Questo protocollo presenta un flusso di lavoro sperimentale completo per lo studio delle interazioni RNA-proteina utilizzando pinzette ottiche. Sono delineate diverse possibili configurazioni sperimentali, tra cui la combinazione di pinzette ottiche con microscopia confocale.
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Articolo metodologico
Pinzette ottiche per studiare le interazioni RNA-proteina nella regolazione della traduzione
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'RNA adotta diverse pieghe strutturali, che sono essenziali per le sue funzioni e quindi possono avere un impatto su diversi processi nella cellula. Inoltre, la struttura e la funzione di un RNA possono essere modulate da vari fattori trans-agenti, come proteine, metaboliti o altri RNA. Le molecole di RNA frameshifting, ad esempio, sono RNA regolatori situati in regioni codificanti, che dirigono la traduzione dei ribosomi in un frame di lettura aperto alternativo, e quindi agiscono come interruttori genici. Possono anche adottare pieghe diverse dopo il legame a proteine o altri fattori trans. Per analizzare il ruolo delle proteine leganti l'RNA nella traduzione e il modo in cui modulano la struttura e la stabilità dell'RNA, è fondamentale studiare contemporaneamente l'interazione e le caratteristiche meccaniche di questi complessi RNA-proteina. Questo lavoro illustra come impiegare pinzette ottiche accoppiate a singola molecola-fluorescenza per esplorare il panorama conformazionale e termodinamico dei complessi RNA-proteina ad alta risoluzione. Ad esempio, viene elaborata l'interazione dell'elemento di frameshifting ribosomiale programmato SARS-CoV-2 con l'isoforma breve del fattore trans-agente della proteina antivirale zinco-dito. Inoltre, i ribosomi marcati con fluorescenza sono stati monitorati utilizzando l'unità confocale, che alla fine avrebbe permesso lo studio dell'allungamento della traduzione. Il test OT accoppiato a fluorescenza può essere ampiamente applicato per esplorare diversi complessi RNA-proteina o fattori trans-agenti che regolano la traduzione e potrebbe facilitare gli studi sulla regolazione genica basata sull'RNA.
Introduzione
Il trasferimento di informazioni genetiche dal DNA alle proteine attraverso gli mRNA è un processo biochimico complesso, che è regolato con precisione a tutti i livelli attraverso interazioni macromolecolari all'interno delle cellule. Per la regolazione traslazionale, le interazioni RNA-proteina conferiscono un ruolo critico per reagire rapidamente a vari stimoli e segnali1,2. Alcune interazioni RNA-proteina influenzano la stabilità dell'mRNA e quindi alterano il tempo in cui un RNA è attivo per via traslazionale. Altre interazioni RNA-proteina sono associate a meccanismi di ricodifica come il readthrough stop....
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Protocollo
1. Preparazione del campione
- Clonare la sequenza di interesse nel vettore contenente i frammenti di DNA Lambda, che fungono da sequenze di maniglia (Figura 2)43,50.
- Per prima cosa generare un modello di DNA per la successiva trascrizione in vitro tramite PCR (Figura 2B; reazione 1). In questa fase della PCR, il promotore T7 viene aggiunto all'estremità 5' della molecola di DNA del senso32,33,43,50.
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Risultati
In questa sezione, l'attenzione si concentra principalmente sulle misurazioni delle interazioni RNA-proteina/ligando da parte delle pinzette ottiche a fluorescenza. Per una descrizione degli esperimenti generali sulle pinzette ottiche a RNA e dei corrispondenti risultati rappresentativi, vedere32. Per una discussione più dettagliata delle interazioni RNA/DNA-proteina, vedere anche1,2,26,59,60.<.......
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Discussione
Qui, dimostriamo l'uso di pinzette ottiche accoppiate a fluorescenza per studiare le interazioni e il comportamento dinamico delle molecole di RNA con vari ligandi. Di seguito, vengono discussi i passaggi critici e le limitazioni della presente tecnica.
Passaggi critici nel protocollo
Come per molti altri metodi, la qualità del campione è fondamentale per ottenere dati affidabili. Pertanto, per ottenere campioni della massima qualità possibile, vale la pena dedicare del tem.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Anuja Kibe e Jun. Prof. Redmond Smyth per aver esaminato criticamente il manoscritto. Ringraziamo Tatyana Koch per l'assistenza tecnica esperta. Ringraziamo Kristyna Pekarkova per l'aiuto nella registrazione di video sperimentali. Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato dall'Associazione Helmholtz e dal finanziamento della sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca (CER) Nr. 948636 (a NC).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ceppi batterici | |||
| E. coli HB101 | laboratorio | N/A | Clonaggio dei vettori |
| Sostanze chimiche ed enzimi | |||
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | 31424 | Tamponi |
| Biotina-16-dUTP | Roche | 11093070910 | Biotinilazione |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4737 | Tamponi |
| Catalasi | Lumicks | N/A | Sistema di scavazione di ossigeno |
| Ditiotreitolo (DTT) | Melford Labs | D11000 | Tampone |
| DNAsi I da pancreas bovino | Sigma-Aldrich | D4527 | trascrizione in vitro |
| dNTP | Th.Geyer | 11786181 | PCR |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Tamponi |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 11814320001 | Tamponi |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | Sistema di estrazione dell'ossigeno |
| Glucosio-ossidasi | Lumicks | N/A | Sistema di estrazione dell'ossigeno |
| HEPES | Carl Roth | HN78.3 | Tamponi |
| Cloruro di magnesio | Carl Roth | 2189.1 | Tamponi |
| Phusion DNA polimerasi | NEB | M0530L | Assemblaggio Gibson, clonazione |
| Cloruro di potassio | Merck | 529552-1KG | Tamponi |
| PrimeSTAR GXL DNA Polimerasi | Takara Bio Clontech | R050A | PCR |
| Pirofosfosfatasi, termostabile, inorganico | NEB | M0296L | trascrizione in vitro |
| RNasi Inibitore | Tamponi 1000379515 Molox | ||
| rNTPS | life technologies | R0481 | trascrizione in vitro |
| Tiosolofato di sodio | Sigma-Aldrich | S6672-500G | Disattivazione della candeggina |
| Sytox Green | Lumicks | N/A | misure confocali |
| T4 DNA polimerasi | NEB | M0203S | Biotinilazione |
| T5 esonucleasi | NEB | M0363S | Assemblaggio Gibson, clonazione |
| T7 RNA polimerasi | Prodotto internamente | N/A | trascrizione in vitro |
| Taq DNA polimerasi | NEB | M0267S | PCR |
| Taq ligasi | Biozym | L6060L | Assemblaggio Gibson, clonazione |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P7949 | Buffers |
| Kits | |||
| Kit di etichettatura delle proteine Monolith RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) | Nanotemper | MO-L011 | Utilizzato per l'etichettatura dei ribosomi |
| Purefrex 2.0 | GeneFrontier | PF201-0.25-EX | Ribosomi utilizzati per l'etichettatura |
| Oligonucleotidi | |||
| 5' maniglia T7 in avanti | Ordine | personalizzato Microsynth5' - CTTAATACGACTCACTATAGC CTTTCTGTGGACGCC - 3', utilizzato per generare un modello di trascrizione OT in vitro in PCR 1 | |
| 3' maniglia inversa | Microsynth | ordine personalizzato | 5' - GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', utilizzato per generare il modello di trascrizione OT in vitro in PCR 1 |
| 5' maniglia in avanti | Microsynth | ordine personalizzato | 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , utilizzato per generare 5' maniglia in PCR 2 |
| 5' maniglia inversa | Microsynth | ordine personalizzato | 5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', utilizzato per generare 5' maniglia in PCR 2 |
| 3' maniglia in avanti | Microsynth | ordine personalizzato | 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', utilizzato per generare 3' maniglia in PCR 3 |
| 3' maniglia inversa 5' marcato con digoxigenina | Microsynth | ordine personalizzato | 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', utilizzato per generare 3' handle in PCR 3 |
| DNA vectors | |||
| pMZ_OT | prodotto internamente | N/A | ulteriore descrizione in "Gli studi strutturali della proteina Cardiovirus 2A rivelano le basi molecolari per il riconoscimento dell'RNA e il controllo traduzionale" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; DOI: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035 |
| Software e algoritmi | |||
| Atom | https://atom.io/packages/ide-python | N/A | |
| Bluelake | Lumicks | N/A | |
| Graphpad | https://www.graphpad.com/ | N/A | |
| InkScape 0.92.3 | https://inkscape.org/ | N/A | |
| Matlab | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | N/A | |
| POTATO | N/A | ||
| RNAstructure | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html | N/A | |
| Spyder | https://www.spyder-ide.org/ | N/A | |
| Other | |||
| Particelle di polistirene rivestite di streptavidina, 1,5-1,9 &; m, 5 ml, 1,0% p/v | Spherotech | SVP-15-5 | |
| Particelle di polistirene rivestite anti-digossigenina, 2,0-2,4 &; m, 2 ml, 0,1% p/v | Siringhe Spherotech | DIGP-20-2 | |
| VWR | TERUMO SS+03L1 | ||
| Devices | |||
| C-trap | Lumicks | N/A | pinzette ottiche accoppiate a microscopia confocale |
Riferimenti
- Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096(2019).
- Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G.
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Ristampe e permessi
