Analisi di esperimenti multifattoriali RNA-Seq con DiCoExpress

Sommario

DiCoExpress è uno strumento basato su script implementato in R per eseguire un'analisi RNA-Seq dal controllo di qualità alla co-espressione. DiCoExpress gestisce un design completo e sbilanciato fino a 2 fattori biologici. Questo video tutorial guida l'utente attraverso le diverse funzionalità di DiCoExpress.

Abstract

L'uso corretto della modellazione statistica nell'analisi dei dati NGS richiede un livello avanzato di competenza. Recentemente c'è stato un crescente consenso sull'uso di modelli lineari generalizzati per l'analisi differenziale dei dati di RNA-Seq e il vantaggio dei modelli di miscela per eseguire l'analisi di co-espressione. Per offrire un'impostazione gestita per utilizzare questi approcci di modellazione, abbiamo sviluppato DiCoExpress che fornisce una pipeline R standardizzata per eseguire un'analisi RNA-Seq. Senza particolari conoscenze in statistica o programmazione R, i principianti possono eseguire un'analisi completa di RNA-Seq dai controlli di qualità alla co-espressione attraverso l'analisi differenziale basata sui contrasti all'interno di un modello lineare generalizzato. Un'analisi di arricchimento viene proposta sia sulle liste di geni differenzialmente espressi, sia sui cluster di geni co-espressi. Questo video tutorial è concepito come un protocollo passo-passo per aiutare gli utenti a sfruttare appieno DiCoExpress e il suo potenziale nel potenziare l'interpretazione biologica di un esperimento RNA-Seq.

Introduzione

La tecnologia di sequenziamento dell'RNA di nuova generazione (RNA-Seq) è ora il gold standard dell'analisi del trascrittoma¹. Fin dai primi giorni della tecnologia, gli sforzi combinati di bioinformatici e biostatistici hanno portato allo sviluppo di numerosi metodi che affrontano tutte le fasi essenziali delle analisi trascrittomiche, dalla mappatura alla quantificazione della trascrizione². La maggior parte degli strumenti oggi disponibili per il biologo sono sviluppati all'interno dell'ambiente software R per il calcolo statistico e i grafici³, e molti pacchetti per l'analisi dei dati biologic....

Protocollo

1. DiCoExpress

1. Aprire una sessione di R Studio e impostare la directory su Template_scripts.
2. Aprire lo script DiCoExpress_Tutorial.R in R Studio.
3. Caricare le funzioni DiCoExpress nella sessione R con i seguenti comandi:
   > fonte(".. /Fonti/Load_Functions.R")
   > Load_Functions()
   > Data_Directory = ".. /Dati"
   > Results_Directory = ".. /Risultati/"
4. Caricare i file di dati nella sessione R con i seguenti comandi:
   > Project_Name = "Tutorial"
   > Filter = NULL
   > Sep="\t"
   > Data_Files = Load_Data_Files(Data_Directory, Project_Name, filtro, set)
5. Dividere l'oggetto Data_Files in più oggetti per manipolarli f....

Risultati

Tutti gli output di DiCoExpress vengono salvati nella directory Tutorial/, a sua volta collocata all'interno della directory Results/. Forniamo qui alcune indicazioni per valutare la qualità complessiva dell'analisi.

Controllo Qualità
L'output del controllo di qualità, situato nella directory Quality_Control/, è essenziale per verificare che i risultati dell'analisi RNA-Seq siano affidabili. Il file Data_Quality_Control.pdf contiene diversi grafici ottenuti con dati grezzi .......

Discussione

Poiché l'RNA-Seq è diventato un metodo onnipresente negli studi biologici, vi è una costante necessità di sviluppare strumenti analitici versatili e facili da usare. Un passo fondamentale all'interno della maggior parte dei flussi di lavoro analitici è spesso quello di identificare con sicurezza i geni espressi in modo differenziale tra condizioni biologiche e/o trattamenti¹⁵. La produzione di risultati affidabili richiede un'adeguata modellazione statistica, che è stata la motivazione per lo svil.......