Quantificazione delle densità cellulari e delle proprietà antigeniche mediante levitazione magnetica

Summary

Questo documento descrive un metodo basato sulla levitazione magnetica in grado di rilevare specificamente la presenza di antigeni, solubili o legati alla membrana, quantificando i cambiamenti nell'altezza di levitazione delle perle di cattura con densità fisse.

Abstract

Il metodo descritto è stato sviluppato sulla base dei principi della levitazione magnetica, che separa cellule e particelle in base alla loro densità e proprietà magnetiche. La densità è una proprietà identificativa del tipo cellulare, direttamente correlata al suo tasso metabolico, differenziazione e stato di attivazione. La levitazione magnetica consente un approccio in un unico passaggio per separare, visualizzare e caratterizzare con successo le cellule del sangue circolanti e rilevare anemia, anemia falciforme e cellule tumorali circolanti in base alla densità e alle proprietà magnetiche. Questo approccio è anche suscettibile di rilevare antigeni solubili presenti in una soluzione utilizzando set di perline a bassa e alta densità rivestite rispettivamente con anticorpi di cattura e rilevamento. Se l'antigene è presente in soluzione, colmerà le due serie di pere, generando un nuovo complesso perla-perla, che levita tra le file di pere rivestite di anticorpi. L'aumento della concentrazione dell'antigene bersaglio in soluzione genererà un numero maggiore di complessi pere-pere rispetto a concentrazioni inferiori di antigene, consentendo così misurazioni quantitative dell'antigene bersaglio. La levitazione magnetica è vantaggiosa per altri metodi a causa della diminuzione del tempo di preparazione del campione e della mancanza di dipendenza dai metodi di lettura classici. L'immagine generata viene facilmente catturata e analizzata utilizzando un microscopio standard o un dispositivo mobile, come uno smartphone o un tablet.

Introduction

La levitazione magnetica è una tecnica sviluppata per separare, analizzare e identificare i tipi di cellule^1,2,3,le proteine^4,5 e gli oppioidi⁶ basandosi esclusivamente sulla loro densità specifica e proprietà paramagnetiche. La densità cellulare è una proprietà intrinseca unica di ciascun tipo di cellula direttamente correlata al suo tasso metabolico e allo stato di differenziazione^{7,8,9,10,11, 12,13,14.} Quantificare i cambiamenti sottili e transitori nella densità cellulare durante le condizioni di stato stazionario e durante una varietà di processi cellulari, potrebbe offrire una visione senza pari della fisiologia cellulare e della fisiopatologia. I cambiamenti nella densità cellulare sono associatialla differenziazione cellulare^15,16,alla progressione del ciclo cellulare^9,17,^18,19,all'apoptosi^20,21,22,23e alla trasformazione maligna^24,25,26 . Pertanto, la quantificazione di specifici cambiamenti nella densità cellulare, può essere utilizzata per differenziare tra cellule di diversi tipi, nonché discriminare tra lo stesso tipo di cellule sottoposte a vari processi di attivazione. Ciò consente esperimenti che prendono di mira una particolare sotto-popolazione cellulare, in cui i cambiamenti dinamici nella densità fungono da indicatore del metabolismo cellulare alterato²⁷. Poiché è stato stabilito che una cellula può alterare la sua densità in risposta a un ambiente mutevole⁷, è imperativo misurare la cinetica della cellula in relazione alla sua densità per comprenderla pienamente, che i metodi attuali potrebbero non fornire¹². La levitazione magnetica, d'altra parte, consente una valutazione dinamica delle cellule e delle loro proprietà²⁸.

Le cellule sono diamagnetiche, il che significa che non hanno un momento di dipolo magnetico permanente. Tuttavia, quando esposto a un campo magnetico esterno, viene generato un debole momento di dipolo magnetico nelle cellule, nella direzione opposta del campo applicato. Pertanto, se le cellule sono sospese in una soluzione paramagnetica ed esposte a un forte campo magnetico verticale, levitano lontano dalla sorgente magnetica e si fermano ad un'altezza, che dipende principalmente dalla loro densità individuale. La levitazione diamagnetica di un oggetto confinato al minimo di un campo magnetico disomogeneo è possibile quando sono soddisfatti i due seguenti criteri: 1) la suscettibilità magnetica della particella deve essere inferiore a quella del mezzo circostante e 2) la forza magnetica deve essere abbastanza forte da controbilanciare la forza di galleggiamento della particella. Entrambi i criteri possono essere soddisfatti sospendendo i globuli rossi in un buffer magnetico e creando forti gradienti di campo magnetico con magneti permanenti piccoli, economici e disponibili in commercio¹. La posizione di equilibrio di una particella intrappolata magneticamente su un asse lungo la direzione di gravità è determinata dalla sua densità (relativa alla densità del buffer), dalla sua suscettibilità magnetica (relativa alla suscettibilità magnetica del buffer) e dalla firma del campo magnetico applicato. Poiché la densità e le proprietà magnetiche della soluzione sono costanti in tutto il sistema, le proprietà di densità intrinseca delle cellule saranno il fattore principale che determina l'altezza di levitazione delle cellule, con cellule più dense che levitano più in basso rispetto alle cellule meno dense. Questo approccio utilizza una serie di due perle di riferimento di densità (1,05 e 1,2 g/ml) che ci consentono di utilizzare un'analisi puntuale precisa e rapportometrica per le misurazioni della densità. L'alterazione della concentrazione della soluzione magnetica consente di isolare diverse popolazioni cellulari, come i globuli rossi dai globuli bianchi, poiché la densità delle cellule circolanti è specifica della cellula, eliminando la necessità di protocolli di isolamento o altre manipolazioni cellulari.

La maggior parte dei metodi di rilevamento utilizzati nella ricerca in biologia si basano sull'estrapolazione di specifici eventi di legame in segnali lineari facili da quantificare. Questi metodi di lettura sono spesso complessi e coinvolgono attrezzature specializzate e personale scientifico dedicato. Un approccio volto alla rilevazione di antigeni trovati sulla membrana plasmatica delle cellule o delle vescicole extracellulari o che sono solubili nel plasma, utilizzando uno o due perle rivestite di anticorpi, è qui descritto. Le peri devono essere di densità diverse l'una dall'altra e da quelle dei bersagli interrogati. La presenza dell'antigene bersaglio in un dato biofluido si traduce in un cambiamento specifico e misurabile nell'altezza di levitazione di una cellula antigene-positiva che è legata a un perla di rilevamento. Nel caso di antigeni solubili o vescicole extracellulari, sono legati sia alle perle di cattura che a quelle di rilevamento, formando un complesso perle-perle piuttosto che un complesso perle-cellula. La variazione dell'altezza di levitazione dipende dalla nuova densità dei complessi perle-cella o perla-perla. Oltre alla variazione dell'altezza di levitazione dei complessi, che indica la presenza di antigene nel biofluido, il numero di complessi dipende anche dalla quantità di bersaglio, rendendo la levitazione magnetica anche un approccio quantitativo per il rilevamento dell'antigene²⁴.

Protocol

Il protocollo sperimentale utilizzato in questo studio è stato approvato dal Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Configurazione dello strumento

NOTA: l'imaging delle cellule levitanti richiede che due magneti al neodimio delle terre rare magnetizzati sull'asse z siano posizionati con lo stesso polo uno di fronte all'altro per generare un campo magnetico. La distanza tra i magneti può essere personalizzata in base all'intensità del campo magnetico e alla densità dei bersagli. In questo caso i magneti sono separati da uno spazio di 1mm sufficiente per l'inserimento di un tubo capillare di vetro quadrato 1x1 mm lungo 50 mm. Il dispositivo è stato stampato in 3D utilizzando un design AutoCAD, disponibile su richiesta.

1. Posare il microscopio su un lato, perfettamente orizzontale.
   NOTA: Un microscopio posto in posizione verticale standard non è direttamente adatto per l'imaging di oggetti levitanti a causa delle posizioni dei magneti rispetto al condensatore e all'obiettivo. Questa limitazione può essere aggirata posando il microscopio su un lato, perfettamente orizzontale consentendo al condensatore di focalizzare la luce nel capillare e alla lente dell'obiettivo di immaginare la cellula che levita tra i magneti, pur mantenendo i requisiti di illuminazione di Köhler.
2. Supporta e livella il supporto su un tavolo breadboard usando 2 o 3 jack da laboratorio.
3. Per limitare le vibrazioni, appoggiare il tavolo breadboard con piedini in gomma.
4. Rimuovere il palco e sostituirlo con un jack da laboratorio compatto per regolare l'altezza del dispositivo di levitazione(asse y)e due stadi di traslazione a singolo asse; uno per regolare la messa a fuoco(asse z)e il secondo per la scansione del tubo capillare.
5. Collegare il dispositivo di levitazione magnetica al jack da laboratorio utilizzando due montanti ottici della mini-serie.

2. Legame di Anticorpi a Carbossi-Microparticelle/Perline (Modificato da un protocollo da PolyAn)

NOTA: solo le perle a bassa densità (1,05 g/mL) devono essere rivestite per il rilevamento di Rh(+), ma sia le perle ad alta che a bassa densità sono rivestite per il rilevamento di vescicole extracellulari.

1. Eliminare 1 mg equivalente di sospensione di perline e aggiungere 0,5 mL di tampone di attivazione (50 mM MES (MW195,2, 9,72 mg in 1 mL)) pH 5,0 e 0,001% polisorbato-20).
2. Aggiungere 12 μL di EDC da 1,5 M appena prodotto (MW 191,7, 0,28755 g in 1 mL) e 12 μL di 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g in 1 mL) in acqua ghiacciata.
3. Posizionare i tubi su uno shaker orbitale e agitare vigorosamente per 1 ora a temperatura ambiente per attivare i gruppi carbossilici sulle perle.
4. Interrompere l'attivazione dopo 1 ora aggiungendo 0,5 mL di tampone di accoppiamento (10x PBS o 0,1 M fosfato pH 7-9).
5. Pellet le perline centrifugando a 20.000 x g per 10 min, oppure, se le perline non possono essere pellettizzato, utilizzare un filtro a tubo centrifugo da 0,45 μm. Aspirare il surnatante o flow-through.
6. Lavare le perle con 1 mL di 10x PBS 3 volte come nel passaggio 2.5.
7. Calcolare 25 μg di anticorpi per perle mg e mescolare l'anticorpo desiderato con perle attivate a una concentrazione di anticorpi finali di 0,7-1,0 mg/mL in 10X PBS.
8. Posizionare i tubi su un bilanciere a tubo impostato a bassa velocità. Arrotolare delicatamente i tubi a temperatura ambiente durante la notte per l'accoppiamento.
9. Ripetere il passaggio 2.5 e lavare le perle due volte con 1 mL di PBS 10x.
10. Lavare con 0,5 mL di etanolamina 1 M (98% stock = 16,2 M) in tampone pH 8,0 con 0,02% polisorbato-20 per 1 ora a temperatura ambiente mentre si agita delicatamente.
11. Ripetere il passaggio 2.5 e lavare le perle una volta ogni 1 ml di DPBS. Le perle possono essere conservate in 200 μL di DPBS a 4 °C fino a quando necessario.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. Raccolta e preparazione del sangue per il rilevamento di Rh(+)

1. Utilizzando un dispositivo di lancing con un clic, pungere il dito di un donatore rh (+) e raccogliere 10 μL di sangue in 1 mL di DPBS.
2. Macchiare le cellule Rh+ con una macchia di membrana plasmatica fluorescente. Facoltativamente, aggiungere 1 μL di colorante fluorescente alla sospensione da 1 mL di celle Rh+ (diluizione 1:1000).
3. Incubare le cellule con il colorante fluorescente a 37 °C per 15 min.
4. Pellet le celle ruotando a 5.600 x g per 15 s e lavate 3 volte utilizzando 1 mL di DPBS. Spese in 1 mL di HBSS con calcio e magnesio (HBSS++).
5. Utilizzando il dispositivo di lancing con un clic, pungere il dito di un donatore rh (-) e raccogliere 2 μL di sangue.
   NOTA: Se si preparano più di 2 condizioni, raccogliere abbastanza sangue per aggiungere 1 μL di sangue Rh(-) a ciascun tubo.
6. Preparare le provette sperimentali necessarie: sole pere, controllo IgG, campione.
   1. Perle da sole: aggiungere 174 μL di HBSS++, 1 μL di perle di controllo IgG, 1 μL di perle ad alta densità (1,2 g/mL) e 24 μL di 500 mM Gd³⁺ (60 mM).
   2. Controllo IgG: aggiungere 172 μL di HBSS++, 1 μL di perle di controllo IgG, 1 μL di perle ad alta densità, 1 μL di sangue Rh,1 μL di sospensione ematica Rh+ colorata e 24 μL di 500 mM Gd³⁺.
   3. La provetta del campione aggiunge 172 μL di HBSS++, 1 μL di perle rivestite anti-RhD, 1 μL di perle ad alta densità, 1 μL di Sangue Rh-, 1 μL di Sospensione Ematica Rh(+) colorata e 24 μL di 500 mM Gd^3+.
      NOTA: le perle ad alta densità vengono aggiunte ai campioni Rh come riferimento.

4. Isolamento di PMN per la dimostrazione della separazione cellulare

1. Isolamento dei neutrofili
   1. Prelevare 40 mL di sangue venoso in una siringa da 60 mL contenente 6 mL di citrato di sodio/acido citrico (0,15 M, pH 5,5) e 14 mL di Destro-70 al 6%.
   2. Attendere 50 minuti affinché il sangue si sedimenti.
   3. Stratifica lentamente le cellule del buffy coat sopra 20 ml di Ficoll-Paque spingendo i primi 18 mL attraverso il tubo di raccolta del sangue in un tubo da 50 ml, evitando la contaminazione con globuli rossi sedimentati. Si consiglia di utilizzare un set di raccolta di sangue fresco, per ridurre al minimo la contaminazione con globuli rossi residui rimasti nel tubo di raccolta del sangue originale.
   4. Pellet le celle buffy coat mediante centrifugazione per 20 min a 3.000 x g. I neutrofili e i globuli rossi contaminanti si pellettino sul fondo del tubo. PBMC formerà uno strato bianco sopra Ficoll-Paque.
   5. Trasferire i neutrofili in un nuovo tubo da 50 ml.
   6. Lisi di eventuali globuli rossi residui incubando i neutrofili con 20 mL di soluzione fredda di NaCl allo 0,2% per 25 secondi, seguiti da ulteriori 20 mL di NaCl all'1,6%. La concertazione finale di NaCl dovrebbe essere dello 0,9% (isotonico).
   7. Centrifugare la sospensione per 10 min a 3.000 x g.
   8. Rimuovere il surnatante e risospendare i neutrofili alla concentrazione desiderata.
2. Isolamento dei linfociti
   1. Placcare i PBMC in RPMI con siero inattivato al calore al 5% in piastre di coltura a 6 pozzi.
   2. Incubare le piastre per 1 ora a 37 °C. I monociti aderiranno alla piastra, i linfociti fluttueranno liberamente.
   3. Rimuovere il tampone contenente i linfociti e lavarlo due volte con RPMI.
   4. Sospendare i linfociti alla concentrazione desiderata.
3. Etichettare globuli rossi, PMN e linfociti.
   1. Etichettare ogni tipo di cellula con un colorante fluorescente diverso. Assicurarsi che ogni colorante fluoresce in un canale diverso. Seguire le istruzioni del produttore per ciascuno dei coloranti scelti.

5. Generazione di vescicole extracellulari RBC tramite l'attivazione del complemento

1. Ottenere sangue intero attraverso la venipuntura utilizzando tubi EDTA.
2. Passare il sangue attraverso un filtro per globuli bianchi, quindi centrifugare 3 volte a 500 x g per 10 minuti ciascuno per isolare i globuli rossi. Utilizzare HBSS++ come tampone di lavaggio.
3. Crea aliquote di globuli rossi confezionati da 100 μL in tubi da 1,5 mL e aumenta il volume a 1 mL aggiungendo HBSS++.
4. Aggiungere C5b,6 a una concentrazione finale di 0,18 μg/mL in HBSS++, quindi vortex.
5. Mettere su uno shaker lento a temperatura ambiente per 15 minuti.
6. Aggiungere la proteina C7 ad una concentrazione finale di 0,2 μg/ml. Mescolare invertendo delicatamente il tubo un paio di volte. Non vortice da questo punto in avanti.
7. Posizionare il tubo su uno shaker a tubo impostato a bassa velocità per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Aggiungere la proteina C8 a una concentrazione finale di 0,2 μg/mL e la proteina C9 a 0,45 μg/mL. Mescolare invertendo delicatamente i tubi un paio di volte.
9. Incubare a 37 °C per 30 min.
10. Centrifugare il tubo a 10.000 x g per 10 min.
11. Raccogliere il surnatante contenente EV in un nuovo tubo o in un nuovo tubo. Non muovere il surnatante troppo vicino al pellet cellulare.

6. Analisi delle cellule sul dispositivo di levitazione magnetica

1. Eseguire l'avvio dello strumento in base alle istruzioni del produttore.
2. Caricare 50 μL di campione in un tubo capillare fino a quando il tubo non viene riempito. Sigillare le estremità del tubo capillare con sigillante capillare assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria.
3. Caricare il tubo capillare nel supporto tra i magneti superiore e inferiore. Regola il palco e la messa a fuoco per una visualizzazione ottimale.
   NOTA: Le cellule / perle possono impiegare da 5-20 minuti per raggiungere la loro posizione di equilibrio magnetico in base alla loro densità e alla concentrazione di Gd^3+. Maggiore è la concentrazione di Gd³⁺, più breve è il tempo.

Results

La levitazione magnetica focalizza oggetti di densità diverse a diverse altezze di levitazione a seconda della densità dell'oggetto, della sua firma magnetica, della concentrazione di soluzione paramagnetica e della forza del campo magnetico creato da due forti magneti in terre rare. Poiché i due magneti sono posizionati uno sopra l'altro, i campioni levitanti possono essere visualizzati solo, pur mantenendo l'illuminazione di Köhler, utilizzando un microscopio girato su un lato (Figura 1). ...

Discussion

La centrifugazione a gradiente è attualmente la tecnica standard per isolare i componenti subcellulari in base alle loro densità uniche. Questo approccio, tuttavia, richiede l'uso di mezzi gradienti specializzati e apparecchiature centrifughe. L'approccio a levitazione magnetica qui presentato consente un'indagine dettagliata delle proprietà morfologiche e funzionali delle cellule circolanti, con una manipolazione minima, se non nulla, delle cellule, fornendo un accesso quasi in vivo alle cellule circolanti.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acido 2-(N-Morpholino)etansolfonico idrato	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); componente del tampone di attivazione
50x2,5x1 mm magneti, nichelato (Ni-Cu-Ni), grado N52, magnetizzato attraverso 5 mm (0,197") di spessore	K& J Magnetics Magneti	personalizzati	utilizzati per il dispositivo di levitazione magnetica
Sigillante per tubi capillari (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Utilizzato per tappare le estremità dei tubi capillari
Filtri per tubi da centrifuga (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Utilizzato per lavare le perline
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Utilizzato per regolare il dispositivo di levitazione magnetica
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190-144	Soluzione per sospensioni di perline
Etanolammina	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Utilizzato durante una fase di lavaggio per perline
Colorazione fluorescente della membrana plasmatica (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Utilizzato per colorare le cellule Rh+
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolinio (Gd3+); soluzione magnetica utilizzata per sospendere le cellule
HBSS++	Gibco	14025-092	Soluzione per la preparazione del campione
Complesso umano C5b,6	Complement Technology, Inc	A122	Utilizzato per generare globuli rossi Evs
Proteina C7 umana	Complement Technology, Inc	A124	Utilizzato per generare globuli rossi Evs
Proteina C8 umana	Complement Technology, Inc	A125	Utilizzato per generare globuli rossi Evs
Human C9	protein Complement Technology, Inc	A126	Utilizzato per generare RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Utilizzato per garantire il dispositivo di levitazione magnetica alle prese da laboratorio
N-(3-Dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); utilizzato nella reazione di accoppiamento anticorpale
Controllo	normale delle IgG di coniglioR& D Systems	AB-105-C	Utilizzato per rivestire le perle come condizione di controllo
Soluzione salina tamponata con fosfato (soluzione 10X, pH 7,4)	Boston Bioproducts	BM-220	Componente del tampone di accoppiamento, utilizzato per le fasi di lavaggio
Polisorbato 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Componente del tampone di attivazione
Polistirene carbossilpolimero	Bangs Laboratories	PC06004	Perle a densità superiore (1,05 g/mL), utilizzate per l'accoppiamento degli anticorpi
Anticorpo policlonale RhD di coniglio	Invitrogen	PA5-112694	Utilizzato per rivestire le perle per la protezione del fattore Rh nei globuli rossi
Microscopio per la ricerca	Olympus	Provis AX-70	Microscopio utilizzato per montare il dispositivo di levitazione magnetica e visualizzare le cellule in levitazione
Piedini di smorzamento in gomma	Thorlabs	RDF1	Utilizzato per sostenere il tavolo della breadboard
Tubo Boro quadrato	VitroTubes	8100-050	Tubo capillare utilizzato per caricare il campione in Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Utilizzato nella reazione di accoppiamento degli anticorpi
Stadio traslazionale	Thorlabs	PT1	Utilizzato per la messa a fuoco e per la scansione del tubo capillare