Questo documento descrive un metodo basato sulla levitazione magnetica in grado di rilevare specificamente la presenza di antigeni, solubili o legati alla membrana, quantificando i cambiamenti nell'altezza di levitazione delle perle di cattura con densità fisse.
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Articolo metodologico
Quantificazione delle densità cellulari e delle proprietà antigeniche mediante levitazione magnetica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il metodo descritto è stato sviluppato sulla base dei principi della levitazione magnetica, che separa cellule e particelle in base alla loro densità e proprietà magnetiche. La densità è una proprietà identificativa del tipo cellulare, direttamente correlata al suo tasso metabolico, differenziazione e stato di attivazione. La levitazione magnetica consente un approccio in un unico passaggio per separare, visualizzare e caratterizzare con successo le cellule del sangue circolanti e rilevare anemia, anemia falciforme e cellule tumorali circolanti in base alla densità e alle proprietà magnetiche. Questo approccio è anche suscettibile di rilevare antigeni solubili presenti in una soluzione utilizzando set di perline a bassa e alta densità rivestite rispettivamente con anticorpi di cattura e rilevamento. Se l'antigene è presente in soluzione, colmerà le due serie di pere, generando un nuovo complesso perla-perla, che levita tra le file di pere rivestite di anticorpi. L'aumento della concentrazione dell'antigene bersaglio in soluzione genererà un numero maggiore di complessi pere-pere rispetto a concentrazioni inferiori di antigene, consentendo così misurazioni quantitative dell'antigene bersaglio. La levitazione magnetica è vantaggiosa per altri metodi a causa della diminuzione del tempo di preparazione del campione e della mancanza di dipendenza dai metodi di lettura classici. L'immagine generata viene facilmente catturata e analizzata utilizzando un microscopio standard o un dispositivo mobile, come uno smartphone o un tablet.
Introduzione
La levitazione magnetica è una tecnica sviluppata per separare, analizzare e identificare i tipi di cellule1,2,3,le proteine4,5 e gli oppioidi6 basandosi esclusivamente sulla loro densità specifica e proprietà paramagnetiche. La densità cellulare è una proprietà intrinseca unica di ciascun tipo di cellula direttamente correlata al suo tasso metabolico e allo stato di differenziazione7,8,9,
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Protocollo
Il protocollo sperimentale utilizzato in questo studio è stato approvato dal Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).
1. Configurazione dello strumento
NOTA: l'imaging delle cellule levitanti richiede che due magneti al neodimio delle terre rare magnetizzati sull'asse z siano posizionati con lo stesso polo uno di fronte all'altro per generare un campo magnetico. La distanza tra i magneti può essere personalizzata in base all'intensità del campo magnetico e alla densità dei bersagli. In questo caso i magneti sono separati da uno spazio di 1mm sufficiente per l'inserimento di un tubo cap....
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Risultati
La levitazione magnetica focalizza oggetti di densità diverse a diverse altezze di levitazione a seconda della densità dell'oggetto, della sua firma magnetica, della concentrazione di soluzione paramagnetica e della forza del campo magnetico creato da due forti magneti in terre rare. Poiché i due magneti sono posizionati uno sopra l'altro, i campioni levitanti possono essere visualizzati solo, pur mantenendo l'illuminazione di Köhler, utilizzando un microscopio girato su un lato (Figura 1). .......
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Discussione
La centrifugazione a gradiente è attualmente la tecnica standard per isolare i componenti subcellulari in base alle loro densità uniche. Questo approccio, tuttavia, richiede l'uso di mezzi gradienti specializzati e apparecchiature centrifughe. L'approccio a levitazione magnetica qui presentato consente un'indagine dettagliata delle proprietà morfologiche e funzionali delle cellule circolanti, con una manipolazione minima, se non nulla, delle cellule, fornendo un accesso quasi in vivo alle cellule circolanti.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Getulio Pereira per il suo aiuto con il lavoro sulle vescicole extracellulari.
Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni del National Institute of Health all'ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 e UG3TR002881.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido 2-(N-Morpholino)etansolfonico idrato | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); componente del tampone di attivazione |
| 50x2,5x1 mm magneti, nichelato (Ni-Cu-Ni), grado N52, magnetizzato attraverso 5 mm (0,197") di spessore | K& J Magnetics Magneti | personalizzati | utilizzati per il dispositivo di levitazione magnetica |
| Sigillante per tubi capillari (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Utilizzato per tappare le estremità dei tubi capillari |
| Filtri per tubi da centrifuga (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Utilizzato per lavare le perline |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Utilizzato per regolare il dispositivo di levitazione magnetica |
| DPBS, senza calcio, senza magnesio | Gibco | 14190-144 | Soluzione per sospensioni di perline |
| Etanolammina | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Utilizzato durante una fase di lavaggio per perline |
| Colorazione fluorescente della membrana plasmatica (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Utilizzato per colorare le cellule Rh+ |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinio (Gd3+); soluzione magnetica utilizzata per sospendere le cellule |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Soluzione per la preparazione del campione |
| Complesso umano C5b,6 | Complement Technology, Inc | A122 | Utilizzato per generare globuli rossi Evs |
| Proteina C7 umana | Complement Technology, Inc | A124 | Utilizzato per generare globuli rossi Evs |
| Proteina C8 umana | Complement Technology, Inc | A125 | Utilizzato per generare globuli rossi Evs |
| Human C9 | protein Complement Technology, Inc | A126 | Utilizzato per generare RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Utilizzato per garantire il dispositivo di levitazione magnetica alle prese da laboratorio |
| N-(3-Dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); utilizzato nella reazione di accoppiamento anticorpale |
| Controllo | normale delle IgG di coniglioR& D Systems | AB-105-C | Utilizzato per rivestire le perle come condizione di controllo |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (soluzione 10X, pH 7,4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Componente del tampone di accoppiamento, utilizzato per le fasi di lavaggio |
| Polisorbato 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Componente del tampone di attivazione |
| Polistirene carbossilpolimero | Bangs Laboratories | PC06004 | Perle a densità superiore (1,05 g/mL), utilizzate per l'accoppiamento degli anticorpi |
| Anticorpo policlonale RhD di coniglio | Invitrogen | PA5-112694 | Utilizzato per rivestire le perle per la protezione del fattore Rh nei globuli rossi |
| Microscopio per la ricerca | Olympus | Provis AX-70 | Microscopio utilizzato per montare il dispositivo di levitazione magnetica e visualizzare le cellule in levitazione |
| Piedini di smorzamento in gomma | Thorlabs | RDF1 | Utilizzato per sostenere il tavolo della breadboard |
| Tubo Boro quadrato | VitroTubes | 8100-050 | Tubo capillare utilizzato per caricare il campione in Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Utilizzato nella reazione di accoppiamento degli anticorpi |
| Stadio traslazionale | Thorlabs | PT1 | Utilizzato per la messa a fuoco e per la scansione del tubo capillare |
Riferimenti
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences o....
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Ristampe e permessi
