Preparazione di tessuti umani incorporati in un composto di temperatura di taglio ottimale per l'analisi della spettrometria di massa

Summary

Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi con ruoli ben consolidati nelle malattie umane. La caratterizzazione delle alterazioni nei tessuti con spettrometria di massa può rivelare ruoli nell'eziologia della malattia o identificare bersagli terapeutici. Tuttavia, il composto OCT utilizzato per la crioconservazione nei biodepositi interferisce con la spettrometria di massa. Descriviamo metodi per analizzare gli sfingolipidi nei tessuti umani incorporati nell'OCT con LC-ESI-MS / MS.

Abstract

Gli sfingolipidi sono componenti cellulari che hanno ruoli ben consolidati nel metabolismo umano e nella malattia. La spettrometria di massa può essere utilizzata per determinare se gli sfingolipidi sono alterati in una malattia e indagare se gli sfingolipidi possono essere mirati clinicamente. Tuttavia, studi prospettici adeguatamente alimentati che acquisiscono tessuti direttamente dalla suite chirurgica possono richiedere molto tempo e impegnativi dal punto di vista tecnico, logistico e amministrativo. Al contrario, gli studi retrospettivi possono trarre vantaggio da campioni umani crioconservati già disponibili, di solito in gran numero, presso i biodepositi tissutali. Altri vantaggi dell'approvvigionamento di tessuti da biorepository includono l'accesso alle informazioni associate ai campioni di tessuto, tra cui istologia, patologia e in alcuni casi variabili clinicopatologiche, che possono essere utilizzate per esaminare le correlazioni con i dati lipidomici. Tuttavia, le limitazioni tecniche legate all'incompatibilità del composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) utilizzato nella crioconservazione e nella spettrometria di massa rappresentano un ostacolo tecnico per l'analisi dei lipidi. Tuttavia, abbiamo precedentemente dimostrato che l'OCT può essere facilmente rimosso dai campioni di biorepository umani attraverso cicli di lavaggi e centrifugazione senza alterare il loro contenuto di sfingolipidi. Abbiamo anche precedentemente stabilito che gli sfingolipidi nei tessuti umani crioconservati nell'OCT sono stabili fino a 16 anni. In questo rapporto, delineiamo i passaggi e il flusso di lavoro per analizzare gli sfingolipidi nei campioni di tessuto umano incorporati nell'OCT, inclusi il lavaggio dei tessuti, la pesatura dei tessuti per la normalizzazione dei dati, l'estrazione dei lipidi, la preparazione di campioni per l'analisi mediante cromatografia liquida elettrospray ionizzazione tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS / MS), integrazione dei dati di spettrometria di massa, normalizzazione dei dati e analisi dei dati.

Introduction

Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi noti per il loro ruolo nel metabolismo umano e nella malattia ^1,2. Regolano processi cellulari complessi come la migrazione cellulare, la sopravvivenza e la morte cellulare, il movimento cellulare, il traffico vescicolare, l'invasione cellulare e le metastasi, l'angiogenesi e la produzione di citochine 1,2,3,4,5,6,7,8,9

Protocol

I tessuti polmonari umani de-identificati sono stati ottenuti dal Tissue and Data Acquisition and Analysis Core della Virginia Commonwealth University (VCU) nell'ambito di un protocollo approvato (#HM2471) dal comitato di revisione interno (IRB). L'uso di topi per la ricerca e la raccolta di tessuti di topi è stato approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della VCU (IACUC).

1. Preparazione dei materiali

NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti un giorno prima del lavaggio dei tessuti.

1. Pre-etichettare e pesare provette da centrifuga in polipropilene da 1,5 ml con codici ....

Results

In questo protocollo, descriviamo in dettaglio un metodo per rimuovere l'OCT dai tessuti umani crioconservati e pesare i tessuti per l'analisi mediante LC-ESI-MS / MS. I materiali necessari per questa procedura sono elencati nella tabella dei materiali. Mostrati nella Figura 1 sono i risultati di un tipico esperimento in cui 10 tumori dell'adenocarcinoma polmonare umano e 10 tessuti normali adiacenti sono stati lavati per rimuovere l'OCT e analizzati da LC-ESI-MS / MS. È imp.......

Discussion

L'OCT è un comune agente di crioconservazione a lungo termine utilizzato nei biorepository. Tuttavia, l'OCT può provocare la soppressione ionica quando i tessuti vengono analizzati da varie piattaforme di spettrometria di massa^12,13,14,15, o provocare la perdita di segnale quando i campioni vengono analizzati da LC-ESI-MS/MS ¹¹. L'OCT nei tessuti crioconservati può anche.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Puntali per pipette in polipropilene da 1 mL	NA	NA Utilizzato	per recuperare campioni
Provette da centrifuga in polipropilene da 1,5 mL	NA NA PALLONE
DI Erlenmeyer da 10 mL	VWR	89091-116	Utilizzato per la pesatura di provette e tessuti
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	Software per analizzare e integrare i dati MS
Formiato di ammonio	Fisher Scientific	A11550	Per le fasi mobili LC
Bilancia analitica	NA	NA	Scala con una precisione di 0,1 mg
Dosatore per flaconi	Sartorius	LH-723071	Utilizzato per l'erogazione di solventi
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine	Avanti Polar Lipids	LM2212	Standard interno
C12-glucosilceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoil)-1-β-glucosil-sfing-4-eina	Avanti Polar Lipids	LM2511	Standard interno
C12-lattosilceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosil-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	Standard interno
C12-Sfingomielina  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-fosfocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	Standard interno
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
Coperchi di biocontenimento	ClickSeal Thermo Scientific	75007309	Per prevenire i rischi biologici aeresoli durante la centrifugazione
Conflikt	Decon Labs	4101	Decontaminante
CTO-20A / 20AC Forno a colonna	Shimadzu	NA	per LC
d17:1-sfingosina;   (2S,3R,4E)-2-amminoeptadec-4-ene-1,3-diolo	Avanti Polar Lipids	LM2000	Standard interno
d17:1-Sfingosina-1-fosfato; eptadecasfing-4-enine-1-fosfato	Avanti Polar Lipids	LM2144	Degasatore DGU20A5R standard interno
	Shimadzu	NA
Provette per coltura monouso 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm provette
Bagno d'acqua riscaldato	NA	NA Per	l'estrazione notturna dei lipidi
Omogeneizzatore 150	Fisher Scientific	15-340-167	tessuti triturati
Omogeneizzatore Generatore monouso in plastica Sonda	Fisher	Scientific 15-340-177	per omogeneizzazione
Kimwipes	Kimtech	34120	Tessuto da laboratorio utilizzato per realizzare stoppini
Metanolo LC-MS Grado 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD sistema di pompaggio binario	Shimadzu	NA	per LC-MS
Pennarello indelebile	VWR	52877-310
Chiusura con filettatura a vite fenolica, Kimble Chase (tappi per provette di coltura monouso)	VWR	89001-502	Tappi per tubo superiore a vite 13x100 mm
Soluzione salina potenziata con fosfato	Thermo Scientific	10010023	Per recuperare i campioni dalle provette dopo il lavaggio
Pipetta ripetitiva	Eppendorf	4987000118	Per erogare gli standard interni LC-MS
Tappi a vite, blu, rosso PTFE/Bianco Silicone	VWR	89239-020	Tappi per fiale per autoiniettore Fiale
filettatura a vite Fiale in vetro con patch ID	VWR	46610-724	Fiale per autoiniettore
SIL-30AC Autoiniettore	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	Per l'essiccazione di solventi
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Colonna Ascentis Express C18	Sigma Aldrich	581300-U	Per LC-MS
Triple Quad 5500+ Sistema LC-MS/MS	Sciex	NA	Per LC-ESI-MS/MS
Bagno d'acqua ad ultrasuoni	Branson	Modello 2800	per l'omogeneizzazione e la risospensione di lipidi estratti ed essiccati
Vortexer	NA	NA	Per sOCTrP e lipidi secchi risolubili
VWR Provette per coltura VWR Vetro borosilicato monouso	VWR	47729572	13x100 Provette per colture in vetro
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400