Articolo metodologico

Analisi del volume dei linfonodi mediante imaging ecografico ad altissima frequenza nel modello murino geneticamente modificato braf/Pten del melanoma

DOI:

10.3791/62527

⸱

8 settembre 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Clinical Physiology, National Research Council (IFC-CNR), 2Oncogenomics Unit, Core Research Laboratory, ISPRO

In questo articolo

Sommario

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Il melanoma è una malattia molto aggressiva che si diffonde rapidamente ad altri organi. Questo protocollo descrive l'applicazione dell'imaging ecografico ad altissima frequenza, abbinato al rendering 3D, per monitorare il volume dei linfonodi inguinali nel modello murino Braf/Pten del melanoma metastatico.

Abstract

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Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox topi geneticamente modificati (topi Braf/Pten) sono ampiamente usati come modello in vivo di melanoma metastatico. Una volta che un tumore primario è stato indotto dal trattamento con tamoxifene, si osserva un aumento del carico metastatico entro 4-6 settimane dall'induzione. Questo documento mostra come l'imaging Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) può essere sfruttato per monitorare l'aumento del coinvolgimento metastatico dei linfonodi inguinali misurando l'aumento del loro volume.

Il sistema UHFUS viene utilizzato per scansionare topi anestetizzati con una sonda lineare UHFUS (22-55 MHz, risoluzione assiale 40 μm). Le immagini in modalità B dei linfonodi inguinali (sia a sinistra che a destra) vengono acquisite in una vista ad asse corto, posizionando gli animali in reclinazione dorsale. I record di ultrasuoni vengono acquisiti utilizzando una dimensione del gradino di 44 μm su un braccio meccanico motorizzato. Successivamente, le acquisizioni bidimensionali (2D) in modalità B vengono importate nella piattaforma software per la post-elaborazione delle immagini a ultrasuoni e i linfonodi inguinali vengono identificati e segmentati semi-automaticamente nelle immagini 2D trasversali acquisite. Infine, si ottiene automaticamente una ricostruzione totale del volume tridimensionale (3D) insieme alla resa del volume linfonodale, che viene anche espresso come misura assoluta.

Questa tecnica in vivo non invasiva è molto ben tollerata e consente la programmazione di più sessioni di imaging sullo stesso animale sperimentale nell'arco di 2 settimane. È, quindi, ideale per valutare l'impatto del trattamento farmacologico sulla malattia metastatica.

Introduzione

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Il melanoma è una forma aggressiva di cancro della pelle che spesso si diffonde ad altri siti cutanei (metastasi sottocutanee), nonché a linfonodi, polmoni, fegato, cervello e ossa1. Nell'ultimo decennio, nuovi farmaci sono stati introdotti nella pratica clinica e hanno contribuito a migliorare l'aspettativa di vita dei pazienti con melanoma metastatico. Tuttavia, permangono limitazioni, tra cui il tempo e il grado di risposta variabili, gravi effetti collaterali e l'insorgenza di resistenza acquisita1. Pertanto, è fondamentale rilevare la diffusione metastatica nelle sue fasi iniziali, cioè quando arriva ai linfonodi locali.

Una biopsia dei linfonodi locali (linfonodi sentinella) viene solitamente eseguita per verificare la presenza di cellule di melanoma. Tuttavia, l'imaging ecografico sta prendendo piede come metodo non invasivo per rilevare il coinvolgimento metastatico, in quanto supera la valutazione clinica e può aiutare a evitare una biopsia non necessaria2,3,4. Inoltre, l'imaging ecografico sembra appropriato per la sorveglianza dei linfonodi, specialmente in caso di età avanzata e/o comorbidità5,6. Le caratteristiche che vengono rilevate dall'analisi ecografica e consentono la differenziazione tra linfonodi normali e metastatici comprendono l'aumento delle dimensioni (volume), il cambiamento di forma da ovale a rotondo, il margine irregolare, il modello ecogenico alterato e la vascolarizzazione alterata (aumentata)7.

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox topi geneticamente modificati (topi Braf/Pten) sono stati recentemente messi a disposizione della comunità scientifica come modello tessuto-specifico e inducibile per il melanoma metastatico8. In questo modello animale, i tumori primari si sviluppano molto rapidamente: diventano visibili entro 2-3 settimane dall'induzione del passaggio da Braf wild-type (wt) a BrafV600E e della perdita di Pten, mentre raggiungono un volume di 50-100 mm3 entro 4 settimane. Nelle successive 2 settimane, la crescita del tumore primario è accompagnata da un progressivo aumento del carico metastatico in altri siti cutanei, linfonodi e polmoni.

I topi Braf/Pten sono stati ampiamente utilizzati per molteplici scopi, tra cui la dissezione delle vie di segnalazione coinvolte nella melanomagenesi9,10, l'identificazione delle cellule di melanoma di origine11,12,13 e la sperimentazione di nuove opzioni terapeutiche in termini sia di terapia mirata che di immunoterapia8,14,15,16 . In particolare, abbiamo usato topi Braf / Pten per dimostrare che Listeria monocytogenes attenuata (Lmat) funziona come vaccino anti-melanoma. Quando somministrato per via sistemica in ambito terapeutico, Lmat non è associato a tossicità complessiva in quanto si accumula selettivamente nei siti tumorali. Inoltre, provoca una notevole diminuzione della massa del melanoma primario e una riduzione del carico metastatico nei linfonodi e nei polmoni. A livello molecolare, Lmat provoca l'uccisione apoptotica delle cellule di melanoma, che è dovuta, almeno in parte, ad attività non autonome delle cellule (reclutamento in loco di linfociti T CD4+ e CD8+)16.

Quando i topi Braf / Pten vengono utilizzati per la modellazione del melanoma, la crescita dei tumori primari e delle metastasi sottocutanee può essere monitorata mediante misurazioni del calibro. Tuttavia, il coinvolgimento di linfonodi e polmoni deve essere studiato utilizzando una tecnica alternativa, possibilmente non invasiva che consenta ai ricercatori di seguire lo stesso animale nel tempo. Questo articolo descrive l'uso dell'imaging ecografico (Figura 1), abbinato ad una successiva analisi volumetrica 3D dei dati ottenuti, per il monitoraggio longitudinale dell'aumento delle dimensioni (volume) dei linfonodi inguinali.

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Protocollo

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Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano (protocolli animali #754/2015-PR e #684/2018-PR).

1. Induzione del melanoma

NOTA: In questo studio sono stati utilizzati topi Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox di sei settimane [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] (vedere la Tabella dei materiali).

  1. Trattare i topi con 4-idrossitamoxifene (4-HT) applicando 3 μL di 5 mM 4-HT su ~ 1 cm2 di pelle rasata della parte superiore della schiena, come descritto in precedenza11,16,17, per 3 giorni consecutivi.
    NOTA: Questo attiverà l'enzima Cre e causerà un passaggio da wt Braf a BrafV600E e la perdita di Pten. Questi due colpi sono sufficienti per indurre la formazione di melanoma.
  2. Osservare che i tumori primari si sviluppano nel sito della pittura cutanea in 2-3 settimane e raggiungono un volume di 50-100 mm3 in 4 settimane. Inoltre, osservare le metastasi in altri siti cutanei, linfonodi e polmoni in questo momento (t0).
  3. Utilizzare calibri per misurare il volume del tumore primario e delle metastasi sottocutanee e l'ecografia per misurare il volume dei linfonodi inguinali. Ripetere queste misurazioni dopo una settimana (t1, 5 settimane dopo la pittura della pelle) e dopo due settimane (t2, 6 settimane dopo la pittura della pelle).
  4. All'ultimo punto temporale, eutanasia dei topi per overdose di sevorano gassoso.
  5. Analizzare il tumore primario e i linfonodi mediante ispezione visiva, quindi asportareli per studi istologici, come riportato in16.

2. Procedura di imaging

  1. Posizionare il topo in una camera di induzione per l'anestesia gassosa e fornire il 3% di isoflurano in ossigeno puro fino a quando l'animale non è completamente anestetizzato. Verificare la profondità dell'anestesia per mancanza di risposta al pizzico della zampa.
  2. Trasferire l'animale su una scheda riscaldata - una parte costitutiva della stazione di imaging UHFUS - tenendo l'animale in posizione supina. Utilizzare una sonda rettale lubrificata con vaselina per misurare la temperatura corporea. Regolare la temperatura della scheda per mantenere la temperatura corporea del mouse nell'intervallo fisiologico (36 ± 1°C).
  3. Inumidire gli occhi del topo con un unguento veterinario per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Fornire gas narcotico (1,5% di isoflurano in ossigeno puro) attraverso una maschera nasale del topo. Regolare la percentuale di isoflurano per mantenere la corretta profondità dell'anestesia.
  4. Rivestire le zampe anteriori e posteriori con pasta conduttiva e fissarle agli elettrodi della piastra ECG incorporati nella scheda. Verificare che i parametri fisiologici (frequenza cardiaca, segnale respiratorio e temperatura corporea interna) siano correttamente acquisiti e visualizzati.
  5. Rimuovere i peli da entrambe le aree inguinali applicando un agente depilatorio e rivestirli con un mezzo di accoppiamento acustico.
  6. Bloccare la sonda lineare UHFUS (frequenza centrale 40 MHz) in un motore 3D specializzato incorporato nella stazione di imaging UHFUS, consentendo il movimento automatizzato e graduale della sonda.
  7. Orientare e regolare correttamente la posizione della sonda ad ultrasuoni per ottenere immagini ad asse corto del linfonodo inguinale (sinistra / destra) e posizionare la regione di interesse nella zona focale.
  8. Scansiona l'intero volume del linfonodo inguinale come una sequenza di immagini 2D in modalità B, come descritto in precedenza18. Acquisire immagini a più livelli del linfonodo mediante movimento lineare del trasduttore con dimensioni del passo su scala micrometrica, per generare dati 3D in termini di circuiti cine-gated automaticamente respiratori e cardiaci.
  9. Impostare la registrazione dell'immagine con i seguenti parametri: distanza di scansione compresa tra 2 e 5 mm (a seconda delle dimensioni dei linfonodi); dimensione del passo 44 μm, con un risultato di 46-114 fasi di scansione / fette di linfonodi e un tempo di acquisizione di 1-3 minuti per animale. Memorizza digitalmente le immagini acquisite in formato raw (DICOM) per ulteriori analisi offline.
  10. Alla fine della sessione di imaging, interrompere l'anestesia gassosa e consentire all'animale di recuperare sulla scheda di riscaldamento in reclinazione sternale. Prenditi cura dell'animale fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la posizione prona.

3. Post-elaborazione delle immagini ad ultrasuoni

  1. Aprire il set di dati delle immagini 3D DICOM del linfonodo inguinale sinistro/destro nella piattaforma software per la post-elaborazione delle immagini ad ultrasuoni.
  2. Segmentazione:
    1. Selezionate Metodo multi-slice per visualizzare sia i fotogrammi correnti che le miniature di tutti i fotogrammi corrispondenti a ciascuna immagine acquisita durante l'acquisizione 3D.
    2. Selezionate la miniatura del primo fotogramma per caricarla nella vista di contornatura. Nella vista di contornatura, fare clic con il pulsante sinistro del mouse per rilasciare i punti lungo il bordo del linfonodo. Una volta impostato il numero desiderato di punti (intervallo 10-15), fare clic con il pulsante destro del mouse per completare il contorno.
    3. Una volta completato il primo contorno, utilizzate la vista miniatura per selezionare l'immagine successiva per il contorno. Se necessario, salta diverse immagini (in media 3 fotogrammi) tra i contorni per ridurre il numero di tracce manuali necessarie per ogni volume 3D.
      NOTA: La piattaforma software per la post-elaborazione delle immagini ad ultrasuoni genererà automaticamente i contorni tra le tracce manuali, riducendo così il tempo di analisi.
    4. Ripetere questo processo fino a quando l'intero volume non è stato delineato. Una volta completato, fai clic su Fine.
  3. Generazione del wireframe 3D e misurazione del volume:
    1. Nell'area di lavoro della finestra della modalità 3D , fare clic sull'icona Misurazione volume sotto l'area di visualizzazione dell'immagine per attivare la vista della superficie.
      NOTA: la vista superficie crea una vista di compilazione che esegue il mapping del volume generato dall'utente all'immagine acquisita. La vista della superficie può essere ruotata in qualsiasi posizione desiderata.
    2. Prendere nota della misurazione del volume elencata nell'angolo in basso a sinistra della vista cubo.
      NOTA: la segmentazione e la generazione di volumi 3D possono anche essere ottenute utilizzando software sviluppato su misura e / o software libero disponibile / commerciale per l'elaborazione generale delle immagini. Partendo dalla segmentazione manuale, il software dovrebbe fornire una descrizione matematica e/o a livello di pixel dei contorni dei linfonodi. Questi contorni sarebbero combinati in uno spazio 3D per rendere la superficie esterna dei linfonodi. Tutti i passaggi descritti nella procedura di imaging e nella post-elaborazione delle immagini ecografiche sono riassunti nella Figura 2.

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Risultati

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Dopo la verniciatura cutanea di topi Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox con 4-HT, viene indotta l'attività cre, grazie alla quale c'è un passaggio a livello genomico da wt Braf a BrafV600E, mentre Pten viene perso (Figura 3A). In 2-3 settimane, i topi sviluppano tumori primari in loco con penetranza al 100%. Dopo quattro settimane dal trattamento 4-HT (t0), i tumori primari raggiungono un volume di 50-100 mm3 e la loro crescita può ...

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Discussione

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I dati ottenuti in questo studio attestano la capacità dell'ecografia di monitorare il coinvolgimento metastatico dei linfonodi inguinali del modello murino Braf/Pten di melanoma metastatico. Come mostrato in precedenza16, questa tecnica è particolarmente utile per valutare l'efficacia del trattamento farmacologico. Questo perché permette il monitoraggio della variazione del volume linfonodale nello stesso animale nel tempo, confrontando le misurazioni raccolte a t1 et2 ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano S. Burchielli (FTGM, Pisa) per la sua assistenza nelle procedure animali. Questo lavoro è stato sostenuto da ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica finanziamento istituzionale a LP; MFAG #17095 assegnato da AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro a LP.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4-idrossitamoxifeneMerckH6278farmaco utilizzato per l'induzione del tumore
B6. Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) topiThe Jackson Laboratory013590
Blu gelSooft Ialiasoluzione oftalmica gel
BRAFV600E anticorpoSpring Bioscience CorporationE19290
IsoFlo (isoflorane)Zoetisliquido per anestesia gassosa
MLANA anticorpo ThermoFisher ScientificM2-7C10
Sigma gelelettrodiParker
Gel transonico trasparenteTelic SAUgel per ultrasuoni
VeetReckitt Benckiser ITcrema depilatoria
Compact Dual Anesthesia SystemFujifilm, Visualsonics Inc.Sistema di anestesia a base di isoflurano dotato di cono nasale e camera di induzione
MX550SFujifilm, Visualsonics Inc.Sonda lineare UHFUS
Vevo 3100Fujifilm, Visualsonics Inc.Sistema UHFUS
Vevo Imaging StationFujifilm, Visualsonics Inc.Stazione di imaging UHFUS e unità di monitoraggio fisiologico avanzato dotate di scheda riscaldata
Vevo LabFujifilm, Visualsonics Inc.Piattaforma software per la post-elaborazione delle immagini ecografiche
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Riferimenti

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