Identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA-RNA con un RNA lungo non codificante

Sommario

Un protocollo di pull-down dell'RNA di facile utilizzo è progettato per l'identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA/RNA con un lungo RNA non codificante. Il protocollo utilizza lo psoralene come fissativo per reticolare solo le interazioni RNA/RNA e fornisce l'intero interattoma diretto dell'RNA di un lungo RNA non codificante quando accoppiato con il sequenziamento dell'RNA.

Abstract

Il ruolo crescente attribuito oggi agli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) in fisiologia e fisiopatologia rende cruciale caratterizzare il loro interattoma identificando i loro partner molecolari, DNA, proteine e/o RNA. Questi ultimi possono interagire con lncRNA attraverso reti che coinvolgono proteine, ma possono anche essere coinvolti in interazioni dirette RNA/RNA. Pertanto, abbiamo sviluppato una procedura di pull-down dell'RNA facile da usare che ha permesso l'identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA/RNA con un lncRNA utilizzando lo psoralene, una molecola che lega solo le interazioni RNA/RNA. La modellazione bioinformatica della struttura secondaria dell'lncRNA ha permesso la selezione di diverse sonde specifiche di oligonucleotidi DNA antisenso con una forte affinità per le regioni che mostrano una bassa probabilità di appaiamento di basi interne. Poiché le sonde specifiche che sono state progettate miravano a regioni accessibili per tutta la lunghezza dell'lncRNA, le zone di interazione con l'RNA potevano essere delineate nella sequenza dell'lncRNA. Se abbinato a un sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento, questo protocollo può essere utilizzato per l'intero studio dell'interattoma diretto dell'RNA di un lncRNA di interesse.

Introduzione

Gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) sono trascritti non codificanti proteine più lunghi di 200 nucleotidi. Il loro numero è in continuo aumento, più di 58.000 negli esseri umani. Inoltre, il loro ruolo cruciale in fisiologia e fisiopatologia rende essenziale caratterizzare i loro partner molecolari che consentono loro di implementare le loro funzioni regolatorie. In realtà, un approccio per comprendere le funzioni degli lncRNA è l'individuazione dei partner molecolari interagenti di ciascun lncRNA.

I bersagli molecolari degli lncRNA possono essere DNA, proteine o RNA e sono state sviluppate varie tecniche per identificarli. A questo proposito, l'identificazione di proteine che interagiscono con gli lncRNA è l'obiettivo di vari protocolli, tra cui diverse procedure di immunoprecipitazione dell'RNA (RIP) in cui un anticorpo contro la proteina di interesse viene utilizzato per abbattere specificamente gli lncRNA (per una revisione¹). Altre tecniche come la Capture Hybridization Analysis of RNA Targets² (CHART) o l'isolamento della cromatina mediante purificazione dell'RNA³ (ChIRP) consentono di ridurre i lncRNA insieme ai complessi proteici associati. In queste ultime tecniche, l'lncRNA viene utilizzato come esca. CHART e ChIRP sono anche potenti tecniche per identificare mappe genomiche che mostrano l'occupazione^di lncRNA ^2,3. Inoltre, questi metodi di pull-down dell'RNA consentono di identificare i partner RNA di un lncRNA. È stata descritta una procedura che consente la cattura di RNA bersaglio da un lncRNA. Le sonde di oligonucleotidi biotinilati con DNA antisenso sono progettate contro regioni a bassa probabilità di appaiamento di basi interne, come determinato dalla modellazione bioinformatica della struttura secondaria dell'lncRNA⁴. Tuttavia, questa procedura non discrimina se i partner RNA interagiscono indirettamente tramite una rete proteica o direttamente tramite interazioni dirette RNA/RNA con lncRNA. È stato dimostrato che il cross-linking con derivati psoraleni è il metodo di scelta per selezionare le interazioni dirette RNA/RNA mediate dall'appaiamento di basi⁵. I derivati dello psoralene sono infatti in grado di intercalarsi in DNA o RNA a doppio filamento e di legare covalentemente le pirimidine dopo irradiazione con la luce UV (365 nm)⁶. L'accoppiamento del pull-down dell'RNA utilizzando sonde oligonucleotidiche biotinilate con il cross-linking con psoralene è una procedura di facile utilizzo qui proposta per l'identificazione degli RNA impegnati in interazioni dirette RNA/RNA con un lncRNA. Inoltre, questa procedura può consentire di delineare le zone di interazione con l'RNA nella sequenza dell'lncRNA se vengono utilizzate diverse sonde oligonucleotidiche progettate lungo la lunghezza dell'lncRNA.

Protocollo

1. Design della sonda

1. Genera la struttura secondaria dell'lncRNA utilizzando un software server web gratuito specializzato: RNAstructure software⁷ o Vienna RNA web suite⁸. Selezionare le regioni che mostrano una bassa probabilità di appaiamento di basi interne e progettare sonde oligonucleotidiche antisenso lunghe 25 basi per diverse regioni di questo lncRNA.
2. Controlla tutti gli oligonucleotidi progettati con il software accademico gratuito, AmplifX (https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr), per ottenere diverse informazioni su queste sonde e scegliere quelle con i parametri migliori.
   NOTA: Verificare la presenza di parametri ottimali sul software come segue. Percentuale di GC: tra il 40 e il 60%, stabilità 3', complessità, dimero autofinale: "buono". La temperatura di fusione (T_M) non è importante perché l'affinità viene eseguita a temperatura ambiente.
3. Utilizzando uno strumento di ricerca dell'allineamento (ad esempio, Blast, ecc.), assicurarsi che le sonde oligonucleotidiche antisenso selezionate non riconoscano sequenze nucleotidiche in nessun altro RNA espresso nelle cellule scelte.
   1. Progettare una sonda oligonucleotidica di DNA non specifica lunga 25 basi. Assicurarsi che questa sonda non mostri né un'affinità per lncRNA di interesse né per altre sequenze di RNA nel genoma di interesse.
4. Ordina tutte le sonde con una modifica della biotina aggiunta alla loro estremità 3' insieme a un distanziatore di trietilenglicerolo (TEG). Questo distanziatore aumenta la distanza dell'oligo-biotina per evitare l'impedimento sterico.
   NOTA: Per ottenere un risultato ottimale e valutare la specificità dei risultati del pull-down, progettare un minimo di due diverse sonde oligonucleotidiche antisenso nella stessa regione e quindi confrontare sperimentalmente la loro efficienza.

2. Reticolazione

1. Far crescere le cellule (ad esempio, le cellule GH4C1 utilizzate in questo esperimento) fino alla confluenza in piastre di coltura cellulare^da 78,5 cm 2. Dopo aver rimosso il terreno di coltura cellulare, sciacquare lo strato cellulare con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato freddo arricchita con Ca²⁺ e Mg²⁺ (PBS⁺) e aggiungere 3 mL di soluzione di molecola derivata dallo psoralene (4′Aminomethyltrioxsalen cloridrato) preparata in PBS⁺ alla concentrazione di 0,1 mg/mL.
2. Posizionare la piastra di coltura per 30 minuti in un incubatore per colture cellulari di mammiferi a 37 °C con il 5% di CO₂. Dopo 30 minuti, rimuovere il coperchio, posizionare le piastre di coltura sul ghiaccio a 2,5 cm di distanza dai tubi UV da 365 nm in un reticolante UV per 10 minuti. Agitare delicatamente le stoviglie e ripristinare l'esposizione ai raggi UV per un ulteriore periodo di 10 minuti.
3. Scartare il terreno mediante aspirazione, aggiungere 1 mL di PBS⁺ per raccogliere le cellule con un raschietto cellulare e trasferirle in una microprovetta. Centrifugare a 4 °C, 400 x g per 5 min. Rimuovere la maggior quantità possibile di surnatante e immagazzinare i pellet a -80 °C.

3. Lisi cellulare

1. Preparare il tampone proteinasi K aggiungendo 100 mM di NaCl, 10 mM di Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM di EDTA, 0,5% di SDS e 5 μL/mL di inibitore della RNasi.
2. Risospendere i pellet cellulari in questo tampone (circa 200 μl per 1 x 10⁷ cellule). Aggiungere la proteinasi K a una concentrazione finale di 0,1 μg/μl e incubare per 45 minuti a 50 °C. Incubare quindi per 10 minuti a 95 °C, per inattivare la proteinasi K.

4. Sonicazione

1. Distribuire 100 μL di questo lisato (corrispondenti a 5,10⁶ cellule) in due microprovette e aggiungere 200 μL di tampone di ibridazione (700 mM NaCl, 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 1,25% SDS, 5 μL/mL di soluzione inibitrice della RNasi e 15% di formammide) in ciascuna provetta.
2. Posizionare le provette nel bagno d'acqua a 4 °C di un sonicatore e iniziare la sonicazione con 2 serie di impulsi di 30 s (alta intensità) separati da 30 s off.
3. Raccogliere 20 μl di campioni da utilizzare come campioni di controllo in ingresso e conservare a -80 °C.
   NOTA: Questa procedura di sonicazione è stata precedentemente ottimizzata per la linea cellulare GH4C1 al fine di ottenere frammenti di RNA che vanno in 2.000 nucleotidi⁹. Per altre linee cellulari, la procedura di sonicazione deve essere ottimizzata. Quando questa tecnica viene eseguita per studiare i partner RNA di un RNA non codificante molto lungo, la fase di sonicazione si rivela indispensabile per ottenere un adeguato recupero dell'lncRNA. In questo caso, è quindi necessario progettare diverse sonde con un sito di legame situato ogni 4.000 nucleotidi al massimo lungo la lunghezza dell'lncRNA. Per recuperare l'intera lunghezza dell'lncRNA, utilizzare un pool di diverse sonde specifiche. Tuttavia, se lo scopo è quello di identificare le regioni dell'lncRNA coinvolte nel legame RNA-RNA, le sonde specifiche devono essere utilizzate separatamente. Inoltre, se si studiano i partner RNA di un lncRNA più piccolo, è necessario eseguire esperimenti per determinare se è necessaria la fase di sonicazione.

5. Pull-down dell'RNA

1. Giorno 1 - Fase di ibridazione
   1. Aggiungere 150 pmol (1,5 μL di una soluzione madre da 100 μM) di una sonda biotinilata specifica o non specifica a ciascuna provetta del campione. Incubare per 4 ore sotto agitazione su un rotatore di provette a temperatura ambiente (RT) (circa 30 giri/min).
   2. Prendere il volume necessario di microsfere magnetiche (ad esempio, 40 μL di perle per 150 pmol di reazione di ibridazione delle sonde). Utilizzare il supporto magnetico per separare le perline dai supporti commerciali. Scartare il surnatante e lavare le perle con 900 μl di tampone di ibridazione. Una volta fatto, risospendere le perle magnetiche nello stesso volume del tampone di ibridazione.
   3. Aggiungere microsfere magnetiche in ciascuna provetta del campione (40 μL di perle per 150 pmol di reazione di ibridazione delle sonde). Incubare per una notte sotto agitazione su un rotatore di provette a RT (circa 30 giri/min).
2. Giorno 2 - Fase di isolamento dell'RNA
   1. Separare le perle dal lisato cellulare utilizzando il supporto magnetico (2-3 min). Scartare il surnatante e lavare le perle con 900 μl di tampone di lavaggio (0,5% SDS, 2x SSC) con 5 minuti di incubazione sotto agitazione sul rotatore a RT. Ripetere questo lavaggio 5 volte.
   2. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio, aggiungere 95 μL di tampone proteinasi K sulle perle. Scongelare i campioni in ingresso e aggiungere 75 μL di tampone proteinasi K. Aggiungere 5 μl di proteinasi K a una concentrazione finale di 1 μg/μl in tutte le provette (campioni e campioni in entrata). Incubare a 45 °C per 45 minuti e poi a 95 °C per 10 minuti.
   3. Conservare il campione sul ghiaccio. Utilizzare un supporto magnetico per separare le perle dagli RNA presenti nel surnatante. Purifica gli RNA con un kit di purificazione dell'RNA che include una fase di digestione della DNasi. Conservare gli RNA purificati a -80 °C.
      NOTA: L'RNA eluito può essere sottoposto a RT-qPCR o sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento per rilevare i trascritti arricchiti. Per l'analisi del sequenziamento dell'RNA, le letture possono quindi essere allineate al genoma di interesse utilizzando software gratuiti, come STAR¹⁰ o HISAT2¹¹, e la quantificazione può essere eseguita utilizzando FeatureCounts¹² o HTSeq count¹³.

Risultati

La delucidazione dell'interattoma lncRNA, cioè dei componenti cellulari che interagiscono con lncRNA, proteine, RNA e DNA, è di fondamentale importanza per comprendere le funzioni degli lncRNA. Sono state sviluppate varie tecniche per caratterizzare l'interattoma lncRNA, tra cui RIP, CHART, ChIRP e RNA pull-down. Sebbene quest'ultimo abbia dimostrato di essere potente nell'identificare i bersagli RNA degli lncRNA, queste procedure non indicano se i partner RNA interagiscono indirettamente tramite una rete proteica o dire...

Discussione

Numerosi lncRNA svolgono la loro funzione attraverso l'appaiamento di basi complementari agli mRNA. È quindi importante sviluppare procedure che permettano di caratterizzare l'interattoma diretto dell'RNA degli lncRNA. Pertanto, è stata sviluppata una procedura che combina l'uso dello psoralene come reagente di reticolazione con la tecnica di pull-down dell'RNA.

Nel protocollo di pull-down dell'RNA descritto, la progettazione e la selezione delle sonde oligonu...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4′-Aminomethyltrioxsalen cloridrato	Sigma	A4330	Reagente reticolante
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Sonde biotinilate	IDT		Sonde oligonucleotidiche
CFX96 Sistema in tempo reale	BioRad	4351107	apparato qPCR
DNA Olignucleotidi	IDT		Primer per qPCR
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Perle magnetiche di streptavidina
Formamide	Thermo-Fisher	15515-026	Formamide
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725124	reagente qPCR
Proteinasi K	Sigma	P2308	Proteinasi K
RNA a DNA	Thermo-Fisher	4387405	Kit di trascrizione inversa
Kit di purificazione dell'RNA XS Kit di	purificazione dell'RNA	Macherey-Nagel	740902
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	Inibitore dell'RNAsi
Rotatore del tubo	Stuart	SB2	Rotatore del tubo Eppendorf
UV Stratalinker 1800	Stratagene	#400072	reticolante UV