Method Article

Quantificazione delle densità cellulari e delle proprietà antigeniche mediante levitazione magnetica

DOI:

10.3791/62550

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May 17th, 2021

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1Nano Flow Core Facility, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Division of Allergy and Inflammation, Beth Israel Deaconess Medical Center

In This Article

Summary

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Questo documento descrive un metodo basato sulla levitazione magnetica in grado di rilevare specificamente la presenza di antigeni, solubili o legati alla membrana, quantificando i cambiamenti nell'altezza di levitazione delle perle di cattura con densità fisse.

Abstract

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Il metodo descritto è stato sviluppato sulla base dei principi della levitazione magnetica, che separa cellule e particelle in base alla loro densità e proprietà magnetiche. La densità è una proprietà identificativa del tipo cellulare, direttamente correlata al suo tasso metabolico, differenziazione e stato di attivazione. La levitazione magnetica consente un approccio in un unico passaggio per separare, visualizzare e caratterizzare con successo le cellule del sangue circolanti e rilevare anemia, anemia falciforme e cellule tumorali circolanti in base alla densità e alle proprietà magnetiche. Questo approccio è anche suscettibile di rilevare antigeni solubili presenti in una soluzione utilizzando set di perline a bassa e alta densità rivestite rispettivamente con anticorpi di cattura e rilevamento. Se l'antigene è presente in soluzione, colmerà le due serie di pere, generando un nuovo complesso perla-perla, che levita tra le file di pere rivestite di anticorpi. L'aumento della concentrazione dell'antigene bersaglio in soluzione genererà un numero maggiore di complessi pere-pere rispetto a concentrazioni inferiori di antigene, consentendo così misurazioni quantitative dell'antigene bersaglio. La levitazione magnetica è vantaggiosa per altri metodi a causa della diminuzione del tempo di preparazione del campione e della mancanza di dipendenza dai metodi di lettura classici. L'immagine generata viene facilmente catturata e analizzata utilizzando un microscopio standard o un dispositivo mobile, come uno smartphone o un tablet.

Introduction

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La levitazione magnetica è una tecnica sviluppata per separare, analizzare e identificare i tipi di cellule1,2,3,le proteine4,5 e gli oppioidi6 basandosi esclusivamente sulla loro densità specifica e proprietà paramagnetiche. La densità cellulare è una proprietà intrinseca unica di ciascun tipo di cellula direttamente correlata al suo tasso metabolico e allo stato di differenziazione7,8,9,

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Protocol

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Il protocollo sperimentale utilizzato in questo studio è stato approvato dal Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Configurazione dello strumento

NOTA: l'imaging delle cellule levitanti richiede che due magneti al neodimio delle terre rare magnetizzati sull'asse z siano posizionati con lo stesso polo uno di fronte all'altro per generare un campo magnetico. La distanza tra i magneti può essere personalizzata in base all'intensità del campo magnetico e alla densità dei bersagli. In questo caso i magneti sono separati da uno spazio di 1mm sufficiente per l'inserimento di un tubo cap....

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Results

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La levitazione magnetica focalizza oggetti di densità diverse a diverse altezze di levitazione a seconda della densità dell'oggetto, della sua firma magnetica, della concentrazione di soluzione paramagnetica e della forza del campo magnetico creato da due forti magneti in terre rare. Poiché i due magneti sono posizionati uno sopra l'altro, i campioni levitanti possono essere visualizzati solo, pur mantenendo l'illuminazione di Köhler, utilizzando un microscopio girato su un lato (Figura 1). .......

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Discussion

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La centrifugazione a gradiente è attualmente la tecnica standard per isolare i componenti subcellulari in base alle loro densità uniche. Questo approccio, tuttavia, richiede l'uso di mezzi gradienti specializzati e apparecchiature centrifughe. L'approccio a levitazione magnetica qui presentato consente un'indagine dettagliata delle proprietà morfologiche e funzionali delle cellule circolanti, con una manipolazione minima, se non nulla, delle cellule, fornendo un accesso quasi in vivo alle cellule circolanti.

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Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Acknowledgements

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Getulio Pereira per il suo aiuto con il lavoro sulle vescicole extracellulari.

Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni del National Institute of Health all'ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 e UG3TR002881.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acido 2-(N-Morpholino)etansolfonico idratoSigma AldrichM-2933(MES); componente del tampone di attivazione
50x2,5x1 mm magneti, nichelato (Ni-Cu-Ni), grado N52, magnetizzato attraverso 5 mm (0,197") di spessoreK& J Magnetics Magnetipersonalizzatiutilizzati per il dispositivo di levitazione magnetica
Sigillante per tubi capillari (Critoseal)Leica Microsystems267620Utilizzato per tappare le estremità dei tubi capillari
Filtri per tubi da centrifuga (Corning Costar Spin-X)Sigma AldrichCLS8163Utilizzato per lavare le perline
Compact Lab JackThorlabsLJ750Utilizzato per regolare il dispositivo di levitazione magnetica
DPBS, senza calcio, senza magnesioGibco14190-144Soluzione per sospensioni di perline
EtanolamminaSigma AldrichE9508-100MLUtilizzato durante una fase di lavaggio per perline
Colorazione fluorescente della membrana plasmatica (CellMask Green)InvitrogenC37608Utilizzato per colorare le cellule Rh+
Gadoteridol InjectionProHanceNDC 0270-1111-03Gadolinio (Gd3+); soluzione magnetica utilizzata per sospendere le cellule
HBSS++Gibco14025-092Soluzione per la preparazione del campione
Complesso umano C5b,6Complement Technology, IncA122Utilizzato per generare globuli rossi Evs
Proteina C7 umanaComplement Technology, IncA124Utilizzato per generare globuli rossi Evs
Proteina C8 umanaComplement Technology, IncA125Utilizzato per generare globuli rossi Evs
Human C9protein Complement Technology, IncA126Utilizzato per generare RBC Evs
Mini Series Post CollarThorlabsMSR2Utilizzato per garantire il dispositivo di levitazione magnetica alle prese da laboratorio
N-(3-Dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridratoSigma AldrichE1769-10G(EDC); utilizzato nella reazione di accoppiamento anticorpale
Controllonormale delle IgG di coniglioR& D SystemsAB-105-CUtilizzato per rivestire le perle come condizione di controllo
Soluzione salina tamponata con fosfato (soluzione 10X, pH 7,4)Boston BioproductsBM-220Componente del tampone di accoppiamento, utilizzato per le fasi di lavaggio
Polisorbato 20 (Tween 20)Sigma AldrichP7949-500MLComponente del tampone di attivazione
Polistirene carbossilpolimeroBangs LaboratoriesPC06004Perle a densità superiore (1,05 g/mL), utilizzate per l'accoppiamento degli anticorpi
Anticorpo policlonale RhD di coniglioInvitrogenPA5-112694Utilizzato per rivestire le perle per la protezione del fattore Rh nei globuli rossi
Microscopio per la ricercaOlympusProvis AX-70Microscopio utilizzato per montare il dispositivo di levitazione magnetica e visualizzare le cellule in levitazione
Piedini di smorzamento in gommaThorlabsRDF1Utilizzato per sostenere il tavolo della breadboard
Tubo Boro quadratoVitroTubes8100-050Tubo capillare utilizzato per caricare il campione in Maglev
Sulfo-NHSThermoscientific24510Utilizzato nella reazione di accoppiamento degli anticorpi
Stadio traslazionaleThorlabsPT1Utilizzato per la messa a fuoco e per la scansione del tubo capillare

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
  2. Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences o....

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Magnetic LevitationCellular DensityAntigen DetectionBlood Cell SeparationDensity Based SeparationRed Blood CellsAntibody Coated BeadsFluorescent StainingCapillary Tube AssayGadolinium Ion

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