Articolo metodologico

Identificazione di proteine immunitarie antibatteriche in Escherichia coli utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e analisi proteomica top-down

DOI:

10.3791/62577

⸱

23 maggio 2021

 , 
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un protocollo per la rapida identificazione di proteine prodotte da batteri patogeni sequenziati genomicamente utilizzando la spettrometria di massa tandem MALDI-TOF-TOF e l'analisi proteomica top-down con software sviluppato internamente. Gli ioni proteici metastabili si frammentano a causa dell'effetto dell'acido aspartico e questa specificità viene sfruttata per l'identificazione delle proteine.

Abstract

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Questo protocollo identifica le proteine immunitarie degli enzimi battericidi: colicina E3 e batteriocina, prodotte da un ceppo patogeno di Escherichia coli mediante induzione antibiotica, e identificate dalla spettrometria di massa tandem MALDI-TOF-TOF e dall'analisi proteomica top-down con software sviluppato internamente. La proteina immunitaria della colicina E3 (Im3) e la proteina immunitaria della batteriocina (Im-Bac) sono state identificate da prominenti ioni frammento di tipo b e/o y generati dalla scissione della spina dorsale polipeptidica (PBC) sul lato C-terminale dell'acido aspartico, dell'acido glutammico e dei residui di asparagina mediante il meccanismo di frammentazione dell'effetto dell'acido aspartico. Il software scansiona rapidamente in silico sequenze proteiche derivate dal sequenziamento dell'intero genoma del ceppo batterico. Il software rimuove inoltre iterativamente i residui di amminoacidi di una sequenza proteica nel caso in cui la sequenza proteica matura venga troncata. Una singola sequenza proteica possedeva ioni di massa e frammento coerenti con quelli rilevati per ciascuna proteina immunitaria. La sequenza candidata è stata quindi ispezionata manualmente per confermare che tutti gli ioni frammento rilevati potessero essere assegnati. La metionina N-terminale di Im3 è stata rimossa post-traduzionalmente, mentre Im-Bac ha avuto la sequenza completa. Inoltre, abbiamo scoperto che solo due o tre ioni frammento non complementari formati da PBC sono necessari per identificare la corretta sequenza proteica. Infine, è stato identificato un promotore (SOS box) a monte dei geni antibatterici e immunitari in un genoma plasmidiale del ceppo batterico.

Introduzione

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L'analisi e l'identificazione di proteine non digerite mediante spettrometria di massa è indicata come analisi proteomica top-down1,2,3,4. È ormai una tecnica consolidata che utilizza analizzatori di massa elettrospray (ESI)5 e ad alta risoluzione6e sofisticate tecniche di dissociazione, ad esempio dissociazione a trasferimento di elettroni (ETD), dissociazione a cattura elettronica (ECD)7,fotossociazione ultravioletta (UV-PD)8, ecc.

L'altra tecnica di ionizzazione morbida è il desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI)9,10,11 che è stato meno ampiamente utilizzato per l'analisi top-down, in parte perché è principalmente accoppiato agli analizzatori di massa a tempo di volo (TOF), che hanno una risoluzione limitata rispetto ad altri analizzatori di massa. Nonostante queste limitazioni, gli strumenti MALDI-TOF e MALDI-TOF-TOF sono stati sfruttati per la rapida analisi top-down di proteine pure e miscele frazionate e non frazionate di proteine. Per l'identificazione di proteine pure, il decadimento in-source (ISD) è una tecnica particolarmente utile perché consente l'analisi di spettrometria di massa (MS) di ioni frammento ISD, nonché la spettrometria di massa tandem (MS/MS) di frammenti ionici proteici fornendo frammenti specifici di sequenza spesso dai termini N- e C della proteina bersaglio, analogamente al sequenziamento Edman12,13 . Uno svantaggio dell'approccio ISD è che, come nel sequenziamento di Edman, il campione deve contenere una sola proteina. L'unico requisito proteico è dovuto alla necessità di attribuire in modo inequivocabile gli ioni frammento a uno ione precursore. Se due o più proteine sono presenti in un campione, può essere difficile assegnare quali ioni frammento appartengono a quali ioni precursori.

L'attribuzione di ioni frammento/ione precursore può essere affrontata utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Come con qualsiasi esperimento classico di MS/MS, gli ioni precursori sono selezionati/isolati in massa prima della frammentazione e gli ioni frammento rilevati possono essere attribuiti a uno specifico ione precursore. Tuttavia, le tecniche di dissociazione disponibili per questo approccio sono limitate principalmente alla dissociazione indotta da collisioni ad alta energia (HE-CID)14 o al decadimento post-sorgente (PSD)15,16. HE-CID e PSD sono più efficaci nel frammentare peptidi e piccole proteine e la copertura della sequenza può, in alcuni casi, essere limitata. Inoltre, la PSD provoca la scissione della spina dorsale polipeptidica (PBC) principalmente sul lato C-terminale dei residui di acido aspartico e glutammico da un fenomeno chiamato effetto acido aspartico17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS ha anche trovato un'applicazione di nicchia nell'identificazione tassonomica dei microrganismi: batteri21, funghi22e virus23. Ad esempio, gli spettri MS vengono utilizzati per identificare batteri sconosciuti rispetto a una libreria di riferimento di spettri MS di batteri noti utilizzando algoritmi di riconoscimento dei modelli per il confronto. Questo approccio si è rivelato di grande successo grazie alla sua velocità e semplicità, sebbene richieda una coltivazione notturna dell'isolato. Gli ioni proteici rilevati da questo approccio (di solito sotto i 20 kDa) comprendono un'impronta digitale MS che consente la risoluzione tassonomica a livello di genere e specie e in alcuni casi alla sottospecie24 e al livello di ceppo25,26. Tuttavia, rimane la necessità non solo di classificare tassonomicamente i microrganismi potenzialmente patogeni, ma anche di identificare specifici fattori di virulenza, tossine e fattori di resistenza antimicrobica (AMR). Per raggiungere questo obiettivo, la massa di peptidi, proteine o piccole molecole viene misurata dalla SM e successivamente isolata e frammentata dalla SM / MS.

I batteri patogeni spesso trasportano pezzi circolari di DNA chiamati plasmidi. I plasmidi, insieme ai profagi, sono un importante vettore di trasferimento genico orizzontale tra batteri e sono responsabili della rapida diffusione della resistenza antimicrobica e di altri fattori di virulenza tra i batteri. I plasmidi possono anche trasportare geni antibatterici (AB), ad esempio colicina e batteriocina. Quando questi geni sono espressi e le proteine secrete, agiscono per disabilitare il meccanismo di traduzione proteica dei batteri vicini che occupano la stessa nicchia ambientale27. Tuttavia, questi enzimi battericidi possono anche rappresentare un rischio per l'ospite che li ha prodotti. Di conseguenza, un gene è co-espresso dall'ospite che inibisce specificamente la funzione di un enzima AB e viene indicato come la sua proteina immunitaria (Im).

Gli antibiotici dannosi per il DNA come la mitomicina-C e la ciprofloxacina sono spesso usati per indurre la risposta SOS nell'E. coli produttore della tossina Shiga (STEC) il cui gene della tossina Shiga(stx) si trova all'interno di un genoma di profago presente nel genoma batterico28. Abbiamo utilizzato l'induzione antibiotica, MALDI-TOF-TOF-MS/MS e l'analisi proteomica top-down in precedenza per rilevare e identificare tipi e sottotipi di Stx prodotti dai ceppi STEC29,30,31,32. Nel lavoro precedente, il ceppo STEC O113:H21 RM7788 è stato coltivato durante la notte su mezzi di agar integrati con mitomicina-C. Tuttavia, invece di rilevare la subunità B prevista di Stx2a a m / z ~7816, è stato rilevato uno ione proteico diverso a m / z ~ 7839 e identificato come una proteina ipotetica codificata con plasmidi di funzione sconosciuta33. Nel lavoro attuale, abbiamo identificato due proteine AB-Im codificate con plasmidi prodotte da questo ceppo utilizzando l'induzione antibiotica, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS e l'analisi proteomica top-down utilizzando un software autonomo sviluppato per elaborare e scansionare sequenze proteiche in silico derivate dal sequenziamento dell'intero genoma (WGS). Inoltre, nel software è stata incorporata la possibilità di modifiche post-traduzione (PTM) che comportano il troncamento della sequenza. Le proteine immunitarie sono state identificate utilizzando questo software dalla massa misurata dello ione proteina matura e dagli ioni frammento specifici della sequenza da PBC causati dall'effetto dell'acido aspartico e rilevati da MS / MS-PSD. Infine, è stato identificato un promotore a monte dei geni AB / Im in un genoma plasmidico che può spiegare l'espressione di questi geni quando questo ceppo è esposto a un antibiotico dannoso per il DNA. Parti di questo lavoro sono state presentate al National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17-20 agosto 2020)34.

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Protocollo

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1. Preparazione microbiologica del campione

  1. Inoculare 25 mL di brodo di Luria (LB) in un tubo conico da 50 mL con E. coli O113:H21 ceppo RM7788 (o un altro ceppo batterico) da un ceppo di glicerolo utilizzando un anello sterile da 1 μL. Tappare il tubo e la precoltura a 37 °C con agitazione (200 giri/min) per 4 ore.
  2. Aliquota 100 μL di brodo precolturato e spalmabile su una piastra di agar LB integrata con 400 o 800 ng/mL di mitomicina-C. Coltura di piastre di agar staticamente durante la notte in un incubatore a 37 °C.
    ATTENZIONE: I ceppi STEC sono microrganismi patogeni. Eseguire tutte le manipolazioni microbiologiche, oltre alla coltivazione, in un armadio di biosicurezza BSL-2.
  3. Raccogliere cellule batteriche da singole colonie visibili utilizzando un anello sterile da 1 μL e trasferirle in un tubo microcentrifugale con tappo a vite rivestito con O-ring da 2,0 mL contenente 300 μL di acqua di grado HPLC. Tappare brevemente il tubo, il vortice e centrifugare a 11.337 x g per 2 minuti per pellettizzare le celle.

2. Spettrometria di massa

  1. Individuare l'aliquota di 0,75 μL del surnatante campione sul target MALDI in acciaio inossidabile e lasciarlo asciugare. Sovrapporre il punto del campione essiccato con un'aliquota di a0,75 μL di una soluzione satura di acido sinapinico in acetonitrile al 33%, acqua al 67% e acido trifluoracetico allo 0,2%. Lasciare asciugare il punto.
  2. Analizzare i punti del campione essiccato utilizzando uno spettrometro di massa MALDI-TOF-TOF.
    1. Dopo aver caricato il target MALDI nello spettrometro di massa, fare clic sul pulsante per l'acquisizione della modalità lineare MS nel software di acquisizione. Inserire l'intervallo m/z da analizzare inserendo m/z dei limiti inferiore e superiore (ad esempio, da 2 kDa a 20 kDa) nei rispettivi campi nel software del metodo di acquisizione.
    2. Fare clic sul punto di esempio da analizzare sul modello di destinazione MALDI nel software. Quindi, premere il pulsante sinistro del mouse e trascinare il cursore del mouse sul punto campione per specificare la regione rettangolare da campionare per l'ablazione/ionizzazione laser. Rilascia il pulsante del mouse e l'acquisizione avrà inizio. Raccogli 1.000 colpi laser per ogni punto campione.
      NOTA: l'acquisizione dei dati viene visualizzata in tempo reale nella finestra di acquisizione del software.
    3. Se non vengono rilevati ioni, aumentare l'intensità del laser regolando la barra della scala scorrevole sotto Intensità laser nel software fino a quando non viene rilevato il segnale ionica proteico. Questo è indicato come soglia.
      NOTA: Prima dell'analisi spot del campione, calibrare esternamente lo strumento in modalità lineare MS con calibranti proteici il cui m/z copre l'intervallo analizzato, ad esempio gli stati di carica +1 e +2 dei calibranti proteici: citocromo-C, lisozima e mioglobina coprono un intervallo di massa da 2 kDa a 20 kDa. Una massa intermedia all'interno dell'intervallo di massa specificato viene utilizzata come massa di messa a fuoco, ad esempio 9 kDa. La massa di messa a fuoco è lo ione il cui m/z è focalizzato in modo ottimale per il rilevamento da parte del rilevatore in modalità lineare.
    4. Al termine dell'acquisizione in modalità lineare MS, fare clic sul pulsante per l'acquisizione in modalità reflectron MS/MS nel software di acquisizione. Immettere la massa del precursore da analizzare nel campo Massa precursore. Quindi, inserisci una larghezza di isolamento (in Da) nella finestra di massa del precursore per il lato di massa bassa e alta della massa del precursore, ad esempio ±100 Da.
    5. Fare clic sul pulsante CID Off. Fate clic sul pulsante Soppressore metastabile ON .Metastable Suppressor ON. Regolare l'intensità del laser ad almeno il 90% del suo valore massimo regolando la barra della scala scorrevole sotto l'intensità laser nel software.
    6. Fare clic sul punto di esempio da analizzare sul modello di destinazione MALDI nel software. Quindi premere il pulsante sinistro del mouse e trascinare il cursore del mouse sul punto campione per specificare la regione rettangolare da campionare per l'ablazione/ionizzazione laser. Rilascia il pulsante del mouse e l'acquisizione avrà inizio. Raccogli 10.000 colpi laser per ogni punto campione.
      NOTA: Prima dell'analisi dello spot del campione, lo strumento deve essere calibrato esternamente in modalità MS/MS-reflectron utilizzando gli ioni frammento del decadimento post-sorgente (PSD) dello stato di carica +1 della tioredossina alchilata35.
  3. Non elaborare dati MS grezzi. Elaborare i dati grezzi MS/MS-PSD utilizzando la seguente sequenza di passaggi nell'ordine specificato: correzione avanzata della linea di base (32, 0,5, 0,0) seguita dalla rimozione del rumore (due deviazioni standard) seguita da levigatura gaussiana (31 punti).
  4. Ispezionare manualmente i dati MS/MS-PSD per la presenza di ioni frammento prominenti generati da PBC19,20.
  5. Valutare i dati MS/MS rispetto all'abbondanza assoluta e relativa di ioni frammento e al loro segnale-rumore (S/N). Utilizzare solo gli ioni frammento più abbondanti per l'identificazione delle proteine, specialmente se i dati MS/MS-PSD sono rumorosi.

3. Costruzione del database delle proteine in silico

  1. Generare un file di testo contenente sequenze proteiche in silico del ceppo batterico, che verranno scansionate dal software Protein Biomarker Seeker per l'identificazione della proteina. Le sequenze proteiche sono derivate dal sequenziamento dell'intero genoma (WGS) del ceppo analizzato (o da un ceppo strettamente correlato).
  2. Accedi al sito Web NCBI / PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) per scaricare circa 5.000 sequenze proteiche del ceppo batterico specifico (ad esempio, Escherichia coli O113: H21 ceppo RM7788) analizzato. La dimensione massima di download è di 200 sequenze.
    1. Di conseguenza, copia e incolla i 25 download in un unico file di testo. Selezionare il formato FASTA (testo) per ogni download.

4. Software di ricerca di biomarcatori proteici operativi

  1. Fare doppio clic sul file eseguibile Protein Biomarker Seeker. Apparirà una finestra dell'interfaccia utente grafica (GUI)(Figura 1,pannello superiore).
  2. Immettere la massa del biomarcatore proteico (misurata in modalità MS-lineare) nel campo Massa proteica matura. Quindi, immettere l'errore di misurazione della massa nel campo Tolleranza di massa. L'errore di misurazione della massa standard è ±10 Da per una proteina da 10.000 Da.
  3. Facoltativamente, fare clic sul pulsante Calcolatore di massa proteica b/y complementare per calcolare la massa proteica da una presunta coppia di ioni frammento complementare (CFIP o b/y). Apparirà una finestra pop-up, Protein Mass Calculator Tool,(Figura 1,pannello inferiore).
    1. Inserisci la m/z del CFIP putativo e fai clic sul pulsante Aggiungi coppia. Apparirà la massa proteica calcolata.
    2. Copia e incolla questo numero nel campo Massa proteica matura e chiudi la finestra dello strumento Calcolatore di massa proteica.
  4. Selezionare una lunghezza peptidica del segnale N-terminale facendo clic sulla casella Imposta restrizione residui. Apparirà un pop-up con una scala scorrevole e un cursore. Spostare il cursore sulla lunghezza del peptide del segnale desiderata (massimo 50). Se non è selezionata alcuna lunghezza del peptide del segnale, il software eseguirà un troncamento della sequenza senza restrizioni.
  5. Nella condizione di frammento ionico nella GUI, selezionare i residui per la scissione della spina dorsale polipeptidico (PBC). Clicca sulle caselle di uno o più residui: D, E, N e/o P.
    1. Fare clic sul pulsante Inserisci ioni frammento (+1) da cercare. Apparirà una pagina di frammento pop-up. Quindi, fare clic sul pulsante Aggiungi ione frammento, che corrisponde al numero di ioni frammento da inserire, ovvero un clic per ogni ione frammento. Apparirà un campo a discesa per ogni frammento di ione da inserire.
    2. Immettete m/z degli ioni frammento e la tolleranza m/z associata. Al termine, fai clic sul pulsante Salva e chiudi.
      NOTA: una tolleranza m/z ragionevole è ±1.5.
    3. Selezionare il numero minimo di ioni frammento che devono essere abbinati per un'identificazione scorrendo fino al numero desiderato nella casella a destra di Quanti ioni frammento devono essere abbinati.
      NOTA: tre corrispondenze dovrebbero essere adeguate.
    4. Selezionare i residui di cisteina allo stato ossidato facendo clic sul cerchio corrispondente. Se non vengono trovate identificazioni proteiche dopo la ricerca, ripetere la ricerca con ciste nel loro stato ridotto. Se non vengono trovate identificazioni dopo la ricerca, allargare la tolleranza allo ione del frammento a ±3 e ripetere la ricerca.
  6. Sotto il File Setup, fare clic sul pulsante Seleziona file FASTA per sfogliare e selezionare il file FASTA (testo) contenente le sequenze proteiche in silico del ceppo batterico precedentemente costruito nei passaggi del protocollo da 3.1 a 3.2. Quindi selezionare una cartella di output e creare un nome di file di output.
  7. Fare clic sul pulsante Esegui ricerca su voci di file. Apparirà una finestra pop-up intitolata Conferma parametri di ricerca ( Figura1, pannello inferiore), che visualizza i parametri di ricerca prima dell'avvio della ricerca.
  8. Se i parametri di ricerca sono corretti, fare clic sul pulsante Inizia ricerca. Se i parametri di ricerca non sono corretti, fare clic sul pulsante Annulla e immettere di nuovo i parametri corretti. Una volta avviata la ricerca, la finestra dei parametri si chiude e viene visualizzata una nuova finestra pop-up con una barra di avanzamento(Figura 1,pannello inferiore) che mostra l'avanzamento della ricerca e un conteggio in esecuzione del numero di identificazioni trovate.
  9. Al termine della ricerca (pochi secondi), la barra di avanzamento si chiude automaticamente e un riepilogo della ricerca viene visualizzato nel campo Log della GUI (Figura 2, pannello superiore). Inoltre, apparirà anche una nuova finestra pop-up che mostra le eventuali identificazioni proteiche(Figura 2,pannello inferiore).
    NOTA: Le sequenze proteiche in silico con residui non riconosciuti, ad esempio U o X, vengono automaticamente saltate dall'analisi e queste sequenze vengono successivamente segnalate con una finestra pop-up separata per avvisare l'operatore di quali (eventuali) sequenze sono state saltate al completamento della ricerca.

5. Conferma post-ricerca della sequenza proteica

  1. Confermare la correttezza di una sequenza candidata mediante analisi manuale.
    NOTA: Lo scopo del software Protein Biomarker Seeker è quello di identificare una sequenza proteica con elevata precisione eliminando molte sequenze proteiche ovviamente errate dalla considerazione e incorporando il troncamento della sequenza come possibile PTM nella proteina matura. Poiché il numero di possibili sequenze candidate restituite è esime, la conferma manuale è gestibile.
  2. Generare una tabella della media m/z di ioni frammento di tipo b e y della sequenza candidata utilizzando qualsiasi spettrometria di massa o software proteomico avente tale funzionalità. Confrontare la media m/z di ioni frammento in silico sul lato C-terminale dei residui D-, E-, e N-(e sul lato N-terminale dei residui P) con la m/z di ioni frammento prominenti dai dati MS/MS-PSD.
    NOTA: gli ioni frammento MS/MS-PSD più importanti devono essere facilmente abbinati agli ioni frammento in silico associati a D, E e N. Tuttavia, il meccanismo di frammentazione dell'effetto acido aspartico è meno efficiente vicino ai termini N o C di una sequenza proteica36.

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Risultati

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La Figura 3 (pannello superiore) mostra la MS del ceppo STEC O113:H21 RM7788 coltivato durante la notte su LBA integrato con 400 ng/mL di mitomicina-C. I picchi a m/z 7276, 7337 e 7841 erano stati identificati in precedenza come proteina C (CspC), proteina E (CspE) e una proteina a plasmide di funzione sconosciuta, rispettivamente33. Lo ione proteico a m/z 9780 [M+H]+ è stato analizzato da MS/MS-PSD come mostrato nella Figura 3...

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Discussione

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Considerazioni sul protocollo
I punti di forza principali del protocollo attuale sono la sua velocità, la semplicità di preparazione del campione e l'uso di uno strumento relativamente facile da usare, da addestrare e mantenere. Sebbene l'analisi proteomica bottom-up e top-down mediante cromatografia liquida-ESI-HR-MS sia onnipresente e di gran lunga superiore sotto molti aspetti all'top-down di MALDI-TOF-TOF, richiedono più tempo, lavoro e competenza. La complessità dello strumento può spesso influen...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Il software Protein Biomarker Seeker è disponibile gratuitamente (senza alcun costo) contattando Clifton K. Fagerquist all'clifton.fagerquist@usda.gov. Desideriamo riconoscere il sostegno a questa ricerca da parte di ARS, USDA, CRIS grant: 2030-42000-051-00-D.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Software Explorer serie 4000AB SciexVersione 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF AnalyzerAB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS gradoFisher ChemicalA996-1
BSL-2 armadio a rischio biologicoThe Baker CompanySG403A-HE
Cytochrome-CSigmaC2867-10MG
Software di esplorazione datiAB SciexVersione 4.9
Kit di riduzione-alchilazione delle proteine FocusG-Biosciences786-231
Software GPMAWLighthouse DataVersione 10.0
IncubatoreVWR9120973
LB AgarInvitrogen22700-025
Luria BrodoInvitrogen12795-027
LysozymeSigmaL4919-1G
Provette per microcentrifuga, 2 mL, tappo a vite, O-ringFisher Scientific02-681-343
Centrifuga MiniSpin PlusEppendorf22620207
Mitomicina-C (da streptomyces)Sigma-AldrichM0440-5MG
MioglobinaSigmaM5696-100MG
Agitatore MaxQ 420HP Modello 420Thermo ScientificModello 420
Acido sinapinicoThermo Scientific1861580
Sterile 1 uL anseFisher Scientific22-363-595
Tioredossina (E. coli, ricombinante)SigmaT0910-1MG
Acido trifluoroaceticoSigma-Aldrich299537-100G
Acqua Optima LC/MS gradoFisher ChemicalW6-4

Riferimenti

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