Co-coltura di microglia e neuroni corticali differenziati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Sommario

Questo protocollo descrive una metodologia per differenziare le microglia dalle iPSC umane e mantenerle in co-coltura con neuroni corticali derivati da iPSC al fine di studiare le basi meccanicistiche delle interazioni neuroimmunitarie utilizzando neuroni umani e microglia.

Abstract

La capacità di generare microglia da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) fornisce nuovi strumenti e strade per studiare il ruolo della microglia nella salute e nella malattia. Inoltre, le microglia derivate da iPSC possono essere mantenute in co-coltura con neuroni corticali derivati da iPSC, che consentono di studiare le interazioni microglia-neurone che si ipotizza siano disregolate in una serie di disturbi neuropsichiatrici. Le iPSC umane sono state differenziate per generare microglia utilizzando una versione adattata di un protocollo sviluppato dal gruppo di Fossati, e le microglia derivate da iPSC sono state convalidate con analisi dei marcatori e PCR in tempo reale. Le microglia umane generate utilizzando questo protocollo erano positive per i marcatori CD11C, IBA1, P2RY12 e TMEM119 ed esprimevano i geni correlati alle microglia AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 e TMEM119. I neuroni corticali umani derivati da iPSC che erano stati differenziati per 30 giorni sono stati piastrati con microglia e mantenuti in co-coltura fino al giorno 60, quando sono stati intrapresi gli esperimenti. La densità delle spine dendritiche nei neuroni corticali in co-coltura con microglia è stata quantificata in condizioni basali e in presenza di citochine pro-infiammatorie. Al fine di esaminare come le microglia modulano la funzione neuronale, sono stati intrapresi esperimenti di imaging del calcio dei neuroni corticali utilizzando l'indicatore di calcio Fluo-4 AM. L'attività del calcio vivo dei neuroni corticali è stata ottenuta utilizzando un microscopio confocale e l'intensità della fluorescenza è stata quantificata utilizzando ImageJ. Questo rapporto descrive come la co-coltura di microglia e neuroni corticali derivati da iPSC umane fornisca nuovi approcci per interrogare gli effetti della microglia sui neuroni corticali.

Introduzione

Nel cervello umano, le microglia sono le principali cellule immunitarie innate¹. Lo sviluppo cerebrale è regolato dalla microglia attraverso due vie: il rilascio di fattori diffusibili e la fagocitosi¹. I fattori diffusibili derivati dalla microglia aiutano a sostenere la mielinizzazione, la neurogenesi, la formazione sinaptica, la maturazione, la morte cellulare e la sopravvivenza cellulare¹. Le microglia fagocitano anche vari elementi nelle sinapsi cerebrali, negli assoni e nelle cellule vive e morte 2,3,4,5,6,7,8. I recettori della microglia riconoscono tag come calreticulina, ATP e acido sialico e regolano la fagocitosi cellulare ^9,10. Nell'ippocampo, le microglia mantengono l'omeostasi della neurogenesi attraverso il loro ruolo fagocitario¹¹.

È stato dimostrato che la fagocitosi sinaptica nel nucleo genicolato dorsolaterale (dLGN) del cervello del roditore è regolata dalla microglia¹. Nei roditori, è stato dimostrato che ci sono due periodi durante lo sviluppo in cui si osserva un'intensa fagocitosi sinaptica microgliale. Il primo periodo si verifica durante la formazione iniziale delle sinapsi e il secondo periodo si verifica quando le connessioni vengono messe a punto e potate¹². Altri fattori coinvolti nella potatura sinaptica sono le proteine infiammatorie e il complesso maggiore di istocompatibilità di Classe I (MHC1, H2-K^b e D^b)^13,14. E' stato suggerito che il C1q (componente del complemento 1q) sulla microglia colocalizzi con MHC1, innescando la potatura sinaptica¹⁵. Inoltre, studi sui topi dimostrano che l'interleuchina-33 (IL-33) secreta dagli astrociti regola l'omeostasi delle sinapsi nel talamo e nel midollo spinale attraverso i suoi effetti sulla microglia, anche se questo deve ancora essere studiato nell'uomo¹³. Le microglia secernono una varietà di citochine che aiutano a mantenere la salute neuronale, come il fattore di necrosi tumorale α (TNFα), IL-1β, IL-6, IL-10 e l'interferone-γ (IFN-γ) e queste citochine possono modulare la formazione della spina dendritica e delle sinapsi 16,17,18. Ci sono lacune significative nella nostra conoscenza delle interazioni neurone-microglia durante lo sviluppo del cervello umano. La maggior parte delle nostre conoscenze proviene da studi su modelli di roditori, mentre c'è una scarsità di informazioni sugli aspetti temporali e meccanicistici della potatura sinaptica nella corteccia umana. Le microglia supportano la sopravvivenza neuronale nella neocorteccia e anche altri tipi di cellule contribuiscono¹. Non è chiaro in che modo le microglia contribuiscano a questa conservazione e quale sia l'interazione tra le microglia e gli altri tipi di cellule. Le microglia rilasciano diverse citochine che influenzano lo sviluppo neuronale e sinaptico, ma le basi meccanicistiche dei loro effetti di queste citochine nei neuroni sono in gran parte sconosciute^19,20. Al fine di sviluppare una comprensione più completa della funzione della microglia nel cervello umano, è fondamentale esplorare le sue interazioni con i diversi tipi di cellule presenti nel cervello umano. Questo rapporto descrive un metodo per la co-coltura di neuroni e microglia umani derivati da iPSC generati dallo stesso individuo. L'adozione di questa metodologia consentirà indagini ben definite per interrogare la natura delle interazioni microglia-neuroni e per sviluppare robusti modelli cellulari in vitro per studiare la disfunzione neuroimmune nel contesto di diversi disturbi dello sviluppo neurologico e neuropsichiatrico.

Il ruolo della microglia nella schizofrenia
La potatura sinaptica è un importante processo di sviluppo neurologico che avviene nel cervello dell'adolescente ^21,22. Molteplici linee di evidenza suggeriscono che la potatura sinaptica durante questo periodo critico è anormale nella schizofrenia (SCZ)23,24,25,26. La SCZ è un disturbo psichiatrico cronico e debilitante caratterizzato da allucinazioni, deliri, processi di pensiero disordinati e deficit cognitivi^23,24. Le microglia, i macrofagi residenti nel cervello, svolgono un ruolo centrale nella potatura sinaptica ^25,26. Gli studi post-mortem e di tomografia a emissione di positroni (PET) mostrano evidenza di attività microgliale disfunzionale in SCZ 25,26,27,28,29,30,31,32. I cervelli SCZ post-mortem mostrano differenze ben replicate ma sottili nel cervello: i neuroni piramidali nello strato corticale III mostrano una diminuzione della densità della spina dendritica e un minor numero di sinapsi 33,34,35. La potatura sinaptica è un processo mediante il quale le connessioni sinaptiche eccitatorie superflue vengono eliminate dalla microglia durante l'adolescenza, quando i pazienti con SCZ di solito hanno la loro prima rottura psicotica^22,36. Studi post-mortem mostrano un'associazione tra SCZ e attivazione microgliale, con un aumento della densità della microglia nei cervelli SCZ, nonché con un aumento dell'espressione dei geni proinfiammatori²⁷. Inoltre, gli studi PET su cervelli umani che utilizzano radioligandi per l'attivazione microgliale mostrano un aumento dei livelli di microglia attivata nella corteccia 25,26,27,28. Recenti studi di associazione genome-wide (GWAS) mostrano che l'associazione genetica più forte per SCZ risiede nel locus del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) e questa associazione deriva dagli alleli dei geni del componente del complemento 4 (C4) che sono coinvolti nella mediazione della potatura sinaptica postnatale nei roditori³⁷. Questa associazione ha fornito ulteriore supporto all'ipotesi che la potatura aberrante da parte della microglia possa provocare la diminuzione della densità della spina dendritica osservata nei cervelli post-mortem SCZ. Le indagini sul coinvolgimento della microglia nella potatura sinaptica nella SCZ sono state finora limitate a studi indiretti con imaging PET o inferenze da indagini su cervelli post mortem.

Generazione di microglia umane in laboratorio
Le microglia primarie di topo in coltura sono state frequentemente utilizzate nello studio delle microglia, sebbene ci siano diverse indicazioni che le microglia dei roditori potrebbero non essere rappresentative dell'anatomia della microglia umana e dell'espressione genica (Tabella 1)³⁸. Diversi studi hanno anche differenziato le microglia direttamente dai monociti del sangue attraverso la transdifferenziazione 39,40,41,42. Le cellule simili alle microglia derivate dai monociti del sangue mostrano importanti differenze rispetto alle microglia umane nelle risposte pro-infiammatorie del profilo di espressione genica e proteica e sembrano essere più simili ai macrofagi nella loro biologia⁴³. I recenti progressi metodologici consentono ora la generazione di microglia da iPSC umane, che offrono l'opportunità di studiare microglia vive che assomigliano più accuratamente alla biologia delle microglia presenti nel cervello umano (Tabella 2). È stato dimostrato che queste cellule microgliali derivate da iPSC ricapitolano il fenotipo, i profili di espressione genica e le proprietà funzionali delle microglia umane primarie 44,45,46,47,48. Questo articolo fornisce un metodo per la co-coltura di neuroni e microglia umani derivati da iPSC generati dallo stesso individuo al fine di sviluppare modelli personalizzati in vitro di interazioni neurone-microglia. Per questo modello di co-coltura in vitro, un protocollo di differenziazione microgliale del gruppo Fossati è stato adattato (Tabella 3) e combinato con una versione adattata di un protocollo di generazione neuronale corticale del gruppo Livesey (Tabella 4)^49,50.

Protocollo

Le iPSC umane utilizzate in questo studio sono state riprogrammate da fibroblasti che erano stati ottenuti attraverso il consenso informato da soggetti di controllo sani, con l'approvazione del comitato di revisione istituzionale (IRB). La riprogrammazione e la caratterizzazione delle iPSC utilizzate in questo studio (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292) sono state descritte in un precedente studio⁵¹.

1. Manutenzione delle iPSC

1. Preparare una diluizione 1:50 della matrice di membrana basale a fattore di crescita ridotto priva di LDEV in DMEM/F12 senza rosso fenolo e rivestire una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di soluzione diluita per almeno 2 ore a 37 °C prima di scongelare le cellule.
2. Scongelare le scorte di iPSC crioconservate in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 minuti. Aggiungere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 5 mL di DMEM/F12. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti.
3. Rimuovere la soluzione di rivestimento dalla piastra della matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto pre-rivestita priva di LDEV e aggiungere 1 mL di terreno di coltura staminale (SCM) con 10 μM di inibitore della roccia (Y-27632).
4. Risospendere il pellet di cella in SCM con 10 μM di Y-27632 e aggiungerlo alla piastra pre-rivestita per un volume finale di 2 mL di SCM più Y-27632. Mantenere le colture cellulari di iPSC in questo terreno per 24 ore in un incubatore a 37 °C.
5. Sostituire il terreno con 2 ml di SCM fresco senza Y-27632 24 ore dopo lo scongelamento.
6. Dopo che le iPSC hanno raggiunto l'80-90% di confluenza, farle passare su fiasche da 75 mL rivestite con matrice di membrana basale a fattore di crescita ridotto priva di LDEV.
   1. Passaggio delle celle risciacquando prima le cellule con HBSS e rimuovendole dopo aver lasciato riposare per 30 s. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare non enzimatico e incubare per 4 minuti a 37 °C. Preparare la piastra con SCM contenente 10 μM di Y-27632.
   2. Aspirare il reagente di dissociazione cellulare non enzimatico e aggiungere 1 mL di SCM + 10 μM di Y-27632 a ciascun pozzetto. Raschiare delicatamente il pozzetto con un sollevatore di cellule e ottenere le cellule con una pipetta da 1000 μl.
   3. Depositare le cellule su un pallone da 75 mm rivestito con matrice di membrana basale a fattore di crescita ridotto privo di LDEV in un volume totale di 8 mL di SCM + Y-27632.

2. Differenziazione della microglia

NOTA: Uno schema che delinea il protocollo di differenziazione della microglia è illustrato nella Figura 1A. I terreni sono stati riscaldati a temperatura ambiente prima dell'uso.

1. Giorno 0: Eseguire un cambio completo del terreno con il terreno SCM integrato con 80 ng/mL di BMP-4. Eseguire cambi di fluido giornalieri con lo stesso mezzo durante i giorni 1-3, senza alcun lavaggio tra i cambi di fluido.
2. Giorno 4: Preparare il terreno del giorno 4-5: Terreno ematopoietico (HM), integrato con 25 ng/mL di FGF, 100 ng/mL di SCF e 80 ng/mL di VEGF. Rimuovere il terreno e sostituirlo con un terreno del giorno 4-5 contenente 5 μM di Y-27632.
   NOTA: A questo punto le cellule iniziano a fluttuare: circa la metà delle cellule galleggia e l'altra metà è aderente.
3. Giorno 6: Preparare il terreno del giorno 6-13: HM integrato con 50 ng/mL di SCF, 50 ng/mL di IL-3, 5 ng/mL di TPO, 50 ng/mL di m-CSF e 50 ng/mL di Flt3-L. Raccogliere il surnatante, aggiungerlo a una provetta conica da 15 mL e centrifugare per 8 minuti a 300 x g. Risospendere il pellet in un matraccio con 8 mL di terreno del giorno 6-13 integrato con 5 μM di Y-27632.
4. Giorno 10: Aggiungere 8 ml di terreno del giorno 6-13 sopra il terreno esistente.
5. Giorno 14: Preparazione Giorno 14+ medio: HM integrato con 50 ng/mL m-CSF, 50 ng/mL Flt3-L, 50 ng/mL gm-CSF. Raccogliere il surnatante, aggiungerlo in una provetta conica da 50 ml e centrifugare per 8 minuti a 300 x g. Risospendere il pellet in 8 mL di terreno del giorno 14+ contenente 5 μM di Y-27632 e continuare a coltivare in questo terreno.
6. Giorno 18: Aggiungere 8 ml di terreno Day14+.
7. Giorno 22: Aggiungere 8 ml di terreno fresco Day14+ senza rimuovere il terreno esistente.
8. Giorno 25: Spostare le cellule al passaggio 2.9 o continuare a mantenere il terreno nel giorno 14+ fino al giorno 50 di differenziazione.
9. Dopo il giorno 25, raccogliere il surnatante in una provetta conica da 50 ml e centrifugare per 8 minuti a 300 x g.
   1. Preparare il terreno aderente: RPMI integrato con l'1% di 200 mM di L-alanil-L-glutammina dipeptide in soluzione di NaCl allo 0,85%, 25 ng/mL GM-SCF e 100 ng/mL di IL-34.
   2. Risospendere il pellet nel mezzo aderente contenente 5 μM di Y-27632.
   3. Piastre con una densità di 50.000 cellule per cm² su piastre a 24 pozzetti per diversi esperimenti: piastre rivestite con matrice basale a membrana basale con fattore di crescita ridotto prive di LDEV per monocolture microgliali, 10 μg/mL di poli-L-ornitina e 10 μg/mL di piastre di imaging in vetro rivestito di laminina per esperimenti di imaging.
   4. Diluire la poli-L-ornitina e la laminina in DPBS e aggiungere 250 μL/pozzetto per una piastra di imaging a 24 pozzetti.
      NOTA: Le cellule in coltura sono ora di natura aderente (Figura 1C).
10. Mantenere le cellule in coltura per almeno 14 giorni, con cambi di terreno bisettimanali. Dopo il 14° giorno dopo l'aderenza, le cellule hanno raggiunto la maturazione e possono essere utilizzate per esperimenti.

3. Differenziazione dei neuroni corticali

NOTA: Uno schema che delinea il protocollo di differenziazione dei neuroni corticali è illustrato nella Figura 1G.

1. Giorno 0:
   1. Una volta che le iPSC sono confluenti su piastre rivestite con matrice di membrana basale a fattore di crescita ridotto prive di LDEV, passare da SCM a una miscela 50/50 di terreno N2/B27 integrato con 10 μM di SB431542, 1 μM di dorsomorfina, 100 nM LDN193189.
      NOTA: Il terreno N2 è costituito da terreno basale integrato con l'1% di integratore di N-2, l'1% di 200 mM di L-alanil-L-glutammina dipeptide in soluzione di NaCl allo 0,85%, l'1% di pen/streptococco. Il terreno B27 è costituito da DMEM/F12 integrato con il 2% di integratore di B-27, l'1% di L-alanil-L-glutammina dipeptide all'1% da 200 mM in soluzione di NaCl allo 0,85%, penna/streptococco all'1%.
   2. Cambia il mezzo con gli integratori di cui sopra aggiunti quotidianamente per 7 giorni.
2. Giorno 7:
   1. Piastre di prerivestimento in matrice di membrana basale a fattore di crescita ridotto esente da LDEV per almeno 2 ore.
   2. Passaggio celle 1:1 su piastre pre-rivestite. Sciacquare le celle con 1 mL/pozzetto di HBSS e rimuoverle dopo averlo lasciato riposare per 30 s. Aggiungere 1 mL/pozzetto di terreno di distacco cellulare (ad es. Accutase) e incubare per 4-5 minuti a 37 °C. Durante l'incubazione, preparare provette coniche da 15 mL con 5 mL di DMEM.
   3. Pipettare delicatamente l'agente di dissociazione enzimatica per rimuovere le cellule dalla piastra con un pipettatore P1000. Raccogliere l'agente di dissociazione enzimatica e la miscela cellulare nella provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di DMEM.
   4. Centrifugare le provette per 5 minuti a 300 x g. Risospendere il pellet in 1 mL di terreno N2/B27 contenente 10 μM di Y-27632. Continuare le poppate quotidiane con il terreno N2/B27 senza integratori.
3. Giorno 12: Passaggio delle celle 1:1 utilizzando i metodi descritti in 3.2.2. Continuare le poppate quotidiane con il terreno N2/B27.
4. Giorno 15/16: Passaggio delle celle 1:2 utilizzando i metodi descritti in 3.2.2. Continuare le poppate quotidiane con il terreno N2/B27.
5. Giorno 18/19: Passaggio celle 1:3 utilizzando i metodi descritti in 3.2.2. Continuare le poppate quotidiane con il terreno N2/B27 fino al giorno 25.
6. Giorno 25: Alimentare le celle con terreno N2/B27 integrato con 10 μM di DAPT.
7. Giorno 28: Alimentare le celle con terreno N2/B27 fresco e non trattato.
8. Giorno 30: Passaggio delle cellule utilizzando i metodi descritti al punto 3.2 sulle piastre di coltura della microglia e mantenimento nel terreno BrainPhys integrato con l'integratore di B-27 all'1%.

4. Co-colture microglia/neuroni

1. Piastra Giorno 30 neuroni corticali su colture microgliali a una densità di 50.000 cellule per cm². Integrare il terreno con laminina 1 μg/mL per migliorare l'aderenza cellulare.
2. Mantenere le colture in un mix di terreno aderente al 50% e terreno Brainohys al 50% integrato con un integratore di B-27 all'1%. Eseguire un cambio medio-medio due volte alla settimana fino alla sperimentazione.
3. Eseguire esperimenti dopo che i neuroni hanno raggiunto il giorno 60.

5. Trattamento con interferone-γ

1. Preparare un terreno fresco integrato con 100 ng/mL di IFN-γ. Aggiungere il terreno e lasciarlo incubare per 24 ore. Rimuovere il mezzo e procedere alla sperimentazione.

6. Immunocitochimica

1. Fissare le cellule nella piastra di coltura con 100 μl di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 20 minuti.
2. Sciacquare le cellule in 1 mL di PBS tre volte per 5 minuti ciascuna.
3. Aggiungere 1 mL di PBST (PBS + 0,1% Triton X) per 10 min.
4. Aggiungere tampone bloccante: 1 ml di PBS più il 5% di siero di capra per 1 ora.
5. Aggiungere l'anticorpo primario diluito in 100 μL di PBS + 1% di siero di capra - per una notte a 4 °C. Ottimizzare di conseguenza tutti gli anticorpi primari.
6. Sciacquare le cellule in 1 mL di PBS tre volte per 5 minuti ciascuna.
7. Aggiungere l'anticorpo secondario, diluito in 100 μL di PBS più l'1% di siero di capra - per 1 ora a temperatura ambiente.

7. Analisi della colonna vertebrale

1. Ottenete immagini su un microscopio confocale con un ingrandimento di 60x.
2. Utilizzare la funzione ImageJ NeuronJ⁵² per analizzare le immagini.
3. Ottieni misurazioni per la lunghezza dei neuriti, la lunghezza della colonna vertebrale e il conteggio della colonna vertebrale tramite NeuronJ.

8. Imaging del calcio

1. Preparare il terreno fresco con 3 μM di colorante Fluo-4AM. Incubare le co-colture in questo terreno per 30 minuti a 37 °C. Quindi sciacquare le cellule con PBS, aggiungere una soluzione di imaging di cellule vive alle cellule e procedere all'imaging.
2. Utilizzando un microscopio confocale attrezzato per l'imaging di cellule vive, è possibile ottenere immagini time-lapse a 40x per 2 minuti. L'attività può essere registrata al basale, con esposizione a 15 mM di glutammato, o in caso di depolarizzazione con 5 mM di cloruro di potassio.
3. Utilizzando ImageJ, è possibile misurare l'intensità della fluorescenza nel tempo per i singoli corpi cellulari. Utilizzando lo strumento di selezione, selezionare la singola regione di interesse (ROI) che circonda ciascun corpo cellulare. Apri ROI Manager e premi Aggiungi per selezionare. Continua ad aggiungere nuove selezioni al gestore ROI.
4. Utilizzare lo strumento Imposta misure per misurare l'area grigia media. Quando il numero di corpi cellulari desiderati è stato aggiunto al gestore ROI, selezionarli tutti e quindi utilizzare lo strumento Multi-Misura . In questo modo verrà fornita una lettura dell'area grigia media per ciascuno nel corso del tempo del file video. I dati esportati forniranno l'intensità media di fluorescenza per la regione di interesse per ogni fotogramma.
5. Determinare il rapporto di intensità della fluorescenza, F/F₀, dove F è l'intensità della fluorescenza in un dato momento e F₀ è l'intensità della fluorescenza iniziale. F/F₀ può essere rappresentato graficamente nel tempo per esaminare l'attività spontanea nei neuroni o esaminato alla massima intensità fluorescente nell'impostazione della stimolazione.

Risultati

Convalida del protocollo
Le microglia derivate da iPSC sono state generate da sette linee di iPSC in tre diversi cicli di differenziazione. Sono state utilizzate le linee iPSC di controllo ML27, ML56, ML292 e ML364 e le linee iPSC per schizofrenia ML40, ML141 e ML250. La caratterizzazione di queste linee iPSC è stata descritta in precedenza⁵¹. Queste microglia derivate da iPSC sono state convalidate utilizzando ICC e qPCR. Le microglia generate dal protocollo adattato mostravan...

Discussione

Lo sviluppo di metodi di differenziazione lungo diverse traiettorie per le cellule staminali pluripotenti ha aperto molte strade per lo studio della funzione cerebrale e dei processi patologici 53,54,55. Gli studi iniziali si erano concentrati sullo sviluppo di specifici tipi di cellule neuronali che si ipotizzava fossero importanti in specifici disturbi cerebrali^56,57

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
B-27 integratore	Gibco	17504044
b-FGF	Peprotech	100-18B
BMP-4	Peprotech	120-05ET
Brainphys	StemCell Technologies	5790
CD11C anticorpo	Biolegend	337207	Diluizione 1:200
Piastre per colture cellulari a fondo piatto Costar	Corning	07-200-83
Anticorpo Ctip2	Abcam	ab18465
CUTL1 Anticorpo monoclonale	Abnova	H00001523-M01
DMEM/F-12, senza rosso fenolo	Gibco	21041025
dorsomorfina	Sigma-Aldrich	P5499
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6421
EasYFlask Cell Culture Flass	Nunc	156499
Fisherbrand Cell Lifters	Fisher Scientific	08-100-240
Flt3-Ligand	Peprotech	300-19
Fluo4-AM	Life Technologies	F-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 ML	ThermoFisher Scientific	A1413201
Glutamax	ThermoFisher Scientific 35050061
GM-CSF	Peprotech	300-03
Capra Anti Pollo- IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Diluizione 1:1000
Capra Anti topo - IgG H& L (Alexa Fluor 568)	Invitrogen	A-11004	Diluizione 1:1000
Capra Anti Ratto - IgG H& L (Alexa Fluor 405)	Abcam	ab175670	Diluizione 1:1000
Capra Anti-porcellino d'India IgG H& L (Alexa Fluor 405)	Abcam	ab175678	Diluizione 1:1000
Siero di capra	Sigma-Aldrich	G9023
HBSS	Invitrogen	14170120
Anticorpo IBA1	Abcam	ab5076	Diluizione 1:500
IL-34	Peprotech	200-34
INF-y	Peprotech	300-02
KiCqStart Primer verdi SYBR	Sigma-Aldrich	KSPQ12012
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0599
Soluzione di imaging di cellule vive	Anticorpo Invitrogen	A14291DJ
MAP2	Synaptic Systems	188 004
M-CSF	Peprotech	300-25
Integratore N-2	Gibco	17502001
Medium neurobasale	Life Technologies	21103049
NutriStem hPSC XF Medium	Biological Industries	01-0005
P2RY12 anticorpo	Biolegend	848002
Paraformaldeide 16%	Fisher Scientific	50-980-488
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140122
Poli-L-Orthinine	Sigma-Aldrich	P3655
SATB2 anticorpo	Abcam	ab51502
SB431542	Sigma-Aldrich	S4317
SCF	Stemcell Technologies	78062
SensoPlate Piastra con fondo in vetro a 24 pozzetti	Greiner-Bio	662892
StemPro-34 SFM (1X)	Gibco	10639011
TMEM119 anticorpo	Abcam	ab185333	Diluizione 1:1000
TPO	Peprotech	300-18
Triton-X	Sigma-Aldrich	9002-93-1
VEGF	Peprotech	100-20
Versene	ThermoFisher Scientific	15040066
Y-27632 dicloridrato (inibitore ROCK)	Tocris	1254