Qui descriviamo le fasi di raccolta e preparazione dei campioni per RIBO-seq nei batteri. Il sequenziamento delle biblioteche elaborate secondo queste linee guida si traduce in dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è semplice, utilizza attrezzature di laboratorio standard e richiede sette giorni dalla lisi all'ottenimento delle biblioteche.
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Articolo metodologico
RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tecnica di profilazione ribosoma (RIBO-seq) è attualmente lo strumento più efficace per studiare il processo di sintesi proteica in vivo. Il vantaggio di questo metodo, rispetto ad altri approcci, è la sua capacità di monitorare la traduzione mappando con precisione la posizione e il numero di ribosomi su una trascrizione di mRNA.
In questo articolo, descriviamo le fasi consecutive della raccolta e della preparazione dei campioni per il metodo RIBO-seq nei batteri, evidenziando i dettagli rilevanti per la pianificazione e l'esecuzione dell'esperimento.
Poiché il RIBO-seq si basa su ribosomi intatti e mRNA correlati, il passo chiave è la rapida inibizione della traduzione e un'adeguata disintegrazione delle cellule. Pertanto, suggeriamo la filtrazione e il congelamento flash nell'azoto liquido per la raccolta cellulare con un pretrattamento opzionale con cloramfenicolo per arrestare la traduzione nei batteri. Per la disintegrazione, proponiamo la macinazione di cellule congelate con malta e pestello in presenza di ossido di alluminio per interrompere meccanicamente la parete cellulare. In questo protocollo non è richiesto un cuscino di saccarosio o un ultracentrifugazione gradiente di saccarosio per la purificazione monosomatica. Invece, viene applicata la separazione dell'mRNA utilizzando l'elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGE) seguita dall'escissione dell'impronta ribosomiale (banda 28-30 nt) e fornisce risultati soddisfacenti. Ciò semplifica in gran parte il metodo e riduce i tempi e i requisiti delle apparecchiature per la procedura. Per la preparazione della biblioteca, si consiglia di utilizzare il piccolo kit di RNA disponibile in commercio per il sequenziamento Illumina da New England Biolabs, seguendo le linee guida del produttore con un certo grado di ottimizzazione.
Le librerie cDNA risultanti presentano la quantità e la qualità appropriate necessarie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Il sequenziamento delle librerie preparate secondo il protocollo descritto comporta da 2 a 10 mln letture mappate in modo univoco per campione fornendo dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è rapido e relativamente semplice e può essere eseguito con apparecchiature di laboratorio standard.
Introduzione
La tecnica di profilazione ribosoma (RIBO-seq) è stata sviluppata nel laboratorio di Jonathan Weissman presso l'Università della California, San Francisco1. Rispetto ad altri metodi usati per studiare l'espressione genica a livello traslazionale, RIBO-seq si concentra su ogni legame ribosoma all'mRNA e fornisce informazioni sulla sua posizione e sul numero relativo di ribosomi su una trascrizione. Consente di monitorare il processo di sintesi proteica in vivo e può fornire una risoluzione e una precisione del codone singolo consentendo la misurazione della densità ribosoma su entrambi, il singolo mRNA e lungo l'intero trascrittame nell....
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Protocollo
1. Raccolta dei campioni
- Preparare una coltura batterica. Si consiglia un volume di coltura di 100 mL per campione.
- Preparare attrezzature e reagenti per la raccolta dei campioni: due scoopula per campione, filtri sterili a membrana di cellulosa mista (MCE) da 0,45 μm, tubi sterili da 50 ml, azoto liquido, 50 mg/mL di cloramfenicolo nel 70% (vol/vol) di etanolo (facoltativo). Forare il coperchio di tubi da 50 ml per consentire l'evaporazione dell'azoto liquido e prevenire l'esplosione di tubi chiusi. Scoopulas decontaminati con detergente da laboratorio e 70% etanolo.
- Prewarm l'apparecchiatura filtrante e una delle scoopulas alla temperat....
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Risultati
I risultati esemplari qui presentati sono stati ottenuti in uno studio che esamina la regolazione della traduzione nelle cellule subtili sporulate di Bacillus bacillus. Le colture notturne sono state diluite in OD600 pari a 0,1 in 100 mL di mezzo ricco e incubate a 37 °C con scuotimenti vigorosi fino a quando L'OD600 ha raggiunto 0,5-0,6. Il ricco mezzo è stato quindi sostituito con un mezzo minimo per indurre il processo di sporulazione e l'incubazione è stata continuata per un massimo di .......
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Discussione
La sfida tecnica chiave della profilazione ribosoma è la necessità di inibire rapidamente la traduzione al fine di catturare un'istantanea dei ribosomi sugli mRNA in un particolare stato fisiologico di interesse. A tal fine, vengono comunemente utilizzati inibitori della traduzione, raccolta rapida e congelamento flash nell'azoto liquido. L'applicazione di antibiotici è facoltativa poiché possono causare artefatti. Il cloramfenicolo è un farmaco comunemente usato per arrestare i ribosomi allunganti nel ribo-seq batterico.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
ALS desidera riconoscere il sostegno finanziario delle sovvenzioni per l'installazione EMBO IG 3914 e POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 realizzato nell'ambito del programma First TEAM della Fondazione per la scienza polacca cofinanziato dall'Unione europea nell'ambito del Fondo europeo di sviluppo regionale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10X TBE (polvere) | Invitrogen | AM9864 | |
| 2-Mercaptoetanolo, 99%, puro | Acros Organics | 125472500 | |
| Adenosina 5'-Trifosfato (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| Ossido di alluminio calcinato puro p.a. | Chempur | 114560600 | |
| Cloruro di calcio diidrato | Sigma-Aldrich | C3881-500G | |
| Cloramfenicolo | MP Biomedicals | 190321 | |
| DNA Clean & Concentratore -5 | Zymo Research | D4004 | |
| Dnase I ricombinante, senza RNASI | Roche | 4716728001 | |
| EDTA sale disodico | Fisher Scientific | E/P140/48 | |
| Alcol etilico Assoluto 99,8% Pure-P.A.-Basic | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | BA6480111 | |
| Apparecchio di filtrazione | VWR Collection | 511-0265 | Apparecchio di filtrazione interamente in vetro, con imbuto, base fritta, tappo, 47 mm Ø morsetto a molla e pallone di giunzione rettificato |
| Gel 40 (19:1) | Rotiphorese | 3030.1 | |
| Gel Loading Dye, blu, 6X | New England Biolabs | E6138G | |
| Guanosina 5′-[β,γ-imido]trifosfato sale trisodico idrato | Sigma-Aldrich | G0635-25MG | |
| labZAP | A& A Biotechnology | 040-500 | |
| Acetato di magnesio tetraidrato | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Assemblatore di membrana MCE | Tecnologia Alfatec | M47MCE45GWS | dimensione dei pori: 0,45 um |
| MICROBExpress Purificazione dell'mRNA batterico | Invitrogen | AM1905 | |
| Set di preparazione della libreria di piccoli RNA multiplex per Illumina | New England Biolabs | E7300S | |
| Acqua senza nucleasi | Ambion | AM9937 | |
| Acetato di potassio anidro P.A. | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | 744330113 | |
| Caricamento rapido pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | E7323A | |
| RNA Clean & Concentratore -25 | Zymo Research | R1018 | |
| Acetato di sodio | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Carbonato di sodio | Sigma-Aldrich | 223530-500G | |
| Carbonato acido di sodio puro p.a. | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | 810530115 | |
| SYBR Gold colorante in gel di acido nucleico | Life Technologies | S11494 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| TBE-Urea Sample Buffer (2x) | Invitrogen | LC6876 | |
| Tris(idrossimetil)amminometano, ultrapuro, 99,9% | AlfaAesar | J65594 | |
| Triton X-100, 98% | Acros Organics | 327371000 | |
| Urea G.R. | lach:ner | 40096-AP0 |
Riferimenti
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on t....
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Ristampe e permessi
