Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

Gli approcci di ingegneria tissutale sono stati ampiamente esplorati, negli ultimi anni, per accompagnare i risultati clinici in vivo nella medicina rigenerativa e nella^{modellazione delle malattie 1,2}. Un'enfasi significativa è stata posta in particolare sulla modellazione in vitro dei tessuti cardiaci a causa delle difficoltà intrinseche nell'approvvigionamento del tessuto cardiaco primario umano e nella produzione di surrogati in vitro fisiologicamente rilevanti, limitando la comprensione fondamentale dei complessi meccanismi delle malattie cardiovascolari (CVD)^1,3. I modelli tradizionali hanno spesso coinvolto test di coltura monostrato 2D. Tuttavia, l'importanza di coltivare cellule cardiache all'interno di un ambiente 3D per imitare sia il paesaggio nativo del miocardio che le complesse interazioni cellulari è stata ampiamente^{caratterizzata 4,5}. Inoltre, la maggior parte dei modelli prodotti finora hanno incluso una monocoltura di MACCHINE differenziate dalle cellule staminali. Tuttavia, il cuore è composto da più tipi di cellule^{6 all'interno} di una complessa architettura 3D⁷, che garantisce la necessità critica di migliorare la complessità della composizione tissutale all'interno di modelli in vitro 3D per imitare meglio i costituenti cellulari del miocardio nativo.

Ad oggi, sono stati esplorati molti approcci diversi per produrre modelli 3D biomimetici del miocardio⁸. Questi approcci vanno dalle configurazioni sperimentali che consentono il calcolo in tempo reale della forza generata, dalle MACCHINE monocolturate seminate su pellicole sottili (considerate pellicole sottili muscolari (MTF))^9,alle cellule cardiache co-coltura in matrici idrogel 3D sospese tra cantilevers indipendenti (ritenuti tessuti cardiaci ingegnerizzati (EHTs))¹⁰. Altri approcci si sono concentrati sull'implementazione di tecniche di micromolding per imitare l'anisotropia miocardico, dalle macchine virtuali monocolturali in un idrogel 3D sospeso tra micropost sporgenti in un cerotto^{tissutale 11,}alle MACCHINE monocoltura sementi tra microgroovi rientrati^12,13. Ci sono vantaggi e svantaggi intrinseci per ciascuno di questi metodi, quindi, è pertinente utilizzare la tecnica che si allinea con l'applicazione prevista e la corrispondente questione biologica.

La capacità di migliorare la maturazione delle MACCHINE derivate da cellule staminali è essenziale per il successo dell'ingegneria in vitro del tessuto miocardico simile a quello adulto e la traduzione dei successivi risultati alle interpretazioni cliniche. A tal fine, i metodi per maturare le MACCHINE sono stati ampiamente esplorati, sia in 2D che in^{3D 14,15,16}. Ad esempio, la stimolazione elettrica incorporata negli ETT, l'allineamento forzato delle MACCHINE con la topografia superficiale, i segnali di segnalazione, i fattori di crescita della cocoltura e / o le condizioni dell'idrogel 3D, ecc., portano tutti a un cambiamento a favore della maturazione cm in almeno uno dei seguenti: morfologia cellulare, manipolazione del calcio, struttura sarcomerica, espressione genica o forza contrattile.

Di questi modelli, gli approcci che utilizzano piattaforme microfluidiche mantengono alcuni vantaggi in natura, come il controllo dei gradienti, l'input limitato delle cellule e i reagenti necessari minimi. Inoltre, molte repliche biologiche possono essere generate contemporaneamente utilizzando piattaforme microfluidiche, servendo a sezionare meglio il meccanismo biologico di interesse e ad aumentare la dimensione sperimentale del campione a favore^{della potenza statistica 17,18,19}. Inoltre, l'utilizzo della fotolitografia nel processo di fabbricazione del dispositivo microfluidico consente la creazione di caratteristiche precise (ad esempio, topografie) a livello micro e nano, che fungono da segnali mesoscopici per migliorare la struttura cellulare circostante e l'architettura dei tessuti macro-livello^{18,20,21,22 per} diverse applicazioni nella rigenerazione dei tessuti e nella modellazione delle malattie.

In precedenza abbiamo dimostrato lo sviluppo di un nuovo modello di tessuto cardiaco 3D su chip che incorpora la topografia superficiale, sotto forma di micropost ellittiche innati, per allineare le cellule cardiache co-coltivate in idrogel in un tessuto anisotropico^{interconnesso 20}. Dopo 14 giorni di coltura, i tessuti formatisi all'interno del dispositivo microfluidico sono più maturi nel fenotipo, nel profilo di espressione genica, nelle caratteristiche di manipolazione del calcio e nella risposta farmaceutica rispetto ai controlli monostrato e isotropi 3D²³. Il protocollo qui descritto delinea il metodo per la creazione di questo 3D co-coltivato, allineato (cioè, anisotropico) tessuto cardiaco umano all'interno del dispositivo microfluidico utilizzando CRM derivati dall'hiPSC. In particolare, spieghiamo i metodi per differenziare e purificare gli iPSC verso le IC, l'integrazione di hFC con IC per produrre una popolazione di co-coltura stabilita, l'inserimento della popolazione cellulare incapsulata all'interno dell'idrogel di collagene nei dispositivi microfluidici e la successiva analisi dei tessuti costruiti in 3D attraverso test contrattili e immunofluorescenti. I micro tissue ingegnerizzati in 3D risultanti sono adatti per varie applicazioni, tra cui studi di biologia fondamentale, modellazione CVD e test farmaceutici.

Eseguire tutta la manipolazione delle cellule e la preparazione dei reagenti all'interno di un armadio biosicurezza. Assicurarsi che tutte le superfici, i materiali e le apparecchiature che entrano in contatto con le cellule siano sterili (ad esempio, spruzzare con il 70% di etanolo). Le cellule devono essere coltivate in un incubatore umidificato di 37 °C, 5% di CO_2. Tutte le impostazioni cultura e differenziazione hiPSC vengono eseguite in piastre a 6 po porsi.

1. Creazione di dispositivi microfluidici (durata approssimativa: 1 settimana)

1. Fotolitografia
   NOTA: La maschera, progettata utilizzando il file CAD (fornito come file supplementare 1), contiene il design del canale microfluidico. Stampare il disegno su una maschera trasparente. Quindi, esegui la fotolitografia standard con il fotoresist negativo SU8 2075 su un wafer di silicio da 4 pollici all'interno di una camera bianca.
   1. Pulire un wafer di silicio con alcol isopropile (IPA) e asciugare con azoto. Cuocere a 200 °C per 5 minuti per disidratazione.
      NOTA: Maneggiare il wafer con pinzette per wafer.
   2. Posizionare il wafer nello spin-coater. Depositare 3-4 mL di SU8 al centro del wafer, quindi girare per formare uno strato di 200 μm (cioè, salire da 15 a 500 giri/min, girare per 10 s, salire da 5 a 1.200 giri/min e girare per 30 s, quindi downspin per 15 s fino a fermarsi).
   3. Rimuovere il wafer e cuocere morbido per 7 minuti a 65 °C, quindi 45 min a 95 °C.
   4. Spostare il wafer su un allineatore maschera e posizionare la maschera trasparente nel porta maschera con un filtro UV. Esporre il wafer a 2 cicli di 230 mJ/cm^2,con ritardo di 30 s, per un'esposizione totale di 460 mJ/cm^2.
   5. Eseguire una cottura post-esposizione sul wafer esposto in un forno a 50 °C durante la notte.
   6. Spegnere il forno la mattina successiva e, dopo che il wafer si è raffreddato a temperatura ambiente, immergerlo nello sviluppatore SU8. Rimuovere il wafer dallo sviluppatore ogni 5 minuti e lavare con IPA, quindi riposizionare lo sviluppatore.
   7. Dopo circa 20 minuti, o quando l'IPA si esaurisce, asciugare il wafer con azoto d'aria e cuocere duramente in un forno impostato a 150 °C; non appena il forno raggiunge i 150 °C, spegnerlo ma non aprirlo. Lasciare il wafer nel forno fino a raggiungere la temperatura ambiente, quindi rimuovere il wafer.
   8. Confermare l'altezza di SU8 con un profilometro e le caratteristiche ottiche con un microscopio a luce. Una volta confermato, nastro il wafer all'interno di una piastra di Petri di plastica da 150 mm.
2. Litografia morbida
   NOTA: Il wafer, attaccato alla piastra di Petri, deve essere silanizzato per evitare l'aderenza del PDMS alle caratteristiche SU8.
   1. Invertire il wafer (toccato in una piastra di Petri di plastica) su una piastra di Petri di vetro della stessa dimensione contenente 0,4 mL di metiltriclorosilano (MTCS) ed esporre il wafer ai vapori per 4 minuti. Ruotare il wafer in posizione verticale e posizionare il coperchio sulla piastra di Petri.
   2. Mescolare 30 g di base di elastomero siliconico con l'agente polimerizzante con un rapporto 10:1. Togliere il coperchio dalla piastra di Petri e versare il polidimetilsiloxano (PDMS) sul wafer, quindi degas all'interno di un essiccatore.
   3. Una volta che tutte le bolle sono sparite, posizionare il wafer a 80 °C per 1,5 ore per curare il PDMS.
   4. Staccare con cura il PDMS e punzonare le insenature e le prese per le porte dei tessuti e i canali dei supporti con un punzone di biopsia da 1 mm e 1,5 mm, rispettivamente.
   5. Pulire i canali PDMS con nastro adesivo per rimuovere la polvere. Quindi, immergere i copricapo (18 x 18 mm, n. 1) in etanolo al 70% per almeno 15 minuti. Quindi, asciugarli con salviette tissutali.
   6. Sottosostire sia i copripavimenti che i canali PDMS (lato caratteristica esposto) al plasma (impostazione in alto) per 1 min, quindi legare rapidamente insieme e posizionare in un forno a 80 °C durante la notte per fissare il legame.
      NOTA: Durante l'incollaggio, è essenziale applicare una leggera pressione sui bordi dei canali PDMS per garantire una buona tenuta tra il PDMS e il vetro evitando il canale stesso per evitare il collasso del canale.
3. Preparazione del dispositivo
   1. Immergere i dispositivi PDMS incollati in acqua deionizzata (DI H₂O) e autoclave con il ciclo liquido. Successivamente, aspirare nuovamente il liquido dai dispositivi e autoclave con il ciclo di gravità. Quindi, disidratare i dispositivi sterilizzati durante la notte a 80 °C.

2. Coltura delle cellule staminali (durata approssimativa: 1-2 mesi)

1. coltura e manutenzione hiPSC
   NOTA: Gli iPSC devono essere coltivati per tre passaggi consecutivi dopo lo scongelamento in vitro prima della crioconservazione o differenziazione. gli iPSC sono coltivati in mezzo E8 o mTeSR1, a seconda della linea cellulare, sulle piastre rivestite a matrice a membrana basale²⁴.
   1. Per rivestire piastre con matrice di membrana basale di qualità hESC, scongelare un'aliquota del mezzo matrice (volume dipendente dal lotto, generalmente 200-300 μL; immagazzinata a -80 °C) aggiungendola a 25 mL di DMEM/F-12K sul ghiaccio. Distribuire 1 mL di questa sospensione in ogni pozzo di una piastra a 6 pota. Lasciare la piastra nell'incubatrice a 37 °C per almeno 1 h.
   2. Al momento dello scongelamento, modificare il supporto E8 per le impostazioni cultura hiPSC aggiungendo 5 μM di Y-27632²⁵ (E8+RI). Utilizzare questo supporto per 24 ore dopo, quindi cambiare il supporto in nuovo E8.
      NOTA: per le modifiche dei supporti di routine, i supporti E8 non modificati vengono utilizzati per le impostazioni cultura hiPSC. Per una manutenzione regolare, i supporti E8 devono essere cambiati ogni giorno, circa 24 ore dopo il precedente cambiamento dei supporti.
   3. Cellule di passaggio al giorno 3 o al giorno 4, mezzi aspirati, quindi lavare ogni bene con 1 mL di soluzione tamponata con fosfato (DPBS) di 1x Dulbecco.
      NOTA: Assicurarsi che le cellule siano circa il 70% confluenti. Non lasciare che crescano oltre il 70% di confluenza.
   4. Aspirare il DPBS, quindi aggiungere 1 mL di 0,5 mM EDTA ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per 6-7 min.
   5. Aspirare con cura EDTA, aggiungere 1 mL di E8+RI in ogni pozzo e esplodere contro la superficie con una pipetta da 1 mL (~5-10 volte per raccogliere tutte le cellule). Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo microcentrifugo da 15 ml.
   6. Contare la sospensione cellulare e il passaggio alla densità cellulare desiderata (cioè ~ 200 K per pozzo) in E8+RI.
   7. Cambiare i supporti in E8 (senza RI) 24 ore dopo. Non lasciare le cellule con RI per più di 24 ore.
      NOTA: E8 non deve essere riscaldato a 37 °C. Lasciare sempre a temperatura ambiente per riscaldarsi prima della coltura cellulare.
2. Differenziazione diretta del cardiomiocita (CM)
   NOTA: È importante notare l'esistenza di eterogeneità tra le diverse righe degli hiPSC^26,27, pertanto potrebbe essere necessario ottimizzare i passaggi seguenti per ogni riga di cella. Seguire i passaggi seguenti per la differenziazione CM.
   1. Preparare RPMI + B27 - insulina aggiungendo 10 mL di B27 meno insulina e 5 mL di penicillina / streptomicina (penna / streptomicina) a 500 mL di RPMI 1640.
   2. Preparare RPMI + B27 + insulina aggiungendo 10 mL di B27 e 5 mL di penna / streptocondo a 500 mL di RPMI 1640.
   3. Preparare RPMI meno glucosio + B27 + insulina aggiungendo 10 mL di B27, 5 mL di penna / streptocoppo e 4 mM di lattato di sodio a 500 mL di RPMI 1640 senza glucosio.
   4. Una volta che gli hiPSC raggiungono l'85% di confluenza, iniziare la differenziazione (Giorno 0) sostituendo il vecchio mezzo con 4 mL dell'RPMI + B27 - mezzo insulinica contenente 10 μM CHIR99021 ad ogni pozzo di una piastra a 6 pomp pomp (cioè, aggiungere 25 μL di 10 mM CHIR99021 in 25 mL di RPMI + B27 - insulina e quindi aggiungere immediatamente 4 mL per pozzo).
      NOTA: CHIR99021 è un inibitore della GSK e porta all'attivazione Wnt. La concentrazione ottimale di CHIR99021 e la confluenza iniziale varia per ogni linea cellulare²⁸. Controllare sempre un gradiente di concentrazione di 6-12 μM CHIR99021 e una serie di densità di semina prima dell'esperimento effettivo per determinare le condizioni ottimali per iniziare la differenziazione.
   5. Esattamente 24 ore dopo (Giorno 1), aspirare il mezzo e sostituire con 5 mL di RPMI + B27 prebellico - insulina ad ogni pozzo.
   6. Esattamente 72 ore dopo l'aggiunta di CHIR99021 (Giorno 3), raccogliere 2,5 ml del mezzo speso da ogni pozzo della piastra a 6 poggiale, per un totale di 15 ml del mezzo speso in un tubo.
   7. A questo, aggiungere 15 mL di RPMI fresco + B27 - mezzo di insulina. Aggiungere IWP2 a una concentrazione di 5 μM al tubo medio combinato (cioè 1 μL di IWP2 a 5 mM per 1 ml di mezzo combinato o 30 μL di IWP2 in 30 mezzi mL totali).
   8. Rimuovere ~1,5 mL del mezzo rimanente per pozzo della piastra in modo che rimangano 1 mL del mezzo. Ruotare vigorosamente la piastra per garantire un'adeguata rimozione dei detriti cellulari. Quindi, aspirare il resto del vecchio mezzo e aggiungere 5 mL del mezzo combinato contenente IWP2 per pozzo della piastra.
      NOTA: L'aggiunta di IWP2 alle cellule porta all'inibizione Wnt.
   9. Il giorno 5, aspirare il mezzo da ogni pozzo e sostituirlo con 5 mL di RPMI + B27 prebellico - insulina.
   10. Maturazione CM: Il giorno 7, giorno 9 e giorno 11, aspirare il mezzo da ogni pozzo e sostituirlo con 5 mL di RPMI + B27 + insulina prebellico. Il pestaggio spontaneo dovrebbe essere osservato in questi giorni.
   11. Purificazione CM: Il giorno 13 e il giorno 16, iniziare la fame di glucosio aspirando il mezzo da ogni pozzo, lavando ogni bene con 1 mL di 1x DPBS, e quindi aggiungendo 5 mL di RPMI prebellico meno glucosio + B27 + insulina, integrato con 4 mM di lattato di sodio.
   12. Il giorno 19, aspirare il mezzo speso e sostituirlo con 5 mL di RPMI + B27 + insulina prebellica ad ogni pozzo per consentire il recupero cellulare dopo la purificazione.
   13. Il giorno 21, ritrarre le cellule, seguendo il seguente protocollo di dissociazione CM descritto (passaggio 3.3). Puntare a placcare 1,5-2 x 10⁶ celle per pozzo in una piastra da 6 po '. Ad esempio, se si tratta di una differenziazione altamente efficiente, generalmente espandere i 6 pozzi in 9 pozzi è buono.
   14. Dal giorno 21 in poi, aspirare il mezzo da ogni pozzo e sostituirlo con 4 mL di RPMI + B27 + insulina ogni 2-3 giorni.
       NOTA: Le hiPSC-CMs sono pronte per l'uso sperimentale dopo il giorno 23.

3. Creazione di tessuto cardiaco 3D all'interno del dispositivo microfluidico: (Durata approssimativa: 2-3 h)

1. coltura hCF
   1. Coltura fibroblasti cardiaci ventricolari umani (hCF; ottenuti commercialmente da Lonza) in mastri T75 (a 250K cellule per pallone) in Fibroblast Growth Media-3 (FGM3). Cambia i media a giorni nostri e passaggi quando sei al 70% confluente. Utilizzare gli hCL prima del passaggio 10, in quanto potrebbero iniziare a differenziarsi dai miofibroblasti ai passaggi alti²⁹.
2. Dissociazione hCF
   1. Per dissociare gli hRF, ese prima il pallone dall'incubatore. Mettere il pallone all'interno dell'armadio di biosicurezza e iniziare ad aspirare il supporto trascorso dal pallone. Quindi, lavare il pallone T75 con 3 ml di 1x DPBS. Chiudere il cappuccio e ruotare il pallone.
   2. Aspirare il DPBS. Prendi 3 mL di 1x Trypsin-EDTA prebellico (0,05%) e aggiungerlo al pallone. Inclinare il pallone e ruotare per rivestire il fondo. Lasciarlo in un incubatore a 37 °C per 4-6 minuti, controllando il pallone al microscopio per assicurarsi che le cellule si sta staccano, come evidenziato attraverso la forma rotonda della cella e le celle galleggianti. In caso meno, rimettere il pallone nell'incubatrice per un altro minuto.
   3. Neutralizzare l'azione della tripina aggiungendo 3 ml di MGF3 prebellica al pallone. Quindi, pipettare la soluzione su e giù contro il fondo del pallone per spostare i FF.
   4. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo microcentrifugo da 15 ml. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e erogarla in un emocitometro per contare le cellule con un microscopio.
   5. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 4 min. Aspirare il supernatante facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare.
   6. Rimorsi il pellet in MGF3 fresco, per fare un desiderato 75 x 10⁶ celle / mL. O passare una porzione (250K cellule per pallone T75) o seguire il protocollo seguente per generare tessuto cardiaco 3D.
3. Dissociazione CM
   NOTA: Dopo la differenziazione e la purificazione, preparare le MACCHINE per l'uso nell'iniezione in dispositivi microfluidici.
   1. Estraete il piatto di macchine virtuali dall'incubatore e aspirate i supporti. Quindi lavare i pozzi con 1 mL di 1x DPBS per pozzo di una piastra da 6 pozzi. Prendere 6 mL di DPBS e pipetta 1 mL per pozzo.
   2. Aspirare il DPBS facendo attenzione a non disturbare le cellule attaccate alla piastra. Pipettare 6 mL di soluzione di distacco di celle calde (ad esempio, TrypLE express) e aggiungere 1 mL per pozzo. Incubare le cellule in un'incubatrice a 37 °C per 10 minuti.
   3. Neutralizzare l'enzima con un volume uguale di insulina RPMI + B27+ (cioè 1 mL per pozzo) e dissociare meccanicamente le cellule tubazioni su e giù contro il recipiente di coltura con una pipetta da 1 mL.
   4. Raccogliere le macchine virtuali in un tubo di centrifuga da 15 ml. Centrifuga a 300 x g per 3 min.
   5. Aspira il supernatante. Rimosoppo il pellet cellulare in 5 mL di RPMI + B27 + insulina. Pipettare la soluzione su e giù con una pipetta da 1 mL per garantire una corretta miscelazione. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e erogarla in un emocitometro per determinare il numero totale di cellule.
   6. Centrifugare nuovamente le cellule a 300 x g per 3 min (per garantire la completa rimozione di TrypLE) e aspirare il supernatante. Quindi, aggiungere un volume appropriato di RPMI + B27 + insulina per ottenere 75 x 10⁶ cellule / mL.
      NOTA: Se la differenziazione/selezione cardiaca non si traducono in un elevato CM% (cioè >80%), come evidenziato dall'immunosociezione o dalla citometria del flusso per proteine specifiche del CM come il cTnT, non considerare le cellule adatte alla formazione dei tessuti. Il processo di differenziazione dovrebbe essere ottimizzato quando ciò avviene attraverso la regolazione delle concentrazioni di CHIR99021 e della densità iniziale di partenza. Se la purificazione CM necessita di miglioramenti, è possibile utilizzare altri metodi, ad esempio lo smistamento per le MACCHINE con smistamento cellulare attivato a fluorescenza (FACS) o macs (magnetic-activated cell sorting)^30,31,32.
4. Preparazione del collagene
   NOTA: Preparare il collagene dall'alta concentrazione di collagene (che va da 8-11 mg / mL). Il collagene utilizzato per creare la miscela cellula:idrogel è a 6 mg/mL e la concentrazione finale è di 2 mg/mL. A seconda del numero di dispositivi da iniettare, il volume della soluzione di collagene da fare deve essere ri calcolato.
   1. Tenere tutti i reagenti richiesti sul ghiaccio all'interno di una cappa di biosicurezza.
      NOTA: Il collagene è un idrogel termoresponso. Pertanto, la temperatura deve rimanere bassa per prevenire la polimerizzazione prematura.
   2. Assumere 75 μL di collagene stock (8 mg/ml) e erogarlo in un tubo di microcentrifugo sul ghiaccio. La soluzione di collagene è molto viscosa, quindi aspirala lentamente con una pipetta.
   3. Assumere 13,85 μL di mezzi (cioè RPMI + B27 + insulina) e erogarlo nello stesso tubo.
   4. Quindi prendere 10 μL di rosso fenolo e aggiungere alla miscela e rimorsi.
   5. Infine, prendere 1,15 μL di 1N NaOH e aggiungere alla sospensione.
   6. Utilizzando una punta di pipetta da 200 μL, rimospendò la sospensione.
      NOTA: Il collagene stock ha un pH acido, che richiede l'aggiunta di NaOH per neutralizzarlo prima di usarlo per incapsulare le cellule cardiache. Il rosso fenolo agisce come indicatore di pH; pertanto, aggiungere questo prima dell'aggiunta NaOH. A questo punto, la soluzione di collagene sarà gialla, denotandone l'acidità. Dopo l'aggiunta di NaOH, la soluzione dovrebbe diventare arancione in rosa chiaro, indicandone la neutralizzazione.
5. Miscela di idrogel e preparazione cellulare
   NOTA: In questo passaggio, viene eseguita l'incapsulamento delle cellule all'interno dell'idrogel a base di collagene. Le cellule, così come tutti i precursori dell'idrogel, devono essere posizionate sul ghiaccio durante i passaggi successivi.
   1. A questo punto, se i FF non sono ancora stati tripsinato, conservare la sospensione CM in un tubo di centrifuga da 15 mL, con il coperchio svitato per consentire il flusso di gas, all'interno di un incubatore a 37 °C. In parallelo, dissociare i FF e raccogliere ad una densità di 75 x 10⁶ celle/mL per il caricamento del dispositivo.
   2. Mescolare le macchine virtuali sospese con i PDF con un rapporto 4:1. Prendere un'aliquota di 8 μL di MACCHINE e aggiungere a un tubo di centrifuga fresco sul ghiaccio. Quindi prendere 2 μL di FF e aggiungere alla sospensione cellulare nel tubo di centrifuga.
   3. Rimescolare la sospensione cellulare, afferrare 5,6 μL della sospensione cellulare e metterla in un tubo di microcentrifugo fresco.
   4. Prendere 4 μL del collagene appena preparato nei passaggi precedenti e aggiungere a una miscela CM:CF 4:1. Aggiungere 2,4 μL di matrice di membrana basale GFR (Growth Factor Reduced), rendendo la densità cellulare finale come 35 x 10⁶ celle/mL per l'iniezione del dispositivo. Pipettare la miscela su e giù per garantire che la sospensione cellulare sia omogenea.
6. Inserimento del dispositivo
   NOTA: Una volta preparata la miscela cell:hydrogel, deve essere inserita nei dispositivi.
   1. Esegnare i dispositivi microfluidici autoclavati dal forno a 80 °C e impostarli nell'armadio Biosafety per almeno 1 h prima dell'inserimento della sospensione cellulare per consentire ai dispositivi di raffreddarsi a temperatura ambiente mantenendo la sterilità.
   2. Posizionare i dispositivi in 60 x 15 mm di piastre di Petri, a 3-4 dispositivi per piatto. Riempire una piastra di Petri da 150 x 15 mm con uno strato sottile DI H₂O per contenere 3 delle piastre petri da 60 x 15 mm. Questo passaggio crea un ambiente umidificato che circonda i dispositivi microfluidici.
   3. Utilizzare una nuova punta e rimpiorsi accuratamente la miscela di cellule:idrogel pipettando la sospensione mentre il tubo rimane sul ghiaccio.
   4. Inserire la punta nella porta di iniezione del dispositivo e iniettare lentamente e costantemente 3 μL della sospensione della cellula:idrogel nell'ingresso della regione tissutale di un dispositivo microfluidico utilizzando una punta di pipetta da 20 μL. Una volta riempita la porta, interrompere l'iniezione e rimuovere la punta. Ripetere per tutti i dispositivi o l'intera sospensione idrogel preparata.
      NOTA: Il piccolo volume delle sospensioni della cella:idrogel si riscalda / si raffredda molto rapidamente, quindi è pertinente mantenere la sospensione sul ghiaccio il più a lungo possibile. Durante l'inserimento, pipettare la soluzione dal ghiaccio e inserire nei dispositivi il più rapidamente possibile, poiché l'idrogel può iniziare a polimerizzare nella punta della pipetta. È importante creare piccoli volumi della sospensione della cellula: idrogel alla volta, quindi se molti dispositivi devono essere iniettati, la sospensione cell:hydrogel dovrà essere resa fresca per ogni set di 4 dispositivi.
   5. Capovolgere i dispositivi all'interno delle loro piastre di Petri con una pinzetta e posizionarli all'interno della grande piastra di Petri con acqua. Incubare in un incubatore a 37 °C per 9 minuti per la polimerizzazione dell'idrogel.
   6. Eserti i dispositivi dall'incubatrice, capovolgere i dispositivi in posizione verticale e incubare a 37 °C per 9 minuti per completare la polimerizzazione dell'idrogel.
   7. Iniettare RPMI + B27 + insulina nei canali dei supporti di fianco (~ 20 μL per dispositivo). Riposizionare i dispositivi nell'incubatore a 37 °C. Cambia il supporto all'interno dei canali multimediali con RPMI + B27 + insulina fresca ogni giorno. È stato dimostrato che i dispositivi sono coltivati da 14-21 giorni²⁰.
      NOTA: A causa del piccolo volume di supporti per chip, per prevenire l'evaporazione dei supporti, è importante mantenere i dispositivi all'interno di una grande piastra di Petri riempita con DI H₂O, che funge da camera umidificata. Inoltre, piccole goccioline di RPMI + B27 + insulina in eccesso possono essere pipettate sulla parte superiore delle entrate / uscite del canale durante i cambiamenti di routine dei supporti.

4. Analisi dei tessuti

1. Imaging dal vivo
   NOTA: Tutte le immagini dal vivo devono essere eseguite con un incubatore di stadio per mantenere 37 °C e 5% CO₂.
   1. Posizionare i dispositivi in un incubatore di palcoscenico controllato dall'ambiente. Registra video 30 s di più punti all'interno di ogni dispositivo alla massima frequenza fotogrammi.
   2. Per valutare la contrattilità tissutale dopo aver estratto i segnali di battitura, utilizzare il codice MATLAB scritto su misura supplementare per estrarre i picchi (File supplementare 2) per calcolare la variabilità dell'intervallo inter-beat.
   3. Cambiare i supporti nei dispositivi nel cofano di coltura cellulare, quindi riposizionare nell'incubatore di coltura cellulare.
2. Colorazione immunofluorescente
   1. Preparare PBS-Glicina: Sciogliere la glicina da 100 mM in PBS e aggiungere lo 0,02% di NaN_{3 per} lo stoccaggio a lungo termine. Regolare il pH a 7,4.
   2. Preparare PBS-Tween-20: aggiungere lo 0,05% di Interpolazione-20 al PBS e aggiungere lo 0,02% di NaN_{3 per} lo storage a lungo termine. Regolare il pH a 7,4.
   3. Preparare il buffer IF: aggiungere 0,2% Triton X-100, 0,1% BSA e 0,05% Tween-20 a PBS e aggiungere 0,02% NaN_{3 per} l'archiviazione a lungo termine. Regolare il pH a 7,4.
   4. Preparare il siero di capra al 10%: Resuspend il siero di capra lyophilized in 2 mL di PBS per fare il siero di capra al 100%. Quindi, diluire i 2 mL con 18 mL di PBS per fare il 10% di siero di capra.
   5. Fissare i campioni aggiungendo il 4% di paraformaldeide (PFA) ai canali tissutali e incubando a 37 °C per 20 min.
   6. Lavare le cellule aggiungendo PBS-Glicina ai canali tissutali 2x per 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente.
   7. Lavare le celle aggiungendo PBS -Tween-20 per 10 minuti a temperatura ambiente.
   8. Permeabilizzare le cellule aggiungendo il buffer IF ai canali tissutali per 30 minuti a temperatura ambiente.
   9. Bloccare le cellule aggiungendo una soluzione di siero di capra al 10% ai canali tissutali per 1 h a temperatura ambiente.
   10. Diluire gli anticorpi primari non coniugati nel siero di capra al 10% alle concentrazioni desiderate (fare riferimento al file complementare 3), aggiungere ai canali tissutali e incubare i campioni a 4 °C durante la notte.
   11. Il giorno seguente, lavare i campioni aggiungendo PBS-Tween-20 ai canali tissutali 3 volte per 20 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
       NOTA: Dal passaggio 4.2.12 in su, eseguire tutte le attività al buio, in modo che i campioni siano protetti dalla luce.
   12. Diluire gli anticorpi secondari in PBS-Tween-20 alle concentrazioni desiderate, centrifugare a 10.000 x g per 10 minuti per raccogliere eventuali precipitati, quindi aggiungere ai canali tissutali.
   13. Dopo 30 min-1 h, lavare i campioni con PBS-Tween-20 3x per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
   14. Aggiungere il mezzo di montaggio anti dissolvenza o desiderato ai canali tissutali. Quindi, i campioni possono essere immagini utilizzando la microscopia a fluorescenza o con un microscopio confocale, se si desidera un ingrandimento più elevato. Per visualizzare l'intero tessuto 3D, le immagini su diversi piani Z possono essere impilate e ricostruite per formare immagini 3D rappresentative.

Per ottenere una popolazione altamente purificata di MACCHINE dagli hiPSC, viene utilizzata una versione modificata che coinvolge una combinazione del protocollo di differenziazionelian 33 e dei passaggi di purificazione di Tohyama34 (fare riferimento alla figura 1A per la sequenza temporale sperimentale). Gli iPSC devono essere simili a colonie, ~85% confluenti e distribuiti uniformemente in tutta la cultura ben 3-4 giorni dopo il passaggio, all'inizio della differenziazione CM (Figura 1B). In particolare, il giorno 0, le colonie hiPSC dovrebbero avere un'alta espressione di fattori di trascrizione a pluripotenza, tra cui SOX2 e Nanog (Figura 1C). Sulla base di questo protocollo, la prova di un processo di differenziazione e purificazione delle cellule staminali di successo è dimostrata nella figura 1D, con dense colonie di MACCHINE che esprimono α-actina sarcomerica, con un ambiente minimo di non MACCHINE. Inoltre, gli hRF devono mantenere una morfologia dei fibroblasti ad alta espressione di vimentina (Figura 1E), quindi devono essere utilizzati prima di P10 in quanto possono iniziare a differenziarsi dai miofibroblasti ai passaggisuperiori 29.

Per mantenere la robustezza di questo protocollo, è pertinente implementare la ripiazza delle macchine hiPSC-C dopo la purificazione metabolica. A causa della presenza di cellule morte e detriti che si verificano dalla fame di glucosio, le MACCHINE necessitano di un ulteriore passo di purificazione per massimizzare la purezza e la salute del CM prima dell'uso nell'esperimento; pertanto, la rimpiazzamento viene utilizzata in quanto aiuta ad allentare i detriti / non-CRM morti(figure 2A-B, video 1-2). Il video 1 mostra una popolazione di esempio di MACCHINE prima della riprotezione, presentando un'elevata purezza di MACCHINE in più strati, tuttavia con molti detriti presenti sulle cellule e galleggianti nei supporti a causa della purificazione implementata. Di conseguenza, video 2 mostra la stessa popolazione di MACCHINE immediatamente dopo la piastra, presentando le MACCHINE in un monostrato con significativamente meno detriti, dimostrando gli effetti della digestione tissutale e della dissociazione a singola cellula che si verificano durante la piastratura.

Dopo l'inserimento dell'idrogel incorporato nella cella nel dispositivo microfluidico (cioè chip; immagine inserita nella figura 3), le cellule sono dense e uniformemente distanziate in tutti i pali. Le cellule iniziano a diffondersi al primo giorno (Figura 3A), quindi entro il giorno 7 riprendono a battere e diventano più sincrone nei loro schemi contrattili (Figura 3B). Inoltre, i tessuti 3D si condensano intorno ai pali per formare pori ellittici ripetuti e le cellule si allungano. Entro il giorno 14, i tessuti maturi mostrano un alto grado di anisotropia (cioè organizzazione direzionale), composta da cellule con forma allungata(figure 3C, 4A),sarcomere striate e allineate e giunzioni gap localizzate(Figura 4B). Inoltre, i modelli contrattili spontanei di questi tessuti sono altamente sincroni(Figura 4C, Video 3) a causa della natura interconnessa e allineata delle cellule cardiache.

Figura 1: Immagini sperimentali schematiche e rappresentative della morfologia cellulare durante la preparazione per l'iniezione del dispositivo: Schema del protocollo, che descrive i passaggi successivi alla fabbricazione del dispositivo microfluidico, dalla coltura hiPSC alla formazione di tessuto cardiaco microfluidico (A). gli iPSC devono mantenere una morfologia simile a una colonia (B) e un'alta espressione di marcatori di pluripotenza (SOX2, verde; Nanog, rosso) (C) all'inizio della differenziazione. Dopo la differenziazione hiPSC-CM, dovrebbero esserci abbondanti e dense macchie di MACCHINE, macchiate di alfa-actina sarcomerica (SAA, verde), con un ambiente minimo non-CRM, come evidenziato dalla colorazione vimentina (vim, rosso)(D). hCF deve presentare alti livelli di espressione di vimentina e mantenere la morfologia dei fibroblasti (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: popolazioni hiPSC-CM durante le ultime fasi di differenziazione: Il processo di purificazione provoca la morte di non-CRM, producendo detriti nella coltura cellulare, presenti prima della ripiazza cm (A). Dopo lariproteggiatura (B),i detriti e i non CRM vengono slogati, servendo a purificare ulteriormente la popolazione cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Formazione di tessuto 3D cardiaco umano all'interno del dispositivo microfluidico: Il giorno successivo all'iniezione nel dispositivo (mostrato nell'interno in alto a sinistra, accanto al centesimo statunitense per la scala), le cellule inizieranno a diffondersi e saranno dense e distribuite in modo omogeneo in tutto il dispositivo (A). Dopo una settimana di coltura, le cellule riprenderanno spontaneamente a battere e formare tessuti condensati e allineati (B). Entro due settimane di coltura, le cellule formano tessuti condensati e allineati attorno ai pali ellittici (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Caratteristiche rappresentative del tessuto cardiaco umano dopo la coltura per 14 giorni nel dispositivo microfluidico: Le cellule hanno formato tessuti allungati e altamente allineati, come indicato dalla colorazione actina (A). I sarcomeri sono paralleli e striati, e c'è la localizzazione delle giunzioni gap come evidenziato dalla colorazione per la α-actina sarcomerica (SAA) e la connexina 43 (CX43), rispettivamente (B). La contrazione spontanea è sincrona (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Contrazione spontanea di hiPSC-CRM il giorno 21 dopo la purificazione del lattato e prima della rimpiazzatura Fare clic qui per scaricare questo video.

Video 2: Contrazione spontanea di hiPSC-CRM il giorno 23 dopo la ripiazza Si prega di fare clic qui per scaricare questo video.

Video 3: Contrazione sincrona e spontanea del tessuto cardiaco umano all'interno del dispositivo per 14 giorni Fare clic qui per scaricare questo video.

Fascicolo complementare 1: File AutoCAD per dispositivo heart on-a-chip Fare clic qui per scaricare questo file.

Fascicolo complementare 2: Programma MATLAB per estrarre i picchi per determinare la variabilità dell'intervallo inter-beat dai segnali di battiaggio Fare clic qui per scaricare questo file.

Fascicolo complementare 3: Tabella degli anticorpi primari e secondari Fare clic qui per scaricare questo file.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.