Aspetti pratici della preparazione del campione e della configurazione di 1H R1ρ Esperimenti di dispersione di rilassamento dell'RNA

Sommario

Presentiamo un protocollo per misurare la dinamica da micro a millisecondo su ¹³C/¹⁵RNA N-labeled e unlabel con spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) a dispersione di rilassamento ¹H R_1ρ. Il focus di questo protocollo risiede nella preparazione di campioni ad alta purezza e nella configurazione di esperimenti NMR.

Abstract

L'RNA è una biomolecola altamente flessibile, in cui i cambiamenti nelle strutture svolgono ruoli cruciali nelle funzioni che le molecole di RNA eseguono come messaggeri e modulatori cellulari. Mentre questi stati dinamici rimangono nascosti alla maggior parte dei metodi strutturali, la spettroscopia di dispersione di rilassamento (RD) R_1ρ consente lo studio della dinamica conformazionale nel regime da micro- a millisecondo a risoluzione atomica. L'uso di ¹H come nucleo osservato espande ulteriormente il regime temporale coperto e dà accesso diretto ai legami idrogeno e all'accoppiamento delle basi.

I passaggi impegnativi in tale studio sono la preparazione di campioni ad alta purezza e ad alto rendimento, potenzialmente ^{etichettati con 13}C e ¹⁵N, nonché la configurazione di esperimenti e l'adattamento dei dati per estrarre popolazione, tasso di cambio e struttura secondaria dello stato precedentemente invisibile. Questo protocollo fornisce passaggi pratici cruciali nella preparazione del campione per garantire la preparazione di un campione ^diRNA adatto e la configurazione di esperimenti 1 H R_1ρ con campioni di RNA sia etichettati isotopicamente che non etichettati.

Introduzione

Gli RNA svolgono una moltitudine di funzioni regolatorie^1,catalitiche²e strutturali³ nella cellula, molte delle quali sono correlate a una struttura molecolare flessibile e a intricati cambiamenti di quelle strutture^4,5,6,7. Gli stati a bassa popolazione rimangono invisibili alla maggior parte dei metodi di determinazione della struttura o non consentono lo studio di questi stati nascosti ad alta risoluzione atomica. La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) allo stato di soluzione combina entrambi gli aspetti fornendo accesso ai singoli nuclei atomici e offrendo una vasta gamma di esperimenti mirati alla dinamica attraverso tutti i regimi temporali⁸. Gli esperimenti RD NMR forniscono l'accesso allo scambio conformazionale nella scala temporale intermedia, in cui ci si possono aspettare cambiamenti nei modelli di accoppiamento delle basi e riarrangiamenti strutturali locali^{5,9,10,11,12,13,14.} Gli esperimenti RD vengono eseguiti come misurazioni lunghe R₂ sotto forma di un treno di impulsi Carr-Purcell-Meiboom-Gill¹⁵ o come misure di rilassamento nel telaio rotante, chiamate esperimenti R_1ρ RD¹⁶.

Sebbene entrambi possano essere usati per estrarre la popolazione e il tasso di cambio e la differenza di spostamento chimico nello stato minore, gli esperimenti R_1ρ RD danno anche il segno della differenza di spostamento chimico dello stato eccitato. Ciò consente un'inferenza sulla struttura secondaria, che è fortemente correlata allo spostamento chimico nelle strutture^{dell'RNA 17}. Lo spostamento chimico è un buon indicatore di elicità nel caso di protoni aromatici e carboni sulle nucleobasi, di partner di accoppiamento di basi per protoni imino e di pucker di zucchero sugli atomi C4' e C1'^18,19. Va notato che recentemente un esperimento di trasferimento di saturazione dello scambio chimico (CEST) che utilizza una maggiore potenza di spin lock (SL), spostando così l'applicabilità dell'esperimento CEST su scale temporali di scambio più veloci, è stato pubblicato come alternativa all'esperimento R_1ρ RD per sistemi con uno stato eccitato.

Sebbene gli isotopi ¹³C e ¹⁵N siano stati spesso utilizzati per accedere allo scambio strutturale, lavori recenti di questo laboratorio hanno utilizzato protoni aromatici e imino come sonde per lo scambio conformazionale^9,10. L'uso di ¹H come nucleo osservato porta diversi vantaggi, ad esempio l'accesso allo scambio su scale temporali più veloci e lente, una maggiore sensibilità e tempi di misurazione più brevi. Ciò è ulteriormente facilitato dall'approccio SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE), che fornisce accesso ai protoni aromatici attraverso il decrowding dello spettro unidimensionale (1D) utilizzando accoppiamenti scalari omonucleari, invece di un trasferimento di magnetizzazione eteronucleare ed eliminando la necessità di etichette isotopiche²⁰. Questo protocollo affronta la misurazione in esperimenti ¹H R_1ρ RD di campioni uniformemente etichettati e non etichettati con N ¹³C/^15. Pertanto, questo documento presenta un metodo di preparazione del campione che è risultato essere il più versatile per le diverse esigenze di preparazione del campione²¹ e discute le alternative nell'ultima sezione di questo articolo (Figura 1).

A questo punto, il lettore dovrebbe notare che altre tecniche di preparazione del campione sono accettabili per gli esperimenti ¹H R_1ρ RD e che altri metodi di analisi strutturale e funzionale possono essere eseguiti con i campioni sintetizzati con la tecnica presentata. ¹ Gli esperimenti H R_1ρ RD richiedono alte concentrazioni di RNA (idealmente >1 mM) e un'elevata omogeneità, sia nella lunghezza dell'RNA che nella conformazione strutturale per garantire una caratterizzazione affidabile della dinamica molecolare. La trascrizione in vitro (IVT) è il metodo di scelta per molti ricercatori per produrre ¹³campioni di RNA C /¹⁵N-labeled a causa della disponibilità di trifosfati nucleosidici etichettati (NTP) e facile incorporazione nella reazione enzimatica²². Tuttavia, la T7 RNA polimerasi (T7RNAP) ampiamente utilizzata^23,24,25 soffre di bassa omogeneità di 5' in caso di alcune sequenze di inizio^26,27 e spesso anche di omogeneità di 3' durante il deflusso della trascrizione^28. La purificazione delle specie di RNA bersaglio diventa più costosa e laboriosa a causa della necessità di grandi quantità di ~ 200 nmol. Il metodo qui utilizzato è stato presentato in precedenza in cui i vantaggi sono stati discussi in generale²¹. In breve, risolve i problemi descritti trascrivendo un trascritto tandem più ampio che viene poi scisso in modo site-specific da Escherichia coli RNasi H, guidato da un oligonucleotide^{chimerico 29,30} (vedi Figura 2 per i dettagli).

L'incorporazione di una sequenza distanziatrice alle estremità 5' e 3' del trascritto tandem consente l'uso di una sequenza di inizio ad alto rendimento e la rimozione di sporgenze terminali vicine al sito di linearizzazione del modello plasmidica, rispettivamente (Figura 2B). Il metodo ha dimostrato di migliorare significativamente i rendimenti, riducendo al contempo i costi e la manodopera, con l'avvertenza di una sintesi di modelli più complessa e la necessità di un enzima e di un oligonucleotide aggiuntivi. L'elevata specificità della scissione della RNasi H facilita la purificazione a causa della mancanza di specie di RNA in un intervallo di dimensioni simile. Il presente protocollo utilizza una fase di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) a scambio ionico che è stata pubblicata da questo laboratorio di recente³¹, sebbene altri metodi siano possibili alternative. ¹ H R_1ρ RD può, in generale, essere acquisito su campioni etichettati o non etichettati con due rispettive sequenze di impulsi, l'esperimento basato sulla correlazione quantistica singola (HSQC) "etichettata" ¹H R_1ρ eteronucleare con una dimensione indiretta^{10 di 13} C e l'esperimento "nonetichettato" ¹H R_1ρ basato su SELOPE con una dimensione indiretta ¹H²⁰.

Questi esperimenti bidimensionali (2D) possono servire come primo controllo, indipendentemente dal fatto che nel campione siano presenti dinamiche sulla scala temporale R_1ρ. È possibile ottenere una panoramica di RD per tutti i picchi risolti negli spettri e identificare i picchi di interesse per un'analisi RD più approfondita. Ciò significa che anche i campioni non etichettati possono essere controllati prima di prendere la decisione di produrre un campione più costoso ed etichettato. Una volta selezionato un picco con contributo di scambio conformazionale da studiare più a fondo, è meglio passare alle versioni 1D degli esperimenti di cui sopra (se il picco può ancora essere risolto) per eseguire i cosiddetti esperimenti di off-risonanza. Per la versione etichettata, il trasferimento HSQC a ¹³C viene sostituito con un passaggio di crosspolarizzazione eteronucleare selettiva (HCP) come utilizzato negli esperimenti ¹³C R_1ρ ^32,33,34,35, mentre nel caso dell'esperimento SELOPE, l'esperimento viene semplicemente eseguito come 1D, che è particolarmente utile per i segnali H8 e H2 che si trovano comunque sulla diagonale nel 2D. Un criterio su quale sequenza utilizzare, a condizione che siano disponibili sia un campione etichettato che un campione non etichettato, è quanto sia ben isolato il picco di interesse nei due esperimenti.

In generale, l'esperimento SELOPE è raccomandato per campioni di RNA fino a 50 nucleotidi. Per gli RNA più grandi, la sovrapposizione sarà maggiore; tuttavia, nucleotidi strutturalmente interessanti appaiono spesso in regioni di spostamento chimico che sono meno sovrapposte e potrebbero comunque essere accessibili in RNA ancora più grandi. Un altro argomento sarebbe che nei campioni non etichettati, non si verifica alcun accoppiamento J tra ¹H e ¹²C. Tuttavia, poiché la potenza minima di blocco dello spin è definita dalla potenza minima utilizzata per disaccoppiare questi due spin (~ 1 kHz) nell'esperimento etichettato, l'esperimento senza etichetta consente l'uso di una gamma più ampia di punti di forza del blocco di spin (SL) e, quindi, l'accesso a una scala temporale più ampia di scambio. Questi esperimenti off-resonance forniscono informazioni aggiuntive a k_ex, come la popolazione dello stato eccitato (conformatore alternativo), p_ES, così come informazioni molto preziose sullo spostamento chimico sotto forma di Δω (la differenza di spostamento chimico dello stato fondamentale e dello stato eccitato).

Figura 1: Flusso di lavoro del protocollo presentato. Preparazione prima dell'effettiva produzione di campioni su larga scala, consistente nella preparazione del modello e nella conferma del successo della trascrizione in vitro e della scissione della RNasi H. Produzione su larga scala che include la purificazione HPLC, il riempimento del tubo NMR e la conferma del ripiegamento dell'RNA. In caso di sintesi con etichetta isotopica, è necessario eseguire una purificazione senza etichetta per l'ottimizzazione del gradiente nello stesso giorno. Caratterizzazione NMR di dinamica conformazionale con esperimenti R_1ρ. Ogni fase può essere eseguita in modo indipendente, ad esempio,l'analisi ¹H R_1ρ RD può essere applicata a qualsiasi campione di RNA adatto prodotto con un altro metodo. Abbreviazioni: IVT = trascrizione in vitro; HPLC = cromatografia liquida ad alte prestazioni; NMR = risonanza magnetica nucleare; RD = dispersione di rilassamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire dettagli pratici e parametri critici per lo studio della dinamica conformazionale con dispersione di rilassamento ¹H R_1ρ in molecole di forcina di RNA. Dopo aver fornito un protocollo dettagliato della progettazione, sintesi e purificazione HPLC a scambio ionico di un RNA bersaglio che può essere eseguito utilizzando tutti, alcuni o nessuno NTP come ¹³C /¹⁵versioni N-labeled, è stato descritto il flusso di lavoro di finalizzazione del campione NMR e conferma dello scambio conformazionale con la spettroscopia NMR. Infine, vengono descritti i dettagli per la configurazione di esperimenti ¹H R_1ρ RD su uno spettrometro Bruker NMR (Figura 1). Il protocollo fornisce ogni passaggio per impostare la versione 1D per campioni etichettati e commenti aggiuntivi e una tabella da regolare per l'impostazione della versione SELOPE (Tabella 2). Dopo il protocollo, vengono discussi i passaggi critici e i percorsi alternativi per la preparazione del campione e la configurazione ^di1 H R_1ρ RD.

Protocollo

Figura 2: Rappresentazione schematica del protocollo IVT tandem riportato. (A) Trascrizione tandem da un modello plasmidico linearizzato con T7RNAP (a sinistra) e successiva scissione da parte della RNAse H del trascritto per raggiungere la lunghezza target dell'RNA, diretta da una guida chimerica del DNA (a destra). (B) Schema dettagliato del modello tandem che inizia con il promotore virale T7RNAP, una sequenza di inizio. La sequenza target (blu scuro, l'esempio qui è lungo 20 nt) viene ripetuta "n" volte. Le ripetizioni sono affiancate da sequenze spaziali da 5′ e 3′ costituite rispettivamente dagli ultimi otto e dai primi quattro nucleotidi, per consentire la rimozione delle sequenze di inizio e restrizione dalla prima e dall'ultima unità di ripetizione. (C) Ibridazione della trascrizione tandem (rosso) e delle guide chimeriche di scissione (verde). La RNasi H fende l'RNA opposto all'estremità del DNA 5′. I fianchi dell'RNA 2′-OMe aumentano la specificità migliorando l'affinità di legame della guida di scissione all'RNA bersaglio. Questa cifra è stata modificata da ²¹. Abbreviazioni: T7RNAP = T7 RNA polimerasi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione del lavoro per un nuovo costrutto di RNA

1. Progettazione e preparazione del plasmide
   1. Scrivi la sequenza del modello in uno strumento di clonazione, ad esempioSerial Cloner.
   2. Prendi la sequenza promotoria T7 e aggiungi una sequenza di inizio ad alto rendimento (T7: 5'-TAATACGACTCACTATA ^GGGAGA-3').
      NOTA: La trascrizione inizierà dal nucleotide indicato con un caret (^). La sequenza di iniziazione GGGAGA è variabile, ma fortemente dipendente dalla sequenza; pertanto, si consiglia l'uso di questa sequenza.
   3. Aggiungere gli ultimi 8 nucleotidi (nt) della sequenza target come distanziatore da 5' (5'S).
   4. Aggiungere ripetizioni della sequenza di destinazione (TS).
   5. Aggiungere i primi quattro nucleotidi come distanziatore da 3' dopo le ripetizioni (5'S).
   6. Aggiungere un sito di restrizione BamHI (RS) o un sito di restrizione univoco simile.
      NOTA: La sequenza totale come mostrato sarà clonata o prontamente ordinata in un plasmide batterico ad alta copia(ad esempio,pUC19): 5'-T7-5'S-(TS)_n-3'S-RS-3' (Figura 2B). Il numero di ripetizioni dovrebbe essere il più alto consentito dalla sintesi genica (un massimo di 600 nt in questo protocollo).
   7. Amplificare il plasmide in E. coli utilizzando un kit commerciale.
   8. Linearizzare il plasmide purificato a 20 ng/μL utilizzando l'apposito sito di restrizione. La restrizione della scala digerisce con BamHI fino a 1 ml.
   9. Purificare il plasmide digerito e confermare la corretta linearizzazione su un gel di acarosio all'1%. Conservare il plasmide linearizzato a -20 °C per diversi mesi.
2. Progettazione della guida alla scissione (Figura 2C)
   1. Scrivi gli ultimi otto nucleotidi della sequenza di RNA bersaglio nella direzione 5'-3' e aggiungi i primi quattro nucleotidi della sequenza di RNA bersaglio all'estremità 3' anche nella direzione 5'-3'.
   2. Generare il complemento dna inverso di quella sequenza
   3. Cambia il primo e gli ultimi quattro nucleotidi nelle loro modifiche 2'-OMe aggiungendo una 'm' prima della lettera nucleotidica.
      NOTA: per la sintesi, viene utilizzato mU al posto di mT.
   4. Ordina l'oligo con purificazione standard di desassale.
      NOTA: Controllare se l'oligo generato potrebbe legarsi in un altro luogo diverso dalla connessione di due sequenze di RNA. È necessaria una piena complementarità nei quattro nucleotidi centrali del DNA, mentre le regioni fiancheggianti potrebbero consentire una mancata corrispondenza. Se necessario, estendere i fianchi fino a 18 nt per generare una sequenza di legame unica³⁶.
3. IVT su piccola scala
   NOTA: per un lavoro senza RNasi, preparare tutti i reagenti in condizioni sterili e prive di RNasi. Utilizzare il reagente di decontaminazione RNasi (vedere la tabella dei materiali)e l'etanolo al 95% v/v per pulire le superfici di lavoro e le pipette prima dell'uso. Lavare i guanti con etanolo al 95% e indossare abiti a maniche lunghe privi di lanugine. Per ridurre al minimo la contaminazione da RNasi, non respirare su tubi aperti.
   1. Preparare soluzioni stock di Tris-Cl (pH 8,0), ditiothreitolo, MgCl_2,spermidina e NTP/GMP (non tamponati). Miscelare i reagenti come mostrato nella Tabella 1. Preparare un mix principale di questi reagenti in anticipo, prima dell'aggiunta di enzimi o acidi nucleici.
      NOTA: Se si utilizzano reagenti congelati, mescolarli accuratamente dopo lo scongelamento. I reagenti potrebbero precipitare se miscelati a concentrazioni troppo elevate, quindi si consiglia vivamente di seguire l'ordine nella Tabella 1.
   2. Aggiungere nel seguente ordine: plasmide, guida alla scissione, fosfatasi inorganica (IPPasi), RNasi H, T7RNAP. Poiché l'attività enzimatica può variare per gli enzimi prodotti internamente, testare diverse concentrazioni prima di selezionare quella migliore.
      NOTA: Includere un controllo negativo per la reazione di scissione, ad esempio senza RNasi H, per attribuire una banda target mancante alla scissione della RNasi H difettosa e non alla trascrizione non riuscita.
   3. Incubare la reazione a 37 °C per 1 ora e confermare la reazione su un'elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante (PAGE) (Figura 3A). Diluire il campione 10 volte in soluzione di carico e caricare 1 μL sul gel.
      NOTA: Miscela di gel: 8 M urea, 20% acrilammide (19:1 acrilammide:bisacrilammide) in 1x TBE. Soluzione di carico: 5 mM di acido tetraacetico etilendiammina (EDTA), 300 μM di blu bromofenolo in formammide. Non ci si può aspettare che le reazioni di scissione della RNasi H siano complete dopo 1 ora, poiché il nuovo RNA viene prodotto costantemente. A questo punto, cerca una chiara banda bersaglio e l'assenza di una specie di peso molecolare simile(ad esempio,±3 prodotti nucleotidici (nt).

Reagente	Concentrazione delle scorte	Quantità su piccola scala (μL)
H2O	-	24
Tris	1 M	5
MgCl2	1 M	0.5
DTT ·	1 M	0.5
Spermidina	250 metri	5
GMP	100 metri	2.5
ATP	100 metri	1.5
GTP ·	100 metri	1.5
UTP	100 metri	1.5
CTP ·	100 metri	1.5
Plasmide	20 ng/μL	5
Guida alla scissione	100 μM	10
iPPasi	10 mg/ml	0.5
RNasi H	10 μg/mL	2
T7 RNA polimerasi	5 mg/ml	2

Tabella 1: Tabella dei reagenti per IVT tandem e scissione simultanea della RNasi H. Le concentrazioni delle scorte possono essere adattate alla convenienzadell'utente. Se la scissione della RNasi H deve essere eseguita dopo T7 IVT, aggiungere la guida di scissione e la RNasi H dopo l'inattivazione termica di T7RNAP. Le quantità utilizzate scalano linearmente con la scala di reazione. Abbreviazioni: T7RNAP = T7 RNA polimerasi; IVT = trascrizione in vitro.

2. Preparazione del campione NMR

1. Aumentare la reazione al volume desiderato (in genere 10 ml) ed eseguire la reazione durante la notte. Test per il completamento della reazione il giorno successivo con un gel PAGE denaturante (Figura 3A).
   NOTA: La reazione di scissione incompleta è mostrata da specie a peso molecolare più elevato al di sopra della banda bersaglio.
   1. Se la scissione non ha avuto successo o non è stata completata, l'RNA reanneale e la scissione guidano nel recipiente di reazione riscaldando la soluzione in un microonde convenzionale a 450 W per 15 s.
   2. Raffreddare lentamente la soluzione a 37 °C per 40 minuti. Utilizzare un blocco riscaldante per volumi inferiori a 1 ml. Si noti la formazione di un nuovo precipitato.
   3. Aggiungere più IPPasi e RNasi H e incubare per altre 1-3 ore a 37 °C. Confermare il completamento della reazione di scissione con la denaturazione di PAGE.
   4. Quando la reazione di scissione della RNasi H è completata, spegnere la reazione aggiungendo EDTA alla concentrazione finale di 50 mM e vortice completamente.
      NOTA: la potenziale precipitazione del pirofosfato si dissolverà e nuove proteine precipiteranno forme.
   5. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm e concentrarsi su un volume iniettabile in un sistema HPLC, a seconda delle dimensioni del ciclo di iniezione.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui congelando il campione a -20 °C.
2. Purificazione HPLC su larga scala
   1. Preparare i buffer a scambio ionico A e B entro una settimana dall'uso. Filtrare e degassare i buffer.
      NOTA: Tampone A: 20 mM di acetato di sodio; 20 mM di perclorato di sodio, pH 6,5. Tampone B: 20 mM di acetato di sodio; 600 mM di perclorato di sodio, pH 6,5.
   2. Equilibrare la colonna con il buffer B al 100% seguito dal buffer A al 100% per almeno 2 volumi di colonne a 75 °C.
   3. Preparare la sequenza HPLC (Figura 3B) ad una portata di 5,5 ml/min. Utilizzare la seguente sequenza per la purificazione di un RNA di dimensioni comprese tra 20 e 30 nt: 0-7 min: 0% B; 7-16 min: pendenza 0-20% B; 16-46 min: eluizione, tipicamente con un gradiente del 20-30% B (ottimizzare in base alle esigenze); 46-62 min: 100% B; 62-73 min: 0% B.
      NOTA: una variazione della portata da 5,5 a 8 ml/min non ha influenzato la separazione in questo protocollo.
   4. Ottimizzare il gradiente di eluizione mediante l'iniezione di un equivalente a 1 mL di reazione di trascrizione (non etichettata) alla volta.
      NOTA: Per ulteriori dettagli e discussioni, fare riferimento a Karlsson et al.³¹ e Feyrer et al.²¹.
   5. Testare le frazioni raccolte su una PAGINA di denaturazione. Se il picco di eluizione principale è ben isolato e contiene l'RNA bersaglio puro, aumentare la purificazione a un equivalente di 10 mL di reazione di trascrizione.
   6. Raccogliere le frazioni di interesse, concentrare e scambiare il buffer con il buffer NMR. Utilizzare un'unità filtrante ultracentrifuga (vedere la Tabella dei materiali)per volumi superiori a 50 ml.
      NOTA: tampone NMR: 15 mM di fosfato di sodio; 25 mM di cloruro di sodio; 0,1 mM EDTA, pH 6,5. Per ridurre al minimo la perdita di RNA aderente alle pareti del tubo di plastica, lavare tutti i tubi di raccolta con 1 mL di acqua, vortice e centrifuga per raccogliere tutto il liquido.
   7. Determinare la concentrazione tramite spettroscopia ultravioletta. Calcola la resa di reazione secondo Feyrer et al²¹.
      NOTA: La concentrazione di un campione NMR per esperimenti RD non deve essere inferiore a 130 nmol, che corrisponde a 500 μM in un volume di campione di 250 μL utilizzando tubi NMR (Tabella dei materiali).
3. Piegatura di un campione di RNA
   1. Diluire e aliquotare il campione di un volume di ~10 mL in 1 mL per tubo.
   2. Riscaldare le aliquote dell'RNA a 95 °C per 5 min.
   3. Raffreddare a scatto i campioni mettendoli su ghiaccio o in una miscela acqua-ghiaccio-sale e incubare per 30 minuti.
   4. Mettere in comune i campioni e concentrarsi a ~ 250 μL in un'unità filtrante centrifuga da 2 mL.
4. Riempimento di un tubo NMR
   1. Pulire il tubo NMR nel pulitore per tubi NMR lavando con abbondante acqua, reagente di decontaminazione RNase, acqua, etanolo al 95% (EtOH) e acqua di nuovo. Lasciare asciugare.
   2. Pulire lo stantuffo risciacquando con acqua e pulendo con il reagente di decontaminazione RNase e 95% EtOH utilizzando una salvietta priva di lanugine. Lasciare asciugare.
   3. Aggiungere il 10% (v/v) di D₂O al campione NMR.
   4. Riempire il campione di RNA nel tubo NMR usando una grande punta di pipetta. Lasciare che il liquido scorra lungo il lato della parete del tubo.
   5. Inserire lo stantuffo e rimuovere le bolle d'aria spingendo lo stantuffo verso il basso insieme a un rapido movimento di torsione.
   6. Tirare lo stantuffo lentamente senza creare nuove bolle d'aria e fissarlo con un film di cera di paraffina.
5. Confermare la piegatura mediante NMR.
   NOTA: A questo punto, è necessario eseguire almeno un'assegnazione parziale di risonanza per confermare la struttura secondaria del campione di RNA e per identificare le regioni di interesse per lo studio della dinamica conformazionale. Una descrizione esaustiva sull'assegnazione della risonanza dell'RNA supererebbe questo protocollo, pertanto ci riferiamo alla letteratura consolidata a questo punto^19,37,38. Un test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) può essere un utile indicatore del ripiegamento dell'RNA e servire come dati complementari per gli esperimenti NMR.
   1. Confrontare i seguenti spettri del campione per il quale vengono eseguiti esperimenti ¹H R_1ρ RD con il campione di riferimento correttamente piegato (Figura 4): ¹H 1D, in particolare la regione imino 10–15 ppm; Aromatico ¹H,¹³C-HSQC; ¹ H,¹H-SELOPE (opzionale).
      NOTA: È necessaria anche un'impronta digitale aromatica, anche in caso di accordo tra segnali imino, perché la formazione di dimeri mostra spesso segnali imino uguali o simili a quelli di una forcina di RNA. L'esperimento SELOPE può sostituire un ¹H,¹³C-HSQC per l'impronta digitale aromatica, poiché gli esperimenti eteronucleari su campioni non etichettati richiedono molto tempo.
   2. Utilizzare il loop UUCG come riferimento per l'impronta digitale (se presente).
   3. Eseguire questo confronto ogni volta prima che vengano registrati gli esperimenti ¹H R_1ρ RD.

3. ¹H R_1ρ Dispersione di rilassamento—on-resonance (versione etichettata 1D)

NOTA: i passaggi seguenti descrivono la configurazione degli esperimenti RD per un campione etichettato utilizzando la versione 1D della sequenza di impulsi RD basata su HSQC. Seguire gli stessi passaggi per la sequenza 1D basata su SELOPE per campioni senza etichetta. Una panoramica dei nomi e delle impostazioni dei parametri per entrambi i casi è illustrata nella Tabella 2. L'attenzione sulle versioni 1D è perché sono più pratiche per le misurazioni fuori risonanza, e la configurazione delle versioni 2D degli esperimenti basati su SELOPE e HSQC è stata discussa in dettaglio da Schlagnitweit et al.²⁰ e Steiner et al.¹⁰, rispettivamente.

1. Determinare la potenza di ¹ora per un impulso duro di 90° (P1).
   1. Opzione A: utilizzare il comando pulsale Bruker.
   2. Opzione B: In un esperimento zg, determinare l'impulso a 360° misurando una curva di nutazione al livello di potenza dell'impulso duro del protone sul picco dell'acqua.
      NOTA: La lunghezza dell'impulso di 90° è un quarto della durata in cui si osserva il segnale zero (se viene misurata una curva di nutazione completa, allora è il secondo zero; tuttavia, in pratica, viene campionata solo la regione intorno al valore atteso per il 360°).
2. Eseguire uno spettro ¹H 1D zgesgp.f2f3dec utilizzando la lunghezza dell'impulso determinata nel passaggio 3.1 per confermare il ripiegamento dell'RNA prima di ogni misurazione R_1ρ.
   NOTA: se gli esperimenti ¹H SL vengono eseguiti per la prima volta, verificare se la potenza SL calcolata corrisponde alla potenza fornita al campione calibrando la potenza SL per ogni larghezza di banda desiderata. Le fasi di calibrazione dettagliate sono descritte in Steiner et al.¹⁰.
3. Creare un set di dati ^{etichettato 1}H R_1ρ e impostare i parametri chiave.
   1. Creare un nuovo set di dati; idealmente basato su un set di dati HSQC aromatico ^1H-13C utilizzato su campioni di RNA completamente etichettati per l'assegnazione dell'RNA.
      NOTA: ciò garantirà che ¹³C e ¹⁵N di potenza e potenza di disaccoppiamento siano già impostati.
   2. Impostare i parametri generali in base alla prima parte della Tabella 2.
   3. Impostare i parametri specifici di RD in base alla seconda parte della Tabella 2.
   4. Impostare la potenza ¹H SL sul valore più basso (1,2 kHz) per il test.
   5. Generare un elenco vd di test con una sola voce, 0 ms, (per ottimizzare l'elenco vd, come descritto nel passaggio 3.4), impostare TDF1 su 1 e aggiornare D30.
   6. Eseguire uno spettro di test con queste impostazioni.
4. Ottimizzare l'elenco vd (elenco delle lunghezze SL da utilizzare).
   1. Esegui l'esperimento con una lista vd di prova (ad esempio,sei voci: 0 m, 5 m, 10 m, 20 m, 30 m, 40 m; rimescola questi valori per evitare errori sistematici dovuti al riscaldamento).
   2. Aggiorna D30 e TDF1 di conseguenza (in questo esempio, D30 = 42m e TDF1 = 6).
   3. Traccia l'intensità del picco rispetto alla lunghezza SL. Identificare la lunghezza SL alla quale l'intensità del picco originale diminuisce a 1/3.
   4. Creare l'elenco vd finale da utilizzare nell'esperimento, tenendo conto di quanto segue: determinare la lunghezza SL più lunga come descritto nel passaggio precedente; evitare di utilizzare un elenco con ordine decrescente o crescente; e aggiungere alcuni duplicati per studi statistici. Ricordarsi di aggiornare D30 e TDF1 ogni volta che ci sono modifiche nell'elenco vd.
      NOTA: l'esperimento viene eseguito con lunghezze SL diverse come indicato nell'elenco vd in modo pseudo-2D.
   5. Selezionare il numero di scansioni in modo che il picco più debole dell'elenco abbia un rapporto segnale-rumore (SINO) di almeno 10.
      NOTA: sebbene l'elenco vd sia stato ottimizzato per una bassa potenza SL (1,2 kHz), anche questo elenco vd dovrebbe essere testato alla massima potenza SL da utilizzare(ad esempio,15 kHz). Questo perché il decadimento sarà molto più lento ad alta potenza SL per picchi con significativo contributo k_EX. Pertanto, un decadimento sufficiente dovrebbe essere verificato anche ad alta potenza SL.

Descrizione del parametro	Nome del parametro nella sequenza di impulsi
	1D etichettato	1D SELOPE
programma a impulsi per 1D di risonanza	1HR1rho_HCP_onres1D.es	1HR1r_HH_onres1D.js
1 Frequenze portante H (ppm)	O1P = risonanza dell'acqua in ppm	O1P = spostamento chimico di picco di interesse (ppm)
	CNST28 = spostamento chimico di picco di interesse (ppm)	CNST29 = risonanza dell'acqua in ppm
1 H impulso duro 90º	P1 @ PL1 (come calibrato in 3.1.1)	P1 @ PL1 (come calibrato in 3.1.1)
Impulsi sagomati e potenze per la soppressione dell'acqua	P25 = 1000 noi @ sp3	P12 = 2000 noi @ sp1
	(Watergate)	(scultura di eccitazione)
13 anni Frequenza portante C, on-risonanza con spostamento chimico 13C di picco di interesse	O2P ·	–
15 anni Frequenza portante N, spostamento chimico medio di 15N per il disaccoppiamento (come usato nell'HSQC aromatico)	O3P ·	–
13 anni Disaccoppiamento C/15N (impostato come in HSQC)	pcpd2, cpd2	–
	pcpd3, cpd3
Trasferimento HCP (ad esempio, p=1/J @ 100 Hz)		–
i comandi pulse e pulsef2 possono essere utilizzati per determinare le potenze dagli impulsi forti
Durata (impostata su 1/J(1H-13C) di picco di interesse)	P11
Potenza 1H e alimentazione 13C	SP1, SP12
Trasferimento SELOPE (d = 1/4J(H5-H6))	–	D5
Impulso selettivo (ad es. regione aromatica) per SELOPE (4000 us, Eburp)	–	P13 e SP4
Parametri specifici SL / RD:
1 Potenza H SL, ottenuta da impulsi duri calibrati (ad esempio, utilizzando il comando di impulso).	Pl25 e CNST12 (1,2 – 15 kHz)	Pl24 (50 Hz – 15 kHz)
Elenco dei ritardi variabili per la durata SL (inizialmente 1 voce, 0, ottimizzazione descritta al punto 3.1.3)	vdlist (~ 0 – 40 ms)	vdlist (~ 0 – 150 ms a causa del basso R2 in campioni senza etichetta)
Numero TDF1 di voci nell'elenco vd (inizialmente 1)	TDF1 ·	TDF1 ·
Compensazione del calore:
D30 = valore più grande nell'elenco vd + 2ms	D30	D30
Compensazione termica aggiuntiva per una gamma molto ampia di FL		PL25
Parametri specifici off-resonance:
programma a impulsi per 1D off-resonance	1HR1rho_HCP_offres1D.es	1HR1r_HH_offres1D.js
Offset per esperimenti fuori risonanza	CNST30 ·	CNST30 ·

Tabella 2: Panoramica dei parametri per impostare esperimenti 1D H R 1_ρ basati su HCPe 1D-SELOPE. Abbreviazioni: 1D = monodimensionale; HCP = cross-polarizzazione eteronucleare; SELOPE = SELective Optimized Proton Experiment; ppm = parti per milione; HSQC= correlazione quantistica di spin eteronucleare; SL = blocco di rotazione; RD = dispersione di rilassamento

5. Messa a terra e acquisizione di esperimenti a risonanza ¹H R_1ρ
   1. Copiate l'esperimento dalla sezione 3.4 in una nuova cartella in Topspin.
   2. In questa cartella, imposta esperimenti a diversi punti di forza SL, cambiando ogni volta PL25 e CNST12. Determinare il livello di potenza corretto per ogni forza SL utilizzando il comando impulso. Utilizzare punti di forza SL compresi tra 1,2 e 15 kHz, con un campionamento più denso per i punti di forza SL inferiori (vedere la Figura 5G per i punti di forza SL selezionati). Aggiungi copie di alcuni degli esperimenti per avere duplicati per alcuni dei punti di forza SL.
   3. Esegui questi esperimenti.

6. Analisi di esperimenti di on-risonanza ¹H R_1ρ
   1. In TopSpin, elaborate ogni fetta di ogni set di dati pseudo-2D utilizzando gli stessi parametri di elaborazione(ad esempio, allargamento della linea, fase) utilizzando il comando xf2e dividete il set di dati in 1D utilizzando il programma Bruker AU split2D.
   2. Ottenere intensità e volumi del segnale per ogni fetta 1D.
      NOTA: In pratica, è meglio deconvolvere gli spettri per eliminare i contributi da picchi potenzialmente sovrapposti e consente l'utilizzo del programma Bruker AU multidcon, che riassume convenientemente le intensità o le aree dei picchi di tutte le fette in un esperimento nel file di testo decall.txt, che può quindi essere letto facilmente con altri programmi (gli script Python scritti internamente sono stati utilizzati qui, come descritto da Steiner et al.¹⁰) nei passaggi 3.6.3 e 3.6.4.
   3. Inserire un decadimento esponenziale mono per ogni forza SL per ottenere il valore R_1ρ (o on-risonanza, R₂+R_EX).
   4. Traccia i valori R₂+R_EX (y) rispetto a. Resistenza SL (x) (Figura 5F,G).
      NOTA: se i valori sono significativamente più alti per i bassi dosaggi SL e diminuiscono con una maggiore potenza SL (come mostrato nella Figura 5G),allora il picco studiato mostra dispersione, e potrebbe essere interessante effettuare ulteriori esperimenti (off-risonanza) per ottenere informazioni sulla popolazione e sulla differenza di spostamento chimico dello stato eccitato vs. lo stato di base.

4. ¹H R_1ρ Dispersione di rilassamento—off-risonanza (versione 1D etichettata)

1. Messa a punti e acquisizione di esperimenti off-resonance ¹H R_1ρ
   1. In una nuova cartella topspin, impostare gli esperimenti a una certa forza SL (di solito prima alla forza SL più bassa poiché il contributo R_EX è più alto lì, vedere la Figura 5G per una selezione rappresentativa di SL off-resonance), ma con offset diversi, ogni volta cambiando CNST30.
   2. Utilizzare offset fino a ± (3 o 4)*SL, con un campionamento più denso intorno a 0 offset, come si può vedere nella Figura 5H,I.
   3. Esegui questi esperimenti.
2. Analisi di esperimenti off-resonance ¹H R_1ρ
   1. Utilizzare la stessa strategia di elaborazione, come in 3.6.1–3.6.3, per determinare un valore R_1ρ per ogni offset.
   2. Traccia questi valori rispetto all'offset (Figura 5G).
      NOTA: Un'asimmetria in questa curva può già indicare che è possibile ottenere informazioni sullo spostamento chimico per lo stato eccitato. È necessario eseguire un'accurata installazione e analisi utilizzando equazioni di Bloch-McConnell o Laguerre per ottenere informazioni su k_EX, p_ES e Δω^10,20 ( Figura5G). Set di dati di esempio, programmi a impulsi e macro per entrambi gli esperimenti 1D sono disponibili nel repository Github di Petzold Lab (https://github.com/PetzoldLab). Una panoramica dei parametri è fornita nella Tabella 2.

Risultati

Il protocollo per la produzione di RNA facilita la purificazione attraverso la generazione di trascritti ad alta purezza. La Figura 3A mostra i risultati di diverse reazioni di scissione di trascrizioni tandem, fornendo reazioni sia riuscite che non riuscite. La corsia 1 mostra il caso ottimale di una trascrizione completamente scissa con solo deboli tracce di prodotti collaterali. La corsia 2a mostra una scissione incompleta, che può essere risolta mediante ricottura e l'aggiunta di più RNasi H (corsia 2b, punto 2.1.2). I costrutti di RNA delle corsie 1, 2a e 2b sono gli stessi. Il campione nella corsia 3 mostra una scissione non riuscita. La risoluzione dei problemi di questa reazione comporterebbe un controllo della sequenza della guida di scissione, della purezza del modello di DNA e delle temperature di ricottura. Potenzialmente, la scissione della RNasi H dovrà essere eseguita dopo T7 IVT come mostrato per il campione 2.

Il campione nella corsia 4 mostra una quantità significativa di prodotti laterali di scissione, che sono difficili da rimuovere tramite HPLC a scambio ionico. La risoluzione dei problemi di un tale campione può comportare (a) l'abbassamento della temperatura, della quantità di RNasi H o del tempo di reazione, (b) la riduzione del gradiente di eluizione e del volume di iniezione e il tentativo di separare le frazioni target dai prodotti laterali. Ulteriori informazioni su come aumentare la risoluzione nella purificazione HPLC a scambio ionico sono state discusse da Karlsson et al.³¹. L'HPLC separa l'RNA bersaglio dagli acidi nucleici più lunghi o più corti e dai contaminanti proteici o a piccole molecole. La Figura 3B mostra il risultato ottimale per la purificazione HPLC a scambio ionico. Il gradiente di eluizione dovrebbe essere scelto in modo tale che la specie di RNA bersaglio eluiti almeno un volume di colonna (in questo esempio: 35 ml) dopo la successiva specie più piccola e un volume di colonna prima della successiva specie più grande.

Le specie più piccole in questo metodo includono singoli nucleotidi, prodotti abortivi (8-12 nt), sequenze distanziali 3' e 5' (5-14 nt) e guida di scissione (acido nucleico chimerico 12 nt), mentre sequenze più lunghe sono ripetizioni tandem potenzialmente uncleaved e il plasmide. Quando si raggiunge un picco di eluizione ben separato, la purificazione può essere scalata fino all'equivalente di ~ 20 mL di reazione IVT per iniezione. La corretta piega di un campione di RNA è fondamentale per gli esperimenti RD e deve essere confermata prima di ogni misurazione. La Figura 4 mostra un RNA 22-mer con etichetta A prima dell'applicazione del protocollo di piegatura nella fase 2.4 (blu) e lo stesso campione dopo che è stato raggiunto il corretto ripiegamento (rosso). Una previsione della struttura secondaria di Mc-Fold (Figura 4C) propone la struttura a forcina presentata con 4 coppie di basi risultanti in 5 segnali imino.

Entrambi gli spettri nella Figura 4A confermano questi segnali previsti, anche se con intensità relative leggermente diverse, il che indica che alcune strutture mal ripiegata (qui, un dimero) possono essere problematiche da valutare con solo ^{spettri 1}H 1D. Uno spettro aromatico ¹H,¹³C-HSQC (Figura 4B), tuttavia, mostra solo 3 dei segnali aromatici per il campione prima del protocollo di piegatura (blu), ma tutti e 4 i segnali per il campione che è stato piegato secondo il passaggio 2.4 (rosso). Il campione mostrato in blu probabilmente formava un omodimero (struttura proposta in Figura 4D)che avrebbe prodotto gli stessi segnali imino della forcina. Il segnale di A13H2 sembra ampliato in scambio. Questi risultati aiutano a evidenziare l'importanza della conferma di piegatura con esperimenti di impronte digitali sia imino che aromatiche prima di ogni esperimento RD. Le sequenze di impulsi ¹H R_1ρ descritte in questo protocollo consentono la rilevazione di dinamiche nel regime di scambio intermedio. Inizialmente viene registrata una curva di risonanza, e se sono presenti dinamiche per un residuo specifico, una dispersione è visibile all'interno dei valori R₂+R_EX ottenuti, mentre questa curva è piatta per i residui senza scambio.

La Figura 5 mostra curve di risonanza rappresentative ottenute per due diversi atomi di H8 in una forcina di RNA sintetico (Figura 5A), in cui G6H8 sperimenta lo scambio (Figura 5C), mentre A4H8 no (Figura 5B). Poiché lo scambio è relativamente lento in questo campione (k_EX = 292 ± 40 Hz), è stato sfruttato il vantaggio dell'esperimento SELOPE per ottenere basse forze SL e le due curve di risonanza sono state registrate utilizzando la versione 1D della sequenza di impulsi. La stessa sequenza di impulsi è stata poi utilizzata per ottenere dati di off-risonanza per il residuo che mostra dispersione nel profilo on-resonance. La figura 5D mostra i valori R_1ρ ottenuti rispetto all'offset in cui una leggera asimmetria della curva indica già il segno di Δω.

Ciò diventa ancora più evidente nel grafico R₂+R_EX in cui viene rimosso il contributo R₁ ( Figura5E). La colonna di destra della stessa figura mostra curve di risonanza rappresentative ottenute per due diversi atomi di H8 in una forcina di RNA sintetico leggermente diversa con scambio più veloce, in cui G6H8 sperimenta lo scambio (Figura 5G), mentre A4H8 no (Figura 5F). Il tasso di cambio più veloce(k_EX = 43.502 ± 38.478 Hz) ha permesso la registrazione RD di tutti i protoni aromatici contemporaneamente utilizzando la versione SELOPE 2D per ottenere dati sia on- che off-resonance (dati G6H8 visualizzati in Figura 5H,I).

Identificatori generali per risultati positivi e negativi
I risultati positivi nella scissione tandem IVT e RNasi H possono essere identificati come segue: 1) La banda target è la banda più forte nel gel PAGE denaturante. 2) Non ci sono o ci sono solo bande deboli intorno alla banda principale. 3) Non ci sono specie deboli o solo deboli ad alto peso molecolare. 4) Il cromatogramma HPLC mostra un picco ben separato dell'RNA bersaglio. 5) Quando viene campionato il picco principale, solo una banda appare su un gel PAGE denaturante.

I risultati negativi nella scissione tandem IVT e RNasi H sono presenti come segue: 1) Nessuna o solo una banda principale debole è visibile su un gel PAGE denaturante. 2) È visibile un modello di specie ad alto peso molecolare da ripetizioni tandem di RNA. 3) Sebbene sia presente la banda principale, bande di intensità simile sono al di sopra o al di sotto della banda principale all'interno ± 3 nt.

Un campione ben piegato può essere identificato come segue: 1) Il numero di protoni imino osservati corrisponde al numero di protoni imino attesi da una simulazione di struttura secondaria(ad esempio,Mc-Fold^39, Figura 4A). 2) La coppia di basi oscillante syn G-U in un loop UUCG (se presente) è visibile a ~ 9,5 ppm, a volte visibile solo a temperature più basse. Un ulteriore rilevamento delle impronte digitali del circuito UUCG è stato descritto da Fürtig e colleghi⁴⁰. 3) L'impronta aromatica concorda con un campione precedentemente assegnato che è stato confermato per piegarsi correttamente (Figura 4C).

Un campione mal ripiegato o degradato può essere identificato come segue: 1) Ci sono più segnali imino di quanto previsto da una simulazione di struttura secondaria (NOTA: meno segnali imino non implicano necessariamente un misfolding, poiché le coppie di basi di chiusura spesso non sono visibili e lo scambio conformazionale allarga le linee). 2) Assenza di segnali imino. 3) Segnali stretti di alta intensità nella regione aromatica, che indicano prodotti di degradazione a singolo nucleotide. 4) Divergenza tra segnali imino o aromatici ad un campione di riferimento di ripiegamento confermato (Figura 4C).

Un atomo che non mostra alcuno scambio nella scala temporale rilevabile può essere identificato come segue: 1) da un profilo RD piatto (a causa del contributo R_EX mancante che varia con la potenza SL applicata) (Figura 5B e Figura 5F). 2) Bisogna fare attenzione al caso di scambio lento-intermedio quando k_EX e Δω sono della stessa grandezza. In tal caso, il contributo di risonanza può essere molto piccolo come si può vedere nella Figura 5C (in questo caso i parametri montati sono k_EX = 292 ± 40 Hz e Δω = 112 ± 4 Hz). In caso di dubbio, è possibile registrare una curva di off-risonanza SL bassa per la verifica.

Un atomo che mostra lo scambio nella scala temporale intermedia può essere identificato 1) da un profilo di dispersione di rilassamento non piatto in un esperimento RD a risonanza (Figura 5B e Figura 5F); 2) una più ampia lalarghenza di linea nell'esperimento HSQC o SELOPE può anche essere un indicatore per lo scambio.

Valori di potenza SL ben selezionati per curve off-resonance (Figura 5E,F): 1) hanno un notevole contributo k_EX nella curva di risonanza (i valori di potenza SL selezionati sono indicati in Figura 5C e Figura 5G). 2) Poiché le curve di off-resonance sono misurate per almeno 3 valori di potenza SL, i valori di potenza SL selezionati devono essere distribuiti sulla regione della curva di risonanza con contributo k_EX. 3) Portare a curve R₂+R_EX non piatte dopo l'adattamento di Laguerre(ad esempio, Figura 5D:forze SL 25, 50 e 75 Hz; Figura 5E).

Valori di potenza SL scarsamente selezionati per curve fuori risonanza(Figura 5E,F)portano a curve piatte R₂+R_EX dopo l'adattamento di Laguerre. Un esempio è mostrato nella Figura 5E, in cui la curva di off-risonanza a 100 Hz è molto piatta e quindi non fornisce informazioni significative su Δω.

Indicazioni per gli artefatti dell'effetto Overhauser nucleare rotante-frame (ROE): 1) Δω ottenuto da curve di risonanza off corrispondono a spostamenti chimici di protoni in prossimità spaziale / protoni, che mostrano un picco incrociato con il picco di interesse nello spettro della spettroscopia nucleare ad effetto Overhauser (NOESY). (ad esempio, la Figura 5I mostra ampie curve fuori risonanza come previsto per lo scambio intermedio veloce, ma le curve hanno anche caratteristiche più nitide, ad esempioa -3000 Hz e +1500 Hz. Questi sono molto probabilmente dovuti a un artefatto ROE piuttosto che a uno spostamento chimico per questo H8 in un conformatore diverso). 2) Laguerre fit funziona, ma non funziona bene (dà errori elevati o valori fisicamente impossibili) per una on-risonanza e almeno 3 curve off-resonance, anche se gli esponenziali sono stati ottenuti da esperimenti con sino alto (>20)(ad esempio, k_EX = 43.502 ± 38.478 Hz). Spesso ogni SL si adatta bene individualmente, ma montarli insieme dà un errore molto più alto; il comportamento opposto è previsto per un vero stato eccitato.

Le indicazioni per lo scambio "vero" Δω: 1) Δω ottenuto da curve off-risonanza non corrispondono agli spostamenti chimici dei protoni nelle vicinanze spaziali / protoni, che mostrano un picco incrociato con il picco di interesse nello spettro NOESY (ad esempio, Figura 5E). 2) Laguerre fit fornisce bassi errori per una risonanza on-resonance e almeno 3 curve off-resonance(ad esempio., Figura 5E vs. Figura 5I, vedere la didascalia per i risultati di adattamento).

Figura 3: Produzione di campioni mediante reazione di scissione del tandem T7 IVT e RNasi H. (A) PAGINA di denaturazione dei risultati positivi e negativi della scissione tandem IVT e RNasi H. L'altezza della scala si riferisce ai riferimenti dell'RNA, 12 * si riferisce alla guida di scissione chimerica. Corsia 1: Generazione di successo di un RNA bersaglio da 20 nt. Sono presenti pochi prodotti più corti e più lunghi. Corsia 2a: Scissione incompleta della trascrizione in tandem. Sebbene la purificazione HPLC sia possibile, molto materiale verrebbe sprecato. Lane 2b: La scissione continua della RNasi H della Corsia 2 produce un campione pulito pronto per l'iniezione di HPLC (identico alla Corsia 1). Lane 4: La scissione della RNasi H non ha avuto successo e non è stata prodotta alcuna banda bersaglio. La trascrizione tandem a figura intera è ancora visibile a 600 nt. Corsia 5: È stata prodotta una banda target, ma è presente una forte banda -1. Sebbene l'HPLC possa essere eseguito, è necessaria un'attenta rimozione del prodotto laterale. (B) Esempio di iniezione HPLC riuscita. Il picco a 38 minuti contiene RNA puro della lunghezza target, mentre i prodotti più lunghi e più corti sono ben separati dall'RNA target. Il pannello B è stato modificato da ²¹. Abbreviazioni: IVT = trascrizione in vitro; HPLC = cromatografia liquida ad alte prestazioni; nt = nucleotidi; AU = unità arbitrarie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esempio di una forcina di RNA prima (blu) e dopo (rosso) della fase di piegatura 2.4 (vedi protocollo) in NMR. (A) Regione Imino di uno spettro ¹H-1D di un RNA 22-mer etichettato A. Le regioni previste per l'identità della coppia di basi dei segnali imino sono indicate in grigio di seguito. (B) ¹H,¹³C-HSQC spettro delle risonanze aromatiche dell'RNA dal pannello A. Il campione dopo la piegatura (rosso) mostra 4 segnali come previsto, mentre il campione prima della piegatura (blu) mostra solo 3 segnali. (C) Previsione di Mc-Fold dell'RNA 22-mer come forcina. Cinque segnali imino sono da aspettarsi da questa struttura secondaria, che può essere trovata in entrambi i campioni nel pannello A. (D) Struttura proposta di un omodimero formato dall'RNA 22-mer, risultante nelle stesse 5 coppie di basi della struttura a forcina. Abbreviazioni: NMR = risonanza magnetica nucleare; 1D = unidimensionale; HSQC = correlazione quantistica singola eteronucleare; ppm = parti per milione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: ¹H R_1ρ RD risultati rappresentativi per due diversi costrutti basati su una forcina di RNA. (A) La colonna di sinistra mostra i risultati ottenuti sull'RNA con una coppia di basi C-G sopra la U rigonfiata, mentre la colonna di destra mostra i risultati ottenuti su un campione in cui la coppia di basi è stata invece commutata in G-C. (B) e (F) mostrano profili di dispersione piatti come ottenuti per A4H8 per i due costrutti, indicando nessuna sostituzione conformazionale. (C–E) mostrano i dati on-resonance, off-resonance e montati ottenuti per G6 nel costrutto (G-C). L'adattamento di Laguerre porta al seguente risultato: R₁ = 2,87 ± 0,01 Hz, R₂ = 7,76 ± 0,03 Hz, k_EX = 292 ± 40 Hz, p_ES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) mostrano dati on-resonance, off-resonance e montati ottenuti per G6 nel costrutto (G-C). Il Laguerre fit porta al seguente risultato: R₁ = 1,93 ± 0,02 Hz, R₂ = 6,71 ± 0,86 Hz, k _EX = 43,502 ± 38,478 Hz, p _ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Questa cifra è stata modificata da ²⁰. Abbreviazione: SL = spin lock. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo qui presentato è una sintesi di diversi protocolli pubblicati in precedenza sotto forma di articoli di ricerca^10,20,21,31. Quindi, i segmenti del protocollo possono essere applicati, mentre altri possono essere scambiati secondo le preferenze del lettore. Ad esempio, le misurazioni di R_1ρ possono essere eseguite su un campione di RNA prodotto con qualsiasi metodo, dato che si presume il ripiegamento e l'omogeneità della lunghezza. Inoltre, il protocollo non contiene informazioni sull'assegnazione di risonanza della sequenza di RNA - un passaggio richiesto per gli esperimenti RD - in quanto questo è stato ampiamente trattato nella letteratura precedente^19,37,38. Schemi di etichettatura parziali, segmentali o specifici del sito^36,41,42,43^,44sono approcci per facilitare l'assegnazione della risonanza o ridurre la sovrapposizione di risonanze che sono di interesse negli esperimenti RD e sono stati descritti a lungo in letteratura. Questo metodo consente l'uso di un'etichettatura uniforme di qualsiasi identità nucleotidica, che può già semplificare significativamente l'assegnazione della risonanza.

Il metodo IVT qui presentato supera i problemi noti con le sequenze e l'etichettatura, aumenta la resa e riduce i costi e i tempi di lavoro rispetto ad altri metodi. L'uso della sequenza di avvio virale riduce la necessità di ottimizzazione della reazione, che è un problema noto nel campo che può richiedere molto tempo per l'esecuzione e produce solo poche copie del trascritto in caso di iniziazione non G. La scissione T7 IVT e RNase H della trascrizione tandem può essere eseguita contemporaneamente nella stessa nave. Un modello di ripetizioni tandem multimeriche può essere visto su un gel PAGE denaturante durante la reazione, che si fonde in una singola banda sull'RNA bersaglio al completamento della reazione RNasi H(Figura 3A,corsie 1 e 2b). Le rese tipiche che utilizzano questo metodo variano tra 30 e 70 nmol RNA per 1 mL IVT. Tuttavia, il metodo basato sulla scissione RNasi H delle ripetizioni in tandem non viene senza alcuni problemi propri. La reazione di scissione della RNasi H spesso non va a compimento quando viene eseguita contemporaneamente alla trascrizione T7(Figura 3A,corsia 2a).

La separazione delle unità tandem può essere finalizzata ricotturando la guida di scissione al trascritto e aggiungendo più RNasi H(Figura 3A,corsia 2b, passo 2.1.2). Poiché il riscaldamento di grandi volumi è lento e porta all'idrolisi catalizzato mg²⁺dell'RNA, è stato utilizzato un forno a microonde convenzionale, che riscalda il campione a >95 °C in 10-15 s. Finora non sono stati osservati effetti avversi sui campioni prodotti. Alcuni costrutti mostrano una seconda banda minore che non poteva essere eliminata dall'ottimizzazione delle condizioni di reazione (Figura 3A, corsia 4). Di solito questi sono piuttosto chiaramente visibili come una spalla nel cromatogramma HPLC, se si utilizza un gradiente di eluizione ben ottimizzato, e possono essere rimossi (passo 2.2.5). La seguente discussione ha lo scopo di evidenziare i passaggi critici nel protocollo, in particolare per quanto riguarda l'ottenimento di dati di alta qualità che consentano un'interpretazione delle dinamiche conformazionali.

Contaminazione da RNasi
Le RNasi extracellulari sono onnipresenti, altamente stabili e rappresentano la più grande minaccia per la stabilità a lungo termine dei campioni di NMR. Pertanto, è fondamentale lavorare in un ambiente privo di RNasi e mantenere tutti i reagenti e gli articoli in plastica privi di RNasi. Si consiglia l'uso di punte filtranti e forse anche maschere facciali. Questo è particolarmente importante dopo la purificazione HPLC. I campioni NMR contaminati da RNasi presentano tipicamente picchi stretti visibili in ¹spettri H-1D dopo giorni o settimane a causa di prodotti di degradazione a singolo nucleotide. Tale campione non è adatto per misurazioni R_1ρ.

Campione NMR
A causa della sua natura altamente carica, l'RNA può essere utilizzato in alte concentrazioni senza precipitazioni rispetto alla maggior parte delle proteine. L'uso di tubi NmR Shigemi (vedi la Tabella dei materiali)è vantaggioso in quanto consentono il centraggio del campione altamente concentrato al centro della bobina, pur fornendo condizioni ideali di shimming e bloccaggio a causa del fondo e dello stantuffo di vetro abbinati alla suscettibilità. In questo modo, la disomogeneità B1 viene ridotta, dando origine a linee più strette. Il volume tipico del campione in un tubo NMR è di 250 μL e la concentrazione tipica è di 1-2 mM. I campioni al di sotto di 500 μM non sono raccomandati per gli esperimenti RD in quanto l'esperimento richiederebbe troppo tempo e un buon spessore. Allo stesso modo, il volume del campione inferiore a 200 μL non è raccomandato perché è richiesta una buona stabilità di spessore e campo (blocco). Quando si inserisce lo stantuffo, è fondamentale evitare la formazione di bolle nel campione (punto 2.4.5). Se non fissato correttamente, lo stantuffo può scivolare verso il basso nel campione, riducendo il volume rilevabile. Inoltre, rapidi cambiamenti di temperatura possono portare alla formazione di nuove bolle nel campione. Pertanto, è necessario prestare attenzione durante il trasporto del campione e quando si modifica la temperatura della sonda nello spettrometro NMR. Controllare il campione per le bolle quando si misura di nuovo dopo un periodo più lungo.

Piegatura dell'RNA
Le molecole di RNA dinamico possono esistere in più conformazioni quando non piegate correttamente. Anche se le temperature di fusione delle strutture secondarie possono essere solo leggermente superiori alla temperatura ambiente, si consiglia un'accurata procedura di riscaldamento e raffreddamento a scatto prima della misurazione. Campioni di forcine altamente concentrati che si piegano sotto controllo cinetico (riscaldamento e raffreddamento a scatto) possono formare omodimeri nel tempo, il che richiede un controllo rigoroso del ripiegamento dell'RNA prima di ogni misurazione NMR. Se l'RNA misurato non è una struttura a forcina ma un duplex di RNA, deve essere applicato un lento ripiegamento sotto controllo termodinamico.

In questo caso, il processo di raffreddamento dopo il riscaldamento dovrebbe essere nell'intervallo di ore, mentre l'RNA viene utilizzato al suo volume finale e alla sua concentrazione nel campione NMR. Un conteggio iniziale delle risonanze imino e aromatiche attese può fornire informazioni sull'omogeneità del campione. Se il campione non sembra come previsto, dovrebbe essere ripiegato. Mg²⁺ (aggiunto come sale di cloruro) può aiutare con il ripiegamento delle strutture^{dell'RNA 45}. In pratica, il controllo di piegatura serve come confronto con un campione che è stato utilizzato per assegnare almeno parzialmente le risonanze NMR e per risolvere sperimentalmente la struttura secondaria.

Considerazioni sull'alimentazione e sul riscaldamento del blocco di rotazione
In caso di esecuzione degli esperimenti ¹H R_1ρ RD come esperimenti di panoramica 2D, la potenza SL non deve essere inferiore a 1,2 kHz. La frequenza del trasmettitore di radiofrequenza deve essere posizionata al centro della regione ppm dei picchi di interesse(ad esempio,7,5 ppm per i protoni aromatici). La larghezza di banda di 1,2 kHz sarà quindi abbastanza grande da bloccare questi protoni senza importanti effetti di off-risonanza. Tali effetti possono essere identificati nel profilo RD. Se si verificano, i valori R₂+R_EX aumentano invece di diminuire con l'aumentare dei valori di potenza SL, in particolare per la bassa potenza SL. Verificare se i valori di potenza SL calcolati corrispondono alla potenza erogata al campione. In pratica, la potenza SL calcolata può essere utilizzata se l'impulso rigido ¹H 90 ° è stato calibrato attentamente su spettrometri più recenti; tuttavia, questo può essere verificato calibrando la potenza SL per ogni larghezza di banda desiderata.

La gamma di potenza SL, che può essere utilizzata negli esperimenti ¹H R_1ρ RD è molto ampia, portando a un riscaldamento del campione variabile (da 1,2 kHz a 15 kHz per HSQC per sequenze basate su HCP e da 50 Hz a 15 kHz per esperimenti SELOPE). Il riscaldamento disuguale del campione può essere rilevato come un leggero cambiamento nello spostamento chimico quando si confrontano 1D ottenuti per SLs a bassa potenza rispetto a. SLs ad alta potenza. Questo effetto di solito non è considerato nelle compensazioni di calore negli esperimenti R_1ρ sugli eteronuclei. La compensazione del calore in questi esperimenti è solitamente impostata per correggere il riscaldamento diverso a causa delle diverse durate di blocco dello spin specificate nell'elenco vd di ciascuna serie di potenza di blocco dello spin. Soprattutto per l'esperimento SELOPE, una seconda compensazione del calore dovrebbe essere utilizzata su tutti i punti di forza SL applicati come descritto in²⁰.

Considerazioni sull'elenco vD
Come accennato in precedenza, l'elenco vd dovrebbe contenere un punto temporale abbastanza lungo da ottenere un decadimento significativo dell'intensità (idealmente fino al 30% del segnale iniziale, o il più basso possibile se non è possibile raggiungere un decadimento del 70% all'interno delle specifiche della sonda). Sebbene l'elenco vd sia stato ottimizzato per una bassa potenza SL (1,2 kHz), questo elenco vd dovrebbe anche essere testato alla massima potenza SL da utilizzare(ad esempio,15 kHz). Ciò è dovuto al fatto che per i picchi con un significativo contributo R_EX, il decadimento sarà molto più lento ad alta potenza SL. Quindi un decadimento sufficiente dovrebbe essere verificato anche ad alta potenza SL. Lo stesso deve essere considerato per i decadimenti ad alti offset in esperimenti fuori risonanza. Il punto temporale massimo ideale dell'elenco vd potrebbe essere significativamente diverso per le diverse regioni dell'esperimento di dispersione. In tal caso, più punti potrebbero essere inclusi nell'elenco vd e i punti elenco vd più lunghi per una maggiore potenza SL o offset più elevati durante l'analisi, in base al basso SINO a cui porteranno, potrebbero essere scartati. In generale, 5-8 punti elenco vd dovrebbero essere considerati in grado di individuare potenziali artefatti che portano a decadimenti non esponenziali come J-coupling (vedi sotto).

1D- Considerazionisulla selettività dell'HCP
È necessario prestare particolare attenzione quando si esegue la versione 1D basata su HCP se c'è un altro picco che si sovrappone al picco di interesse nella dimensione ¹H dell'esperimento basato su HSQC 2D. I trasferimenti basati su HCP sono molto, ma mai selettivi al 100%, e può quindi accadere che un altro picco contribuisca all'intensità e al comportamento di decadimento del picco di interesse nella 1D. Un'indicazione per questo sarebbe una differenza nei valori R_1ρ in risonanza ottenuti usando le versioni 1D e 2D dell'esperimento etichettato.

Considerazioni sul ROE:
Per le curve off-risonanza di atomi con scambio lento-intermedio, gli artefatti ROE possono essere identificati sulla base di un confronto del Δω ottenuto con uno spettro NOESY o ROESY. Se un picco incrociato può essere identificato ad una differenza di spostamento chimico corrispondente a Δω,allora lo stato eccitato osservato potrebbe in realtà essere un artefatto ROE(ad esempio,sono stati trovati ROE tra protoni aromatici, che sono tutti nello stesso intervallo di spostamento chimico e quindi coperti da quelle curve di off-risonanza²⁰). Per esperienza, questo ha sempre portato anche a scarsi adattamenti con errori di grandi dimensioni, probabilmente a causa del ROE che non segue lo stesso schema di R_EX con l'aumento della potenza SL. La situazione diventa più difficile per lo scambio intermedio-veloce. Mentre la curva on-resonance è (dal confronto con i dati ^{di 13}C ottenuti sul nucleo vicino) ancora rappresentativa del processo di scambio tra GS ed ES, la curva off-resonance è influenzata da più artefatti ROE.

In tal caso, la potenza SL per rilevare il processo di scambio è maggiore (>1,5 kHz) e quindi si estende su un numero maggiore di protoni mentre le curve fuori risonanza si estendono su differenze di spostamento chimico di vari candidati ROE (per H8 questi sarebbero: protoni amminici a circa ±1000 Hz, H5 / H1 a circa -1200 Hz, protoni imino a circa 3500 Hz). Finora, non è stato trovato alcun metodo per sopprimere questi artefatti ROE (a parte l'uso di nucleotidi parzialmente deuterati⁴⁶), e i dati fuori risonanza non dovrebbero essere registrati per lo scambio intermedio veloce, poiché nessuna informazione affidabile sul Δω effettivo può essere estratta con questo metodo, se il contributo NOE / ROE non può essere escluso tramite spettri NOESY.

Considerazioni sul J-Coupling (Hartmann-Hahn)
Sebbene le curve di risonanza per i protoni accoppiati a J omonucleari, come H6, siano state registrate con successo^10,20, è necessario prestare particolare attenzione per le misurazioni fuori risonanza, specialmente per la bassa potenza SL poiché le condizioni di corrispondenza hartmann-Hahn possono coprire una vasta gamma di offset studiati. Gli artefatti di Hartmann-Hahn possono essere identificati come oscillazioni sul decadimento esponenziale o valori crescenti di R₂+R_EX con forze SL crescenti in grafici RD a risonanza²⁰.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di acrilammide/bis al 40	%  Bio-Rad	161-0144
5-alfa Competente  E. coli	NEB	C2987I
Acido acetico	Sigma-Aldrich	49199
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
AFC-3000, collettore di frazioni HPLC	Thermo Scientific	5702.1
Agarosio	Sigma-Aldrich	A9414
Amersham ImageQuant 800 UV	GE Healthcare	29399482	Sostituzione di LAS-4000 o
equivalente unità di filtro ultra centrifuga Amicon	Sigma-Aldrich
Persolfato di ammonio	Sigma-Aldrich	A3678
Ampicillina	Sigma-Aldrich	A9518
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
ATP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645702 l'enzima
restrizione BamHI	NEB	R0136L
Filtro per bottiglie	VWR	514-1019
Blu di bromofenolo	Sigma-Aldrich	1081220005
Guida per scissione	IDT	N/A	o
CTP	Sigma-Aldrich	C1506
CTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645699
D2O	Sistema UHPLC Sigma-Aldrich	151882
Dionex Ultimate 3000.	Thermo Scientific	N/A
DL-Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43815
DMSO&	nbsp; Sigma-Aldrich	D8418
Colonna DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep	Thermo Scientific	SP6734
DNAPac PA200 22x50 colonna di protezione	Thermo Scientific	SP6731
E.coli RNasi H	NEB	M0297L	o realizzato internamente Uniprot ref. P0A7Y4
EDTA&	nbsp; Sigma-Aldrich	E6758
Eppendorf centrifuga, rotore: A-4-44	Eppendorf	5804R
Etanolo 95%	Fisher scientific	11574139
Etanolo 95% denaturato	VWR	85829.29
Formamide	Sigma-Aldrich	47671
GelRed	VWR	41003
GeneRuler 1kbp Plus	Fisher Scientific	SM1333	GMP opzionale
	Sigma-Aldrich	G8377
GMP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	650684
GTP	Sigma-Aldrich	G8877
GTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645680
Acido cloridrico	Sigma-Aldrich	H1758
Pirofosfatasi inorganica	Sigma-Aldrich	I1643-100UN&	nbsp; o realizzato internamente Uniprot ref. P0A7A9
Invitrogen UltraPure 10X TBE-tampone	Sigma-Aldrich	T4415
Julabo TW8 Bagnomaria	VWR	461-3117
kuroGEL Midi 13 Elettroforesi orizzontale su gel	VWR	700-0056	o
brodo LB comparabile (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB brodo con agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
Scala ssRNA a basso raggio	NEB	N0364S	Pompa
GPL-3400RS opzionale	Thermo Scientific	5040.0036
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma-Aldrich	63068
marcatore di microRNA	NEB	N2102S
Forno a microonde	Samsung
Apparecchiature per elettroforesi Mini-PROTEAN	Bio-Rad	1658004
NucleoBond Xtra Maxi	Macchinari-Nagel	740414.10M
Plasmide pUC19 contenente inserto tandem&	nbsp; Genscript	N/A	o
RNaseZAP	® equivalente Sigma-Aldrich	R2020
Shigemi tubo 5mm	Sigma-Aldrich Z529427
Siringa monouso, punta Luer lock	VWR	613-2008
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	S2889
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	730-1470
Perclorato di sodio	Sigma-Aldrich	71853
Fosfato di sodio bibasico	Sigma-Aldrich	S3264
Fosfato di sodio monobasico	Sigma-Aldrich	S3139
Spermidina tricloridrato	Sigma-Aldrich	85578
SYBR Oro	ThermoFisher	S11494
Filtri per siringhe	VWR	514-0061
T7 RNA polimerasi	Sigma-Aldrich	10881767001	o realizzato internamente Uniprot ref. P00573
TCC-3000RS Termostato a colonna	Thermo Scientific	5730
Tetrametiletilendiammina	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Fisher Scientific 10103203
UMP	Sigma-Aldrich	U6375
UMP-13C9/15N2	Sigma-Aldrich	651370
Urea	Sigma-Aldrich	U5378
UTP	Sigma-Aldrich	U6625
UTP-13C10/15N5	Rivelatore Sigma-Aldrich	645672
VWD-3100	Thermo Scientific	5074.0005