Articolo metodologico

Rilevamento di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 utilizzando l'imaging fluorescente ad alto rendimento dell'infezione da pseudovirus

DOI:

10.3791/62486

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5 giugno 2021

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1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

In questo articolo

Sommario

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Il protocollo qui descritto delinea un metodo rapido ed efficace per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro la proteina spike SARS-CoV-2 valutando la capacità dei campioni di siero convalescente di inibire l'infezione da un virus della stomatite vescicolare potenziato con proteina fluorescente verde pseudotipizzato con glicoproteina spike.

Abstract

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Mentre la pandemia di COVID-19 causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continua ad evolversi, è diventato evidente che la presenza di anticorpi neutralizzanti contro il virus può fornire protezione contro future infezioni. Pertanto, poiché la creazione e la traduzione di vaccini COVID-19 efficaci continua a una velocità senza precedenti, lo sviluppo di metodi rapidi ed efficaci per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro SARS-CoV-2 diventerà sempre più importante per determinare la protezione a lungo termine contro l'infezione sia per gli individui precedentemente infetti che per quelli immunizzati. Questo documento descrive un protocollo ad alto rendimento che utilizza il virus della stomatite vescicolare (VSV) pseudotipizzato con la proteina spike SARS-CoV-2 per misurare la presenza di anticorpi neutralizzanti nel siero convalescente di pazienti che sono recentemente guariti da COVID-19. L'uso di un virus pseudotipizzato replicante elimina la necessità di una struttura di livello di contenimento 3 necessaria per la gestione di SARS-CoV-2, rendendo questo protocollo accessibile praticamente a qualsiasi laboratorio di livello di contenimento 2. L'uso di un formato a 96 pozzedi consente di eseguire molti campioni contemporaneamente con un breve tempo di consegna di 24 ore.

Introduzione

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A dicembre 2019 è stato identificato un nuovo coronavirus, che ora conosciamo come SARS-CoV-2, l'agente eziologico della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 è un betacoronavirus appartenente alla famiglia Coronaviridae. Questi virus avvolti comprendono un ampio genoma di RNA a senso positivo e sono responsabili di infezioni respiratorie e intestinali sia nell'uomo che negli animali2. A partire da maggio 2021 ci sono stati più di 157 milioni di casi segnalati di COVID-19 a livello globale e oltre 3,2 milioni di decessi3. Lo sviluppo di un vaccino efficace è diventato l'obiettivo primario dei ricercatori di tutto il mondo con almeno 77 vaccini preclinici in fase di studio e 90 attualmente in fase di sperimentazione clinica4.

I coronavirus codificano quattro proteine strutturali tra cui la proteina spike (S), il nucleocapside (N), la proteina dell'involucro (E) e la proteina di membrana (M). L'ingresso di SARS-CoV-2 richiede l'interazione del dominio di legame del recettore (RBD) di S con il recettore dell'ospite, l'enzima umano di conversione dell'angiotensina 2 (hACE2) e la successiva fusione di membrana a seguito della scissione proteolitica da parte della proteasi della serina cellulare dell'ospite, proteasi transmembrana serina2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . L'immunodominanza umorale della proteina S di SARS-CoV è stata precedentemente riportata ed è stata ora dimostrata anche per SARS-CoV-211,12,13. Infatti, le risposte anticorpali neutralizzanti contro S sono state rilevate nel siero convalescente da pazienti con SARS-CoV 24 mesi dopo l'infezione14, evidenziando il loro ruolo critico nella risposta immunitaria a lungo termine. La proteina S è stata identificata come un bersaglio vaccinale promettente ed è quindi diventata un componente chiave della maggior parte dei vaccini in fase di sviluppo15,16.

Mentre la rapida rilevazione di anticorpi neutralizzanti è un aspetto critico dello sviluppo del vaccino, può anche far luce sul tasso di infezione e sorveglianza siero-epidemiologica nelle aree colpite17. Un VSV competente per la replicazione pseudotipizzato con la glicoproteina SARS-CoV-2 S, al posto della glicoproteina VSV wild-type, per studiare l'infezione da SARS-CoV-2 in contesti di livello di biosicurezza 2 è stato gentilmente donato da Whelan e colleghi18. Il vsV expressing spike (VSV-S) sarà utilizzato per determinare la risposta anticorpale neutralizzante contro la proteina spike SARS-CoV-2. Poiché il VSV-S utilizzato qui esprime anche una proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), i focolai di eGFP possono essere rilevati entro 24 ore per quantificare l'infezione, mentre la formazione della placca può richiedere da 48 a 72 ore. Riassunto qui è un protocollo semplice ed efficace per determinare la capacità del siero del paziente convalescente di neutralizzare l'infezione da VSV-S-eGFP. Questo metodo può anche essere facilmente adattato per interrogare altre potenziali terapie che mirano a interrompere l'interazione ospite-virale della proteina SARS-CoV-2 S.

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Protocollo

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1. Cellule di placcatura (Giorno 1) per la produzione e la quantificazione dello pseudovirus SARS-CoV-2

  1. Preparazione per la coltura tissutale
    1. Warm 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (opzionale); e 0,25% di acido tetraacetico tripsina-etilendiammina (EDTA) a 37 °C a bagnomaria per circa 15 minuti.
    2. Disinfettare una cappa di coltura di tessuto con il 70% di etanolo e posizionare piatti di coltura tissutale, pipette Pasteur e pipette sierologiche nella cappa di coltura del tessuto, se necessario. Rimuovere PBS, DMEM e tripsina dal bagno d'acqua e disinfettare con etanolo al 70% prima di inserirli nella cappa di coltura del tessuto.
  2. Placcatura e manutenzione delle celle
    1. Coltiva cellule Vero E6 in DMEM (contenente il 10% di FBS) in palloni di coltura tissutale T75 o piatti di coltura tissutale da 15 cm in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2. Passare le cellule secondo necessità quando le cellule sono confluenti all'80-90%.
    2. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml di 1x PBS a ciascun piatto e dondolando delicatamente 4-5 volte; aspirare il PBS. Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA a ciascun piatto, scuotere la piastra per garantire che l'intera superficie sia coperta. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 per circa 5 minuti, o fino a quando le cellule non si sono staccate.
    3. Aggiungere 7 ml di DMEM (contenente il 10% di FBS) per disattivare la tripsina e risospentare le cellule tubando su e giù più volte. Abbassare le cellule per rimuovere la tripsina usando una centrifuga da banco a 500 × g per 5 minuti, aspirare il mezzo senza disturbare il pellet cellulare e risusciere le cellule in 10 ml di DMEM (contenente il 10% di FBS). Se le cellule sono necessarie per esperimenti futuri, mettere 1 mL in un nuovo piatto contenente 15 mL di DMEM fresco (contenente il 10% di FBS).
    4. Contare le cellule utilizzando un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro e aggiungere circa 1 × 107 cellule a ciascuna piastra da 15 cm e incubare a 37 °C con il 5% di CO2 fino a quando non sono confluenti al 100% (1-2 giorni).

2. Preparazione dello pseudovirus VSV-S-EGFP

  1. Infezione
    1. Infettare le cellule a molteplicità di infezione (MOI) 0,01 con il virus di riserva VSV-S-eGFP in 12 ml di DMEM senza siero per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2, occasionalmente facendo oscillare le piastre. Sostituire l'inoculo con DMEM fresco (contenente il 2% di FBS e 20 mM di HEPES, pH 7,7) e passare a un incubatore impostato a 34 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: per la propagazione di VSV-S-eGFP in coltura cellulare è necessaria una temperatura di 34 °C.
    2. Raccogliere supernatanti cellulari dopo l'osservazione di un esteso effetto citopatico (CPE) e distacco cellulare, circa 48 ore dopo l'infezione. Utilizzare un microscopio fluorescente per visualizzare l'ampia espressione di eGFP da parte di cellule infette a partire da 24 ore dopo l'infezione.
  2. Collezione
    1. Centrifugare i supernatanti utilizzando una centrifuga da banco per 5 minuti a 1.000 × g a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari. Aliquotare il surnatante per evitare cicli multipli di congelamento-scongelamento e conservare a -80 °C.

3. Titering dello pseudovirus VSV-S-eGFP

  1. Diluizione seriale per determinare il titolo virale
    1. Cellule Vero E6 a piastra su piastre a 6 pozzetti ad una densità di semina di 6 × 105 cellule per pozzetti in DMEM (con 10% FBS), e incubano durante la notte a 37 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: è possibile utilizzare anche celle Vero che sovraesprimono TMPRSS2 e hACE2.
    2. Impostare una serie di diluizioni seriali 10 volte del virus VSV-S-eGFP in DMEM privo di siero freddo posizionando 900 μL di media in sette tubi di microcentrifuga. Tubi per etichette da 1 a 7. Aggiungere brevemente 100 μL di stock virale al primo tubo e vortice. Trasferire brevemente 100 μL di virus diluito dal tubo 1 al tubo 2 e vortice; proseguire fino al tubo 7.
    3. Aspirare il mezzo da tutti i pozzi della piastra a 6 pozzi contenente celle Vero E6 e sostituirlo con 500 μL di diluizioni da 10-2 a 10-7. Incubare le piastre per 45 min a 37 °C con il 5% di CO2,oscillando delicatamente ogni 15 min.
    4. Aspirare l'inoculo e sostituirlo con un overlay contenente una miscela 1:1 di 2x DMEM e 6% carbossimetilcellulosa (CMC), concentrazione finale del 3% CMC, integrata con 10% FBS; incubare a 34 °C con 5% di CO2 per 48 ore.
      NOTA: Preriscaldare la miscela di sovrapposizione in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti durante la fase di infezione. Una miscela 1:1 di agarose all'1% con 2x DMEM integrato con FBS al 10% può essere utilizzata al posto di CMC. Per sovrapporre con agarose, far bollire l'1% di acarosio (in dH2O) e mescolare con 2x DMEM freddo. Assicurarsi che la miscela sia a una temperatura adeguata prima di aggiungere al monostrato cellulare (circa 37-40 °C). Se l'acarosio viene utilizzato per la sovrapposizione, le cellule devono essere fissate incubando in 2 ml di metanolo 3:1: acido acetico per almeno un'ora prima della colorazione.
  2. Colorazione e calcolo del titolo virale
    1. Visualizza le placche colorando con viola cristallino o visualizzazione diretta di eGFP al microscopio fluorescente.
    2. Per macchiare le piastre, aspirare la sovrapposizione, lavare una volta con PBS, quindi aggiungere 2 ml di viola cristallo allo 0,1% (in metanolo all'80% e dH2O) a ciascun pozzo. Posizionare su un bilanciere a piastre per circa 20 minuti a temperatura ambiente prima della de-colorazione. Rimuovere il cristallo viola e lavare delicatamente ciascuno bene due volte usando dH2O o PBS.
      NOTA: le fasi di lavaggio e colorazione devono essere eseguite delicatamente mediante pipettaggio lento verso il lato di ciascun pozzo per garantire che il monostrato cellulare rimanga intatto durante tutta la procedura.
    3. Lasciare asciugare le piastre per almeno 1 ora prima di contare le placche. Assicurarsi che i conteggi delle placche siano ottenuti da pozzi contenenti da 20 a 200 placche. Per calcolare il titolo del virus in unità di formazione della placca (PFU) per ml, moltiplicare il fattore di diluizione del pozzo contato con il volume dell'infezione e dividere questo numero dalle placche presenti nel rispettivo pozzo.
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4. Cellule placcanti (Giorno 1) per la misurazione della neutralizzazione dello pseudovirus SARS-CoV-2 mediante anticorpi disponibili in commercio e siero per pazienti convalescenti

  1. Preparazione per la coltura tissutale
    1. Preparare il terreno di coltura e il cappuccio di coltura dei tessuti come descritto nel paragrafo 1. Inoltre, preparare il numero necessario di 96 piastre di pozzetti per ospitare un minimo di 2 repliche per campione (cioè 1 piastra per 6 campioni); aggiungere ulteriori repliche se il volume del campione lo consente.
  2. Placcatura e manutenzione delle celle
    1. Crescere e mantenere le cellule Vero E6 come descritto nel paragrafo 1. Preparare almeno 10 mL di sospensione cellulare per piastra a 96 pozzetti ad una concentrazione di 2 ×10 5 cellule per mL (piastra 1,5 ×10 5 cellule per mL per i saggi eseguiti dopo 48 ore, se necessario). Aggiungere 100 μL di sospensione cellulare a ciascun pozzettino di una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale e incubare per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: Mescolare bene la sospensione cellulare e scuotere delicatamente ogni piastra in tutte le direzioni per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.

5. Diluizioni e infezioni anticorpali o sieriche (Giorno 2)

NOTA: Questo protocollo può essere applicato per misurare la neutralizzazione di VSV-S-eGFP sia da anticorpi disponibili in commercio che dal siero del paziente, nonché dal siero raccolto dagli animali per studi di sviluppo pre-clinico del vaccino. *Prendere nota dei passaggi aggiuntivi elencati quando si maneggiano campioni di siero paziente/animale.

  1. Serie di diluizione seriale
    1. Prima di diluire i campioni di siero, inattivare termicamente ogni campione a bagnomaria a 56 °C per 30 minuti per inattivare il complemento. Garantire che vengano prese le necessarie precauzioni di sicurezza durante la manipolazione dei campioni dei pazienti; Aprire i contenitori dei campioni solo quando si trovano nella cappa di coltura dei tessuti e garantire che siano indossati dispositivi di protezione individuale di livello 2 di contenimento appropriati.
    2. Impostare la serie di diluizione in una piastra vuota da 96 pozzi (Piastra 1).
    3. Iniziare tutte le diluizioni nella riga A della piastra a 96 pozzetti in 80 μL. *Per i campioni dei pazienti, iniziare la serie di diluizione a 1 su 10 posizionando 8 μL di siero in 72 μL di DMEM senza siero (con l'1% di penicillina/streptomicina).
      NOTA: La concentrazione di anticorpi neutralizzanti utilizzati dipenderà dall'attività prevista dal produttore. Per l'anticorpo neutralizzante SARS-CoV-2 Spike utilizzato qui (vedere la Tabella dei materiali),iniziare con 5 μg/mL per osservare almeno il 50% di neutralizzazione.
    4. Aggiungere 40 μL di DMEM senza siero (con 1% di penicillina/streptomicina) alle righe da B a G e 80 μL alla riga H. Non aggiungere virus alla riga H, in quanto funge da controllo solo cellulare.
    5. Utilizzando una pipetta multicanale a 12 pozzette, mescolare e trasferire 40 μL di siero diluito o anticorpo dalla riga A alla riga B. Mescolare e ripetere fino alla riga F, scartare 40 μL dalla riga F. Non aggiungere siero alla riga G in quanto rappresenta la riga di controllo solo virus.
  2. Infezione e sovrapposizione
    1. Preparare un volume appropriato di VSV-S-eGFP diluito per trattare ogni pozzo a MOI 0,05 (o 2000 pfu). (Quando si completa questo calcolo, tenere presente che solo 60 μL del volume totale di 80 μL verranno spostati sulle cellule; pertanto, assicurarsi di moltiplicare il volume del virus per 1,33 per mantenere 2000 pfu).
      NOTA: poiché VSV-S-eGFP è sensibile alla temperatura, assicurarsi che le scorte virali rimangano sul ghiaccio ogni volta che non sono in uso ed evitare più cicli di congelamento-disgelo poiché i titoli differiranno dopo ripetuti congelamenti.
    2. Aggiungere 40 μL di virus diluito a ciascun pozzetti nelle file da A a G della Piastra 1 e mescolare pipettando su e giù 4-5 volte. Incubare la piastra per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2.
    3. Rimuovere la piastra contenente le cellule dall'incubatore (Piastra 2) e aspirare accuratamente il mezzo da tutti i pozzi. Trasferire 60 μL di miscela anticorpo/virus dalla Piastra 1 alla Piastra 2 e incubare per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2,facendo oscillare la piastra ogni 20 minuti.
    4. Completare ogni pozzetti con 140 μL di sovrapprezzo contenente CMC in DMEM per una concentrazione finale del 3% di CMC (con il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina). Posizionare la Piastra 2 in un'incubatrice impostata a 34 °C con il 5% di CO2 per circa 24 ore prima dell'imaging.
      NOTA: Preriscaldare la miscela di sovrapposizione in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti durante la fase di infezione.

6. Imaging e quantificazione (Giorno 3)

  1. Piastre di immagine che utilizzano un imager fluorescente automatizzato (utilizzando un filtro isotiocianato di fluoresceina (FITC) o un filtro alternativo con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm). Quantificare l'infezione virale creando un protocollo che identifica e conta automaticamente i singoli focolai eGFP. Se non è disponibile una funzione di conteggio automatico, utilizzare il software ImageJ per quantificare il numero di focolai eGFP.

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Risultati

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Questo protocollo delinea un metodo rapido ed efficace per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro la proteina SARS-CoV-2 S attraverso l'inibizione dell'infezione da pseudovirus VSV-S-eGFP (quantificabile dalla perdita di focolai eGFP rilevati). Una rappresentazione schematica del protocollo è illustrata nella Figura 1. Si raccomanda di utilizzare un anticorpo disponibile in commercio come controllo positivo ogni volta che viene eseguito il test per garantire la coerenza del test. Qui, ...

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Discussione

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Il metodo qui descritto può essere adattato per adattarsi a diversi ambienti di laboratorio e risorse, se necessario. È importante sottolineare che la principale limitazione di questo protocollo è la necessità di uno spazio di livello 2 di contenimento e di una cappa di coltura tissutale. L'applicazione di un virus a RNA replicante pseudotipizzato con il picco SARS-CoV-2, come VSV-S-eGFP, è una formidabile alternativa al virus SARS-CoV-2, che richiede un'area di lavoro di livello 3 di contenimento, ma può rimanere una li...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti relativi a questa pubblicazione.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare il laboratorio Whelan per aver generosamente fornito il virus VSV-S-eGFP utilizzato in questo protocollo (descritto in Case et al. 2020). Ringraziamo anche i dottori Bill Cameron e Juthaporn Cowan (e il team) per aver raccolto i campioni di sangue del paziente (ID protocollo REB 20200371-01H). Gli autori rivelano di aver ricevuto il seguente sostegno finanziario per la ricerca, la paternità e / o la pubblicazione di questo articolo: Questo lavoro è stato finanziato dal generoso sostegno della Ottawa Hospital Foundation e una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research (# 448323) e una sovvenzione veloce dalla fondazione Thistledown per la scienza COVID-19 a C.S.I. T.R.J. è finanziata da una borsa di studio per laureati dell'Ontario e da una borsa di studio Mitacs del cluster. JP è finanziato da una borsa di studio Del cluster Mitacs. T.A. è finanziato da una CIHR Banting Fellowship. Vorremmo anche ringraziare tutte le persone che hanno partecipato e donato i loro campioni di sangue per questo studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% tripsina-EDTA (Gibco)Fisher scientificLS25200114
ArrayScan VTI HCSThermo Fisher ScientificImager fluorescente automatizzato
carbossimetilcellulosaSigmaC5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco)Fisher scientific10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Polvere) (Gibco)Thermo Fisher Scientific12-800-017
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
Controllo dell'isotipo IgG (topo)Thermo Fisher Scientific31903
Penicillina/streptomicinaThermo Fisher Scientific15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticorpo neutralizzante della punta, Mab di topoSinoBiological40592-MM57
Vero E6 celleATCC  Codice CRL-1586

Riferimenti

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