Immunofenotipizzazione e smistamento cellulare di MK umani da fonti primarie umane o differenziati in vitro da progenitori ematopoietici

Andrea Acebes-Huerta; Patricia Martínez-Botía; Cristina Martín Martín; Ángel Bernardo; Adrián R. Rodríguez; María Carmen Vicente-Ayuso; Celina Benavente Cuesta; Laura Gutiérrez

doi:10.3791/62569

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Articolo metodologico

Immunofenotipizzazione e smistamento cellulare di MK umani da fonti primarie umane o differenziati in vitro da progenitori ematopoietici

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DOI:

10.3791/62569

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7 agosto 2021

Andrea Acebes-Huerta¹ , Patricia Martínez-Botía¹ , Cristina Martín Martín² , Ángel Bernardo¹^,³ , Adrián R. Rodríguez¹ , María Carmen Vicente-Ayuso⁴ , Celina Benavente Cuesta⁵ , Laura Gutiérrez¹^,⁶

¹Platelet Research Lab, Instituto de Investigación Sanitaria del Principado de Asturias (ISPA), ²Flow Cytometry and Cell Sorting Platform (ISPA), ³Clinical Diagnosis Laboratory - Dept. of Hematology, Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA), ⁴Department of Hematology, Hospital Universitario Severo Ochoa (HUSO), ⁵Department of Hematology, Instituto de Investigación Sanitaria San Carlos (IdISSC), Hospital Clínico San Carlos (HCSC), ⁶Dept. of Medicine, University of Oviedo

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo una strategia di immunofenotipizzazione per la caratterizzazione della differenziazione dei megacariociti, e mostriamo come tale strategia consente lo smistamento dei megacariociti in diverse fasi con uno smistatore di cellule attivato dalla fluorescenza. La metodologia può essere applicata ai tessuti primari umani, ma anche ai megacariociti generati in coltura in vitro.

Abstract

La differenziazione dei megacariociti (MK) comprende un certo numero di cicli endomitotici che si traducono in una cellula altamente poliploide (raggiungendo anche >64N) ed estremamente grande (40-60 μm). A differenza della conoscenza in rapida crescita della megacariopoiesi a livello cellulare e molecolare, la caratterizzazione della megacariopoiesi per citometria a flusso è limitata all'identificazione di MK maturi usando marcatori di superficie specifici del lignaggio, mentre i precedenti stadi di differenziazione MK rimangono inesplorate. Qui presentiamo una strategia di immunofenotipizzazione che consente l'identificazione di fasi successive di differenziazione MK, con crescente stato di ploidia, in fonti primarie umane o colture in vitro con un pannello che integra marcatori superficiali specifici e non specifici di MK. Nonostante le sue dimensioni e fragilità, gli MK possono essere immunofenotipati utilizzando il pannello sopra menzionato e arricchiti da smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza in specifiche condizioni di pressione e diametro dell'ugello. Questo approccio facilita gli studi multi-omici, con l'obiettivo di comprendere meglio la complessità della megacariopoiesi e della produzione piastrinica nell'uomo. Una migliore caratterizzazione della megacariopoiesi può essere fondamentale nella diagnosi o nella prognosi di patologie legate al lignaggio e malignità.

Introduzione

I megacariociti (MK) si sviluppano da cellule staminali ematopoietiche (HSC) a seguito di un processo complesso chiamato megacariopoiesi, che è orchestrato principalmente dall'ormone trombopoietina (TPO). La visione classica della megacariopoiesi descrive il viaggio cellulare dagli HSC attraverso una successione di fasi gerarchiche di progenitori impegnati e cellule precursori, portando infine a un MK maturo. Durante la maturazione, gli MK sperimentano più cicli di endomitosi, sviluppano un intricato sistema di membrana di demarcazione intracellulare (DMS), che fornisce una superficie di membrana sufficiente per la produzione di piastrine, e producono e confezionano i....