti della Leishmania sono diffusi nell'ospite vertebrato, così come il ruolo svolto dalla migrazione delle cellule ospiti in questo processo, rimangono poco chiari.

La migrazione cellulare è un processo complesso eseguito da tutte le cellule nucleate, compresi i leucociti8. Secondo il classico modello ciclico di migrazione cellulare, questo processo coinvolge diversi eventi molecolari integrati che possono essere suddivisi in cinque fasi: protrusione del bordo d'attacco; adesione del bordo d'attacco ai contatti della matrice; contrazione del citoplasma cellulare; rilascio del bordo posteriore della cella dai siti di contatto; e il riciclaggio dei recettori di membrana dalla parte posteriore a quella anteriore della cellula9.

Affinché avvenga la migrazione cellulare, le sporgenze devono essere formate e quindi stabilizzate attraverso l'attaccamento alla matrice extracellulare. Tra i diversi tipi di recettori coinvolti nella promozione della migrazione cellulare, le integrine sono notevoli. L'attivazione delle integrine provoca la segnalazione correlata alla migrazione; la segnalazione intracellulare avviene quindi tramite chinasi di adesione focale (FAK) e chinasi della famiglia Src, oltre alle molecole di talina, vinculina e paxillina 10,11,12. La fosforilazione della paxillina da parte delle chinasi attivate, tra cui la FAK, porta al reclutamento di molecole effettrici, che trasducono segnali esterni che stimolano la migrazione cellulare. È stato dimostrato che la paxillina è una molecola intracellulare cruciale per l'adesione cellulare, la polimerizzazione dell'actina e i processi di migrazione cellulare 13,14,15.

Il citoscheletro di actina svolge un ruolo centrale nella polarizzazione e nella migrazione dei fagociti16. Durante il processo di migrazione cellulare, le sporgenze formate a causa della polimerizzazione dell'actina si stabilizzano attraverso l'adesione cellulare alla matrice extracellulare. Questo processo può essere modulato dai recettori delle integrine associati al citoscheletro di actina 17,18,19. Diverse proteine leganti l'actina regolano la velocità e l'organizzazione della polimerizzazione dell'actina nelle protrusioni cellulari20. Gli studi hanno dimostrato che RhoA, Rac e Cdc42 regolano la riorganizzazione dell'actina dopo la stimolazione delle cellule aderenti da parte di fattori extracellulari21,22. Durante la migrazione, Rac1 e Cdc42 si trovano sul bordo anteriore della cellula, controllando l'estensione rispettivamente dei lamellipodi e dei filopodi, mentre RhoA, situata nella parte posteriore della cellula, regola la contrazione del citoscheletro di actomiosina 15,23,24,25.

Gli studi hanno dimostrato che l'infezione da Leishmania modula le funzioni della cellula ospite, come l'adesione al substrato cellulare e la migrazione 26,27,28,29,30,31. Le DC immature risiedono nei tessuti periferici; dopo l'interazione con PAMPS, queste cellule si attivano e migrano verso i linfonodi drenanti, stimolando la presentazione dell'antigene alle cellule T. Uno studio precedente su un modello murino ha dimostrato che l'infezione da L. amazonensis provoca una riduzione della migrazione delle DC verso i linfonodi drenanti29. È stato anche dimostrato che l'inibizione del processo di adesione riduce la migrazione delle DC dopo l'infezione da L. major30. Ciononostante, l'impatto della migrazione delle DC sulla diffusione del parassita nell'ospite, così come i meccanismi coinvolti in questo processo, rimangono poco compresi.

Qui presentiamo un protocollo compilato passo dopo passo per eseguire un test di adesione e migrazione in vitro che coinvolge DC umane infettate da Leishmania. Questo metodo comprende non solo la differenziazione e l'infezione delle DC, ma consente anche l'analisi della motilità e della migrazione delle cellule ospiti, la formazione di complessi di adesione e la dinamica dell'actina. Il protocollo in vitro attualmente descritto consente ai ricercatori di studiare ulteriormente i meccanismi coinvolti nella disseminazione della Leishmania all'interno dei tessuti ospiti dei vertebrati e può anche essere manipolato e applicato ad altri studi sulla migrazione cellulare.

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Protocollo

Le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato di Revisione Istituzionale dell'Istituto Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, protocollo n. 2.751.345). I campioni di sangue sono stati ottenuti da donatori volontari sani. Le procedure sperimentali sugli animali sono state condotte in conformità con i Principi Etici nella Ricerca Animale adottati dalla legge brasiliana 11.784/2008 e sono state approvate e autorizzate dal Comitato Etico per la Ricerca Animale dell'Istituto Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, protocollo n. 014/2019).

1. Isolamento e differenziamento di cellule dendritiche umane

  1. Pipettare 10 mL del terreno a gradiente di densità in provette da centrifuga da 50 mL.
  2. Etichettare le provette da 50 mL in base al campione di ciascun donatore.
  3. Raccogliere ~ 50 ml di sangue venoso da donatori sani e, dopo la raccolta, seguire le procedure descritte di seguito nell'armadietto di flusso.
  4. Trasferire con cura il sangue raccolto in provette da centrifuga e diluirlo in soluzione salina (cloruro di sodio allo 0,9%) in un rapporto di 1:1 a temperatura ambiente.
  5. Sovrapporre lentamente il sangue diluito sulla parte superiore del mezzo del gradiente di densità.
  6. Provette da centrifuga contenenti il sangue e il terreno del gradiente di densità a 400 x g per 30 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Spegnere il freno prima della centrifugazione per evitare la miscelazione degli strati di gradiente. Dopo la 1a centrifugazione, abbassare la temperatura della centrifuga a 4 °C.
  7. Rimuovere con cautela le provette dalla centrifuga.
  8. Identificare l'anello di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) nel campione (buffy coat); Rimuovere delicatamente il plasma residuo con una pipetta.
    NOTA: Dopo la centrifugazione, si saranno formati i seguenti strati di gradiente: eritrociti, mezzo di gradiente di densità, anello PBMC e plasma. L'anello PBMC si trova tra il mezzo di gradiente di densità e gli strati di plasma.
  9. Trasferire lo strato di PBMC simile a una nuvola in una nuova provetta e portare il volume a 30 mL con una soluzione salina.
  10. Centrifugare le provette contenenti la sospensione cellulare a 250 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di soluzione salina.
  11. Raccogliere un'aliquota per il conteggio delle celle con il metodo di esclusione del blu di tripano. Innanzitutto, diluire in un rapporto di 1:1.000. Quindi, utilizzare 10 μl di cellule diluite per la colorazione con blu di tripano e contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer per determinare la vitalità cellulare.
  12. Centrifugare nuovamente a 200 x g per 10 min sotto i 4 °C.
  13. Risospendere il pellet nel tampone MACS. Utilizzare 80 μl di tampone per ogni 1 x 107 celle.
    NOTA: Composizione del tampone MACS: Preparare una soluzione contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2, albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5% e 2 mM di EDTA. Diluire la soluzione tampone in rapporto 1:20 con la soluzione di risciacquo. Mantenere il tampone freddo e conservarlo a 2-8 °C.
  14. Aggiungere microsfere di CD14 alla sospensione cellulare preparata al punto 1.13. Utilizzare 20 μl di microsfere CD14 per ogni 1 x 107 cellule.
    NOTA: Le microsfere CD14 sono utilizzate per la selezione positiva di monociti umani da PBMC, poiché le perle si legano alle cellule CD14-positive espresse sulla maggior parte dei monociti.
  15. Omogeneizzare la soluzione contenente il pellet e le microsfere utilizzando una pipetta. Conservare in ghiaccio per 15 minuti.
  16. Centrifugare la sospensione a 300 x g per 10 minuti a temperatura inferiore a 4 °C.
  17. Risospendere le celle nel buffer MACS. Utilizzare 1-2 ml per 1 x 107 cellule nella miscela di microsfere cellulari.
  18. Centrifugare la sospensione a 300 x g per 10 minuti a temperatura inferiore a 4 °C.
  19. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di tampone MACS.
    NOTA: Questo è il volume massimo della sospensione cellulare che può essere processato attraverso una colonna.
  20. Assemblare la colonna magnetica.
  21. Lavare la colonna una volta aggiungendo 500 μL di tampone MACS. Lasciare che il buffer scorra per gravità attraverso la colonna.
    NOTA: Non lasciare asciugare la colonna, poiché l'aria che entra può ostruire la colonna.
  22. Aggiungere 500 μl della soluzione del campione cellulare dal passaggio 1.19 per colonna. Lasciare che la soluzione del campione di cella fluisca per gravità attraverso la colonna.
  23. Lavare la colonna aggiungendo 500 μl di tampone MACS (2x). Aggiungere il tampone fresco solo quando il serbatoio della colonna è vuoto. Evitare l'essiccazione.
  24. Pipettare 1 mL di tampone MACS sulla colonna e inserirlo in una nuova provetta sottostante. Risciacquare immediatamente le celle marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna.
  25. Centrifugare le cellule arricchite con CD14 a 300 x g per 10 minuti a temperatura inferiore a 4 °C.
  26. Contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer.
  27. Risospendere le cellule in RPMI completo da 1 mL con interleuchina-4 (IL-4) (100 μL/mL) + fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) (50 ng/mL).
    NOTA: Il GM-CSF è una citochina secreta da macrofagi, cellule T, mastociti, cellule natural killer, cellule endoteliali e fibroblasti che induce la differenziazione e la proliferazione dei progenitori mieloidi nel midollo osseo. GM-CSF e IL-4 sono utilizzati per indurre il differenziamento delle cellule dendritiche32.
  28. Seminare le cellule in una piastra da 24 pozzetti a una concentrazione di 2 × 105 cellule per pozzetto in 500 μL di terreno RPMI completo contenente e incubare le cellule per 7 giorni nell'incubatore per colture cellulari a 37 °C.

2. Coltivazione di Leishmania infantum

NOTA: In questo test vengono utilizzati i parassiti Leishmania infantum (MCAN/BR/89/BA262). I criceti sono stati infettati per via endovenosa con 20 μL della soluzione contenente 1 x 106 L. infantum promastigotes in soluzione fisiologica sterile. Dopo 1 o 2 mesi, gli animali sono stati soppressi e le forme amastigote di Leishmania sono state recuperate dalla milza e differenziate in promastigoti33.

  1. Far crescere L. infantum promastigotes isolato da milze di criceto precedentemente infettate in un pallone di coltura cellulare inclinato di 25 cm2 contenente 3 mL di terreno Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) e 5 mL di terreno minimo essenziale (MEM) integrato.
    NOTA: In questo test, il terreno MEM è stato integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 24,5 nM di emina bovina.
  2. Incubare a 24 °C per 7 giorni in incubatore BOD (Bio-Oxygen Demand).
  3. Pipettare 100 μL di coltura di promastigote in un nuovo pallone di coltura cellulare da 25 cm2 contenente 5 mL di terreno MEM integrato.
  4. Incubare la coltura di promastigote a 24 °C in un'incubatrice BOD fino a quando i promastigoti raggiungono la fase stazionaria. Contare periodicamente i promastigoti in coltura trasferendo un'aliquota di sospensione parassitaria diluita in soluzione salina in una camera di Neubauer (cioè emocitometro) per determinare la fase stazionaria di crescita.
    NOTA: Si sconsiglia l'uso di parassiti di primo passaggio dopo la coltivazione in terreno NNN per evitare tracce residue di sangue di coniglio.
  5. Trasferire 1 x 105 di coltura stazionaria in fase di crescita di L. infantum promastigotes in un nuovo pallone di coltura cellulare da 25 cm2 e aggiungere 5 mL di terreno integrato con MEM.
  6. Monitorare periodicamente la crescita della coltura per circa 7 giorni utilizzando una camera Neubauer fino al raggiungimento della fase stazionaria. I parassiti sono ora pronti per l'uso nelle procedure sperimentali di infezione.
    NOTA: Le colture di promastigote sono considerate vitali per l'infezione per un massimo di 7 passaggi in vitro; ulteriori passaggi possono indurre la perdita di virulenza.

3. Infezione delle cellule dendritiche umane

  1. All'interno di una cappa a flusso laminare biologico, trasferire tutto il contenuto dal pallone di coltura dei parassiti a provette da centrifuga da 50 mL.
  2. Aggiungere una soluzione salina fredda a un volume finale di 40 mL.
  3. Centrifugare a 1.600 xg per 10 min sotto i 4 °C.
  4. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione e risospendere il pellet in 1 mL di soluzione salina fredda (ripetere i passaggi 3.3-3.4 tre volte).
  5. Dopo aver lavato le celle per rimuovere eventuali parassiti non vitali, risospendere il pellet in 1 mL di soluzione salina fredda.
  6. Passare lentamente il contenuto attraverso una siringa da 1 ml con un ago da 16 G 5 volte per separare i gruppi di parassiti.
  7. Rimuovere un'aliquota per determinare la concentrazione di parassiti in un emocitometro (calcolare il numero medio di parassiti in 4 quadranti x fattore di diluizione x 104).
  8. Lavare le cellule dendritiche aggiungendo 1 mL di soluzione salina e centrifugare le celle a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (3 volte).
  9. Calcolare la quantità di L. infantum necessaria per l'infezione sperimentale; Rapporto: 20 parassiti per cellula.
  10. Posizionare il volume richiesto di L. infantum in ciascun pozzetto delle piastre di coltura cellulare.
  11. Incubare le cellule dendritiche con parassiti per 4 ore in un incubatore a 37 °C sotto il 5% di CO2.
  12. Dopo il passaggio 3.11, centrifugare le piastre a 300 x g per 10 minuti a temperatura inferiore a 4 °C.

4. Saggio di migrazione mediante inserti per colture cellulari

  1. Dopo l'infezione, lavare le cellule dendritiche (infette o meno) 3 volte con 1 mL di soluzione salina a temperatura ambiente per rimuovere i parassiti non internalizzati. Dopo ogni lavaggio, centrifugare le piastre a 300 x g per 10 minuti a temperatura inferiore a 4 °C.
  2. Una volta rimossi i parassiti non internalizzati, staccare le cellule aggiungendo 200 μL del reagente di dissociazione cellulare in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti. Conservare le cellule in un incubatore a 37 °C sotto il 5% di CO2.
  3. Omogeneizzare le cellule utilizzando un puntale per pipetta da 1.000 μl per consentire l'allentamento delle cellule.
  4. Trasferire le cellule dissociate in una provetta da centrifuga da 50 mL.
  5. Centrifugare a 300 x g per 10 min sotto i 4 °C.
  6. Risospendere il pellet in 1 mL di terreno RPMI integrato con il 10% di FBS.
  7. Passare lentamente il contenuto di ogni provetta attraverso una siringa da 1 ml con un ago da 25 G 5 volte per separare le cellule.
  8. Rimuovere un'aliquota, diluire con blu di tripano per determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro (media delle cellule vitali in 4 quadranti × fattore di diluizione × 104).
  9. Preparazione degli inserti per micropiastre per colture cellulari:
    NOTA: Gli inserti per colture cellulari (membrana in policarbonato con pori da 5,0 μM) sono consigliati per i saggi di migrazione con cellule dendritiche, macrofagi e monociti, poiché questi inserti consentono ai fagociti di passare attraverso le membrane.
    1. Rimuovere gli inserti con una pinzetta sterile e metterli in pozzetti vuoti.
    2. Aggiungere 600 μl di terreno RPMI integrato con il 10% di FBS in ciascun pozzetto; aggiungere chemioattrattivo chemochina (motivo C-C) ligando 3 (CCL3) (1 μL per ogni 1 mL di terreno).
      NOTA: CCL3 è una chemochina che regola la migrazione DC34.
    3. Utilizzando una pinzetta sterile, posizionare gli inserti nei pozzetti contenenti il terreno.
  10. Aggiungere 2 x 105 cellule dendritiche (infette o meno) in 100 μL di terreno a ciascun inserto.
  11. Incubare per 4 ore per consentire alle cellule di migrare.
  12. Dopo 4 ore, estrarre la piastra e aspirare il terreno. Aggiungere 100 μl di paraformaldeide al 4% e incubare per 15 minuti.
  13. Rimuovere la paraformaldeide e aggiungere 100 μL di soluzione salina.
    NOTA: Le piastre possono essere mantenute a 4 °C per un successivo montaggio.
  14. Raccogliere il surnatante dagli inserti o dai pozzetti per contare rispettivamente le cellule non migratorie o quelle che hanno attraversato la membrana. Incubare con paraformaldeide al 4% per 15 min.
  15. Concentrare le cellule utilizzando una tecnica di citocentrifugazione35.
  16. Aggiungere 10 μl del mezzo di montaggio con DAPI alle membrane e posizionare i vetrini coprioggetti sui pozzetti.
  17. Montaggio della membrana dell'inserto.
    NOTA: Questo passaggio può essere eseguito all'esterno delle cappe di biosicurezza.
    1. Rimuovere le membrane dell'inserto dai pozzetti.
    2. Raschiare la superficie dell'inserto con un tampone per rimuovere le cellule che non sono migrate.
    3. Utilizzando un bisturi, rimuovere la membrana dall'inserto.
    4. Posizionare la membrana su un vetrino, con le cellule rivolte verso l'alto.
    5. Aggiungere 10 μl di terreno di montaggio con DAPI a ciascuna membrana, quindi posizionare i vetrini coprioggetti sovrapposti.
    6. Piastre di copertura con foglio di alluminio.
    7. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi conservare a -20 °C
  18. Per analizzare la migrazione cellulare, contare il numero di cellule per campo (non meno di 10 campi) utilizzando un microscopio a fluorescenza a una lunghezza d'onda di eccitazione laser di 405 nm.

5. Saggio di adesione e valutazione della polimerizzazione dell'actina mediante immunofluorescenza

NOTA: Per questo test, utilizzare piastre a 24 pozzetti con vetrini coprioggetti.

  1. Dopo aver infettato le cellule per 4 ore, lavare ogni pozzetto 3 volte con soluzione salina sterile a temperatura ambiente per rimuovere eventuali parassiti non internalizzati.
  2. Centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti a temperatura inferiore a 4°C. Aggiungere 500 μl di paraformaldeide al 4% in ciascun pozzetto per 15 minuti.
  3. Rimuovere la paraformaldeide e aggiungere 1 mL di soluzione salina.
  4. Preparare le soluzioni come descritto nella Tabella 1.
Soluzioni primarieComposto chimicoDiluente
Soluzione di cloruro di ammonio0,134 g di NH4Cl50 ml di PBS 1X
Saponina 15%150 mg di saponina1 mL di PBS 1X
Albumina da siero bovino (ABS) 10%1 g di ABS10 mL di PBS 1X
Soluzioni secondarieComponente 1Componente 2Componente 3
Saponina 0,15%1mL di saponina 15%100 mL di PBS 1X-
PBS 1X / ABS 3% / Saponina 0,15%13,8 mL di PBS 1X6 mL di ABS 10%200 μL di Saponina 15%
PBS1X / ABS 0,3% / Saponina 0,15%:19,2 mL di PBS 1X0,6 mL di ABS 10%200 μL di Saponina 15%
PBS 1X / ABS 1% / Saponina 0,15%17,8 mL di PBS 1X2 mL di ABS 10%200 μL di Saponina 15%

Tabella 1: Ricette tampone.

  1. Immunocolorazione
    NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti sotto agitazione.
    1. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con 1x PBS per 5 min.
    2. Aggiungere 500 μl di soluzione di cloruro di ammonio per pozzetto per 10 minuti.
    3. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con 1x PBS per 5 min.
    4. Permeabilizzare la membrana con Saponina 0,15% per 15 min.
    5. Incubare le cellule con la soluzione bloccante (PBS 1x / ABS 3% / Saponina 0,15%) per 1 ora.
    6. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con PBS 1x/Saponina 0,15% per 5 min.
    7. Diluire gli anticorpi primari in PBS 1x /ABS 1% /Saponina 0,15% come: Coniglio anti-FAK (pTyr397): diluizione 1:500, Coniglio anti-paxilina (pTyr118): diluizione 1:100. Topo Anti-Rac1: diluizione 1:100. Coniglio Anti-Cdc42: diluizione 1:200. Coniglio Anti-RhoA: diluizione 1:200.
    8. Incubare le cellule con anticorpo primario diluito in PBS 1x/ABS 1%/Saponina 0,15% per 1 ora.
      NOTA: FAK e Paxillin sono molecole chiave coinvolte nella formazione dei complessi di adesione 13,14,15. La famiglia delle Rho GTPasi è responsabile dell'organizzazione del citoscheletro di actina. RAC1 e Cdc42, situati sul bordo anteriore della cellula, controllano rispettivamente la formazione di lamellipodi e filopodi; RhoA si trova nella parte posteriore della cellula ed è coinvolto nella contrazione del citoscheletro15, 23,24,25.
    9. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con 1x PBS/Saponina 0,15% per 5 minuti.
    10. Diluire l'anticorpo secondario o la falloidina come segue: IgG anti-coniglio, Alexa Fluor 568: diluizione 1:500; IgG anti-topo, Alexa Fluor 488: diluizione 1:500; IgG anti-topo, Alexa Fluor 594: diluizione 1:500; Falloidina Alexa Fluor 488: diluizione 1:1200.
    11. Incubare le cellule con anticorpo secondario o falloidina diluita in 1x PBS/ABS 0,3% Saponina 0,15% per 45 minuti.
      NOTA: L'incubazione dell'anticorpo secondario o della falloidina deve essere eseguita in assenza di luce. Coprire le piastre con un foglio di alluminio per proteggerle dalla luce durante i passaggi successivi.
    12. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con 1x PBS per 5 min.
    13. Rimuovere i vetrini coprioggetti dai pozzi.
    14. In assenza di luce, aggiungere 10 μl di terreno di montaggio con DAPI su vetrini microscopici puliti.
    15. Posizionare i vetrini coprioggetti con le cellule rivolte verso il basso per consentire il contatto tra le cellule e la soluzione DAPI.
      NOTA: Coprire le diapositive con un foglio di alluminio per proteggerle dalla luce.
    16. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
    17. Conservare a -20 °C.

6. Microscopia confocale, acquisizione e quantificazione di immagini utilizzando FIJI

NOTA: Per acquisire/acquisire immagini in immunofluorescenza, utilizzare un microscopio a scansione laser confocale. Si consiglia l'obiettivo 63x a immersione in olio per una risoluzione ottimale.

  1. Lasciare che i vetrini coprioggetti raggiungano la temperatura ambiente, al riparo dalla luce, per almeno 30 minuti prima dell'acquisizione dell'immagine.
  2. Pulire i vetrini coprioggetti con un panno assorbente.
  3. Aggiungere una goccia di olio da immersione all'obiettivo e posizionare ogni vetrino sotto il microscopio.
  4. Spostare l'obiettivo fino a quando l'olio tocca il carrello.
  5. Osservare e regolare la messa a fuoco del microscopio; Seleziona l'obiettivo 63x con olio.
  6. Accendi i laser a lunghezze d'onda di 488 nm, 552 nm e 405 nm .
  7. Seleziona la risoluzione dell'immagine: 1024 x 1024.
  8. Fare clic sul pulsante Live , impostare lo stack Z e premere Inizia. Ripetere il processo e quindi premere Fine.
  9. Dopo aver selezionato l'opzione Proiezione massima nel menu Strumenti , attendere che l'immagine venga acquisita.
  10. Salva l'esperimento.
  11. Esporta immagini in formato .lif su un computer. Utilizza il software di analisi delle immagini open source FIJI per analizzare le immagini.
  12. Selezionare le immagini da analizzare e selezionare Duplica immagine.
  13. Per avere l'immagine in scala di grigi, selezionare Immagine | Regola | Soglia colore. Selezionare 0 e 255 (saturazione).
  14. Selezionare il metodo di soglia: Predefinito.
  15. Selezionare il colore di soglia: B e W (bianco e nero).
  16. Non selezionare Sfondo scuro.
  17. Seleziona: Processo | Binario | Opzioni e quindi selezionare i dati rilevanti da misurare: Area, Min, Max, valore di grigio, densità di integrazione.
  18. Seleziona lo strumento "mani libere" nella barra degli strumenti delle Figi e traccia manualmente ogni cella con attenzione.
  19. Dal menu Analizza , selezionare Imposta misure. Assicurarsi di aver selezionato l'intensità integrata nell'area e il valore medio del grigio. Ripeti questo processo per ogni cella.
  20. Seleziona tutti i dati nella finestra Risultati e copia e incolla in un foglio di calcolo.
  21. Calcolare la fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF): CTCF (Densità integrata = Area della cellula selezionata x Fluorescenza media delle letture di fondo).
  22. Aprire il file contenente i dati utilizzando un software di analisi statistica per eseguire l'analisi statistica.

7. Analisi statistica

  1. Apri un nuovo progetto quando viene visualizzata una finestra di dialogo di benvenuto.
  2. Scegli il tipo di grafico e il mezzo con SD.
  3. Applicare alla tabella i valori ottenuti dai risultati sperimentali.
  4. Seleziona Statistiche descrittive e scegli l'opzione colonna Statistiche [tutti i test] per analizzare la distribuzione dei dati.
  5. Se i dati seguono una distribuzione gaussiana, scegliere il test t per analizzare i campioni confrontando due coppie. Se la distribuzione non è gaussiana, analizzare i dati utilizzando il test di Mann-Whitney.
  6. Scegli l'opzione grafica migliore per una rappresentazione ottimale dei dati.

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Risultati

Questo protocollo qui descritto consente di valutare la migrazione cellulare e i suoi meccanismi associati, come la dinamica e l'adesione dell'actina, fornendo così uno strumento per determinare la migrazione delle cellule ospiti infette da Leishmania all'interno dell'ospite vertebrato. I risultati qui presentati dimostrano che questo test in vitro fornisce indicazioni rapide e coerenti dei cambiamenti nell'adesione cellulare, nella migrazione e nella dinamica dell'actina prima della sperimentazione

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Discussione

Il metodo qui descritto per valutare la migrazione cellulare utilizzando il sistema di inserti di membrana per colture cellulari consente ai ricercatori di studiare la risposta migratoria delle cellule in un ambiente bidimensionale. In questa tecnica, alcuni passaggi sono considerati critici. In primo luogo, la differenziazione delle DC umane e l'infezione da Leishmania sono determinanti poiché il tasso di infezione dipende dal donatore. L'utilizzo di più di un donatore per espe...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Bahia Research Support Foundation (Fapesb), grant number 9092/2015. Gli autori ringraziano CNPq, Capes e Fapesb per il sostegno finanziario tramite borse di studio. Gli autori ringraziano Andris K. Walter per l'analisi critica, la revisione in lingua inglese e l'assistenza nel copyediting del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago calibro 16Descarpack353101
piastra per coltura cellulare a 24 pozzettiJET-BIOFILJ011024
Ago calibro 25Descarpack353601
Albumina da siero bovinoSigma AldrichA2153-100G
Cloruro di ammonioSigma AldrichA-0171
IgG anti-topo, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-topo IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-coniglio IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Fiaschetta per colture cellulari 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Microscopio confocaleLeicaTCS SP8
Cerchi vetrino coprioggetto 13mmPerfecta10210013CE
Pinze da dissezioneVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Tubo per falcoKASVIK19-0051
Siero fetale bovinogibco
Microscopio a fluorescenzaOlympus  BX51
Vetrino 25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovinoSigma AldrichH2250
EmocitometroPerfecta7302HD
Istopaco® 1077Sigma Aldrich10771
tampone MACS MACSMyltenyi Biotec130-091-221
Minimo Essenziale MediumGibco41090093
Topo anti-Rac1BD610650
ParaformaldeideSigma Aldrich158127
Falloidina Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Soluzione salina tamponata con fosfatoThermoFisherAM9624
Inserti Transwell con membrana in policarbonato - Dimensione dei pori 5,0 e micro; mCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Coniglio anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Coniglio anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Coniglio anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Coniglio anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
CCL3 umano ricombinanteR& D Systems270-LD-010
Umano ricombinante GM-CSFPeproTech300-03
Umano ricombinante IL-4PeproTech200-04
Umano ricombinante M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
Saponina SigmaAldrich 47036 - 50G - F
Siringa 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061
16000044

Riferimenti

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