Qui descriviamo un metodo per visualizzare la sinaptogenesi dei neuroni granuli nel cervelletto del topo nel corso dello sviluppo postnatale del cervello quando queste cellule perfezionano le loro strutture sinaptiche e formano sinapsi per integrarsi nel circuito cerebrale generale.
Articolo metodologico
Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi
In questo articolo
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Sommario
Abstract
I neuroni subiscono cambiamenti dinamici nella loro struttura e funzione durante lo sviluppo del cervello per formare connessioni appropriate con altre cellule. Il cervelletto dei roditori è un sistema ideale per tracciare lo sviluppo e la morfogenesi di un singolo tipo di cellula, il neurone granulo cerebellare (CGN), nel tempo. Qui, l'elettroporazione in vivo dei progenitori dei neuroni granuli nel cervelletto di topo in via di sviluppo è stata impiegata per marcare scarsamente le cellule per le successive analisi morfologiche. L'efficacia di questa tecnica è dimostrata nella sua capacità di mostrare le fasi chiave dello sviluppo della maturazione del CGN, con un focus specifico sulla formazione di artigli dendritici, che sono strutture specializzate in cui queste cellule ricevono la maggior parte dei loro input sinaptici. Oltre a fornire istantanee delle strutture sinaptiche CGN durante lo sviluppo cerebellare, questa tecnica può essere adattata per manipolare geneticamente i neuroni granuli in modo autonomo dalla cellula per studiare il ruolo di qualsiasi gene di interesse e il suo effetto sulla morfologia CGN, sullo sviluppo degli artigli e sulla sinaptogenesi.
Introduzione
Lo sviluppo del cervello è un processo prolungato che si estende dall'embriogenesi alla vita postnatale. Durante questo periodo, il cervello integra una combinazione di stimoli intrinseci ed estrinseci che scolpiscono il cablaggio delle sinapsi tra dendriti e assoni per guidare in definitiva il comportamento. Il cervelletto dei roditori è un sistema modello ideale per studiare come si sviluppano le sinapsi perché lo sviluppo di un singolo tipo di neurone, il neurone granulo cerebellare (CGN), può essere monitorato mentre passa da una cellula progenitrice a un neurone maturo. Ciò è dovuto, in parte, al fatto che la maggior parte della corteccia cerebellare si sviluppa ....
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Protocollo
NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Duke University (IACUC).
1. Preparazione del DNA per elettroporazione in vivo o IVE (1 giorno prima dell'intervento)
- Raccogliere i seguenti materiali: DNA purificato (0,5-25 μg per animale), acetato di sodio 3 M, etanolo, colorante Fast Green, acqua distillata ultrapura, soluzione tampone fosfato (PBS) (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Per il DNA, un costrutto che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) sotto un promotore umano dell'ubiquitina è stato ottenuto ....
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Risultati
Figura 4: Analisi della morfologia dei granuli neuronali durante lo sviluppo cerebellare. (A) Immagini di proiezione massima di CGN elettroporate da 3-DPI a 14-DPI (età postnatale da P10 a P21), nuclei (blu) e GFP (verde); Le punte di freccia indicano il singolo dendrite e la barra della scala è di 10 μm. (B) Numero medio di dendriti. (C) L.......
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Discussione
I neuroni dei granuli cerebellari sono i neuroni più abbondanti nel cervello dei mammiferi, costituendo quasi il 60-70% della popolazione totale di neuroni nel cervello dei roditori 1,14. Il cervelletto è stato ampiamente utilizzato per chiarire i meccanismi di proliferazione cellulare, migrazione, formazione di dendriti e sviluppo delle sinapsi. 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) e dal Summer Neuroscience Program (D.G.) della Duke University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cementato 10 &; Ago a L | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1,27 cm (0,5 in), stile a 4 punte |
| Pollo anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Il nostro laboratorio utilizza questo anticorpo a una concentrazione di 1:1000 |
| Applicatore | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Il nostro laboratorio utilizza questo anticorpo a una concentrazione di 1:500 |
| Etanolo (200 prova) | Koptec | V1016 | |
| Elettroporatore ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmide | Addgene | 14883 | |
| Vetrini | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Termoforo | Softheat | ||
| Hoescht 33342 colorante fluorescente | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro vetro di copertura | VWR | 48382-138 | |
| Smalto per unghie | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat siero | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. composto di inclusione | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Cannocchiale da dissezione | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipetta portata punta | Fisherbrand | 02-707-138 | Utilizzato per distanziatore ago |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Tracciante Neurite Semplice | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Istruzioni | |
| Saccarosio | Sigma | S0389 | |
| Strumenti chirurgici | RWD Life Science | Piccole forbici e pinzette | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | detergente non ionico |
| Pinzette | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | Elettrodi da 5 mm placcati in platino |
| Acqua distillata ultrapura | Invitrogen | 10977-015 | |
| Mezzi di montaggio Vectashield | H1000 | ||
| Vetbond adesivo tissutale | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Montante confocale | Zeiss | 780 |
Riferimenti
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in....
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Ristampe e permessi
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Formal Correction: Erratum: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development
Posted by JoVE Editors on 4/06/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.