Visualizzazione e quantificazione della segnalazione TGFβ/BMP/SMAD in diverse condizioni di sforzo di taglio del fluido utilizzando il test di prossimità-legatura

Summary

Qui, stabiliamo un protocollo per visualizzare e analizzare simultaneamente più complessi SMAD utilizzando il test di legatura di prossimità (PLA) in cellule endoteliali esposte a condizioni patologiche e fisiologiche di stress da taglio del fluido.

Abstract

La segnalazione del fattore di crescita trasformante β (TGFβ) / proteina morfogenetica ossea (BMP) è strettamente regolata ed equilibrata durante lo sviluppo e l'omeostasi del sistema vascolare Pertanto, la deregolazione in questa via di segnalazione provoca gravi patologie vascolari, come l'ipertensione dell'arteria polmonare, la teleangectasia emorragica ereditaria e l'aterosclerosi. Le cellule endoteliali (CE), come strato più interno dei vasi sanguigni, sono costantemente esposte allo stress da taglio fluido (SS). Modelli anormali di SS fluida hanno dimostrato di migliorare la segnalazione TGFβ / BMP, che, insieme ad altri stimoli, induce l'aterogenesi. In relazione a questo, l'ateroprone, SS a basso laminare è stato trovato per migliorare la segnalazione TGFβ / BMP mentre l'ateroprotettivo, SS laminare elevato, diminuisce questa segnalazione. Per analizzare in modo efficiente l'attivazione di questi percorsi, abbiamo progettato un flusso di lavoro per studiare la formazione di complessi di fattori di trascrizione in condizioni di SS a basso laminare e SS laminare elevato utilizzando un sistema di pompe pneumatiche disponibile in commercio e un test di legatura di prossimità (PLA).

La segnalazione attiva TGFβ/BMP richiede la formazione di complessi trimerici SMAD costituiti da due SMED regolatori (R-SMAD); SMAD2/3 e SMAD1/5/8 per la segnalazione TGFβ e BMP, rispettivamente) con un mediatore comune SMAD (co-SMAD; SMAD4). Utilizzando il PLA mirato a diverse subunità del complesso trimerico SMAD, cioè R-SMAD / co-SMAD o R-SMAD / R-SMAD, la formazione di complessi di fattori di trascrizione SMAD attivi può essere misurata quantitativamente e spazialmente utilizzando la microscopia a fluorescenza.

L'utilizzo di guide di flusso con 6 piccoli canali paralleli, collegabili in serie, consente di studiare la formazione complessa del fattore di trascrizione e di inserire i necessari controlli.

Il flusso di lavoro qui spiegato può essere facilmente adattato per studi mirati alla vicinanza degli SMED ad altri fattori di trascrizione o a complessi di fattori di trascrizione diversi dagli SMAD, in diverse condizioni di SS fluida. Il flusso di lavoro qui presentato mostra un modo rapido ed efficace per studiare la segnalazione TGFβ/BMP indotta da SS fluidi nelle CE, sia quantitativamente che spazialmente.

Introduction

Le proteine della superfamiglia dei fattori di crescita trasformanti beta (TGFβ) sono citochine pleiotropiche con una varietà di membri, tra cui TGFβs, proteine morfogenetiche ossee (BMP) e ^Activins1,2. Il legame del ligando induce la formazione di oligomeri recettoriali che portano alla fosforilazione e, quindi, all'attivazione dello SMAD citosolico regolatorio (R-SMAD). A seconda della sottofamiglia di ligandi, vengono attivati diversi R-SED1,2. Mentre TGFβs e Activins inducono principalmente fosforilazione di SMAD2/3, BMP inducono fosforilazione SMA....

Protocol

1. Coltura cellulare ed esposizione allo stress da taglio dei fluidi

NOTA: le EC delle vene ombelicali umane (HUVEC) sono state utilizzate come esempio per studiare l'interazione indotta da SS di SMED. Il protocollo descritto di seguito può essere applicato a ogni tipo di cella reattiva SS.

1. Rivestire il vetrino a 6 canali con gelatina cutanea suina allo 0,1% in PBS per 30 minuti a 37 °C.
2. HUVEC di semi in vetrini preverniciati a 6 canali ad una densità di 2,5 x ¹⁰⁶ celle per mL in 30 μL di M199 full medium.
   NOTA: per ulteriori informazioni su come eseguire il seeding delle celle nella diapositiva di flusso, ....

Results

In precedenza abbiamo utilizzato il PLA per rilevare le interazioni di diverse proteine ^SMAD3 e analizzato i cambiamenti indotti dallo stress di taglio nella fosforilazione ^SMAD28.

Qui, entrambi i metodi sono stati combinati con il protocollo sopra descritto. Gli HUVEC sono stati sottoposti a stress di taglio di 1 dyn/^cm2 e 30 dyn/^cm2 e analizzati per le interazioni dei fattori di trascrizione SMAD. Mostriamo che, rispetto a.......

Discussion

Il protocollo basato sul PLA qui descritto offre un modo efficiente per determinare la stretta vicinanza di due proteine (ad esempio, la loro interazione diretta) nelle CE esposte allo stress di taglio con risoluzione quantitativa e spaziale. Utilizzando diapositive di flusso con più canali paralleli, diverse interazioni proteiche possono essere esaminate contemporaneamente in cellule in condizioni meccaniche identiche. Al contrario, i sistemi di camere di flusso costruiti su misura spesso utilizzano un singolo canale co.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Vetrino VI 0.4	ibidi	80606	Vetrino a 6 canali
Cloruro di ammonio	Carl Roth	K298.1	Estinzione Albumina
sierica bovina	Carl Roth	8076.4	Blocco
DAPI	Sigma Aldrich/ Merck	D9542	Colorazione DNA/Nuclei
DPBS	PAN Biotech	P04-53500	PBS
Duolink In Reagenti per la rilevazione in situ Kit PLA Green	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92014	contenente ligasi, tampone di legatura, polimerasi e tampone di amplificazione (con oligonucleotidi marcati in verde)
Sonda PLA in situ Duolink Sonda MINUS anti-topo	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92004	MINUS
Sonda PLA in situ Duolink Sonda
anti-coniglio PLUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92002 PLUSDuolink Tamponi di lavaggio in situ, fluorescenza	Sigma Aldrich/ Merck	DUO82049	tamponi di lavaggio PLA A e B
Integratore per la crescita delle cellule endoteliali Integratore	Corning		per terreno (ECGS)
Vitello fetale Integratore di siero			per terreno FIJI
			Software di analisi delle immagini
di formaldeide tamponato al 4%	KLINIPATH/VWR	VWRK4186. BO1	PFA
Mezzo			M199 medio basale +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 &; g/mL Hep +    50 µ g/mL ECGS
Gelatina da pelle suina, Tipo A	Sigma Aldrich	G2500	Utilizzare lo 0,1% in PBS per il rivestimento dei canali di flusso
GraphPad Prism v.7	GarphPad		Programma statistico utilizzato per i grafici e i calcoli statistici
Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina	Sigma Aldrich	H4784-250MG	integratore per medium (Hep)
HUVEC
ibidi Mezzo di montaggio	ibidi	50001	Mezzo di montaggio liquido
ibidi Pump System	ibidi	10902	pompa pneumatica
Leica TCS SP8	Microscopio confocale	Leica
L-Glutammina 200mM	PAN Biotech	P04-80100	integratore per terreno (L-Glu)
Medium 199	Sigma Aldrich	M2154	Base medium
topo anti- SMAD1 Anticorpo	Abcam	ab53745	Adatto per PLA
topo anti- SMAD2/3 Anticorpo	BD Bioscience	610843	Non adatto per PLA in combinazione con CST 9515
topo anti- SMAD4 Anticorpo	Sanata Cruz Biotechnology	sc-7966	Adatto per PLA
Penicillina 10.000U/ml /Streptomicina 10mg/ml	PAN Biotech	P06-07100	integratore per terreno (P/ S)
Perfusion Set BIANCO	ibidi	10963	Tubi utilizzati per 1 dyn/cm2
Perfusion Set GIALLO e VERDE	ibidi	10964	Tubi utilizzati per 30 dyn/cm2
rabbit anti-phospho SMAD1/5	Tecnologie di segnalazione cellulare	anticorpo 9516	Adatto per coniglio PLA
anti- SMAD2/3 XP	Tecnologie di segnalazione cellulare	anticorpo 8685	Adatto per PLA
coniglio anti- SMAD4	Tecnologie di segnalazione cellulare	anticorpale 9515	Non adatto per PLA in combinazione con BD 610843
Connettore seriale per µ-Slide	ibidi	10830	tubi di connessione seriale
Triton X-100	Carl Roth	6683.1	Permeabilizzazione