Il presente studio riporta un protocollo per lo screening cromosomico di embrioni umani che utilizza un terreno di coltura esausto, che evita la biopsia embrionale e consente l'identificazione della ploidia cromosomica utilizzando NGS. Il presente articolo presenta la procedura dettagliata, compresa la preparazione del terreno di coltura, l'amplificazione dell'intero genoma (WGA), la preparazione della libreria di sequenziamento di nuova generazione (NGS) e l'analisi dei dati.
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Articolo metodologico
Screening cromosomico di embrioni umani preimpianto mediante l'utilizzo di terreno di coltura esausto: raccolta del campione e analisi della ploidia cromosomica
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In questo articolo
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Sommario
Abstract
Nella fecondazione clinica in vitro (FIV), il metodo prevalente per la PGT-A richiede la biopsia di alcune cellule del trofoectoderma (TE). Questo è il lignaggio che forma la placenta. Questo metodo, tuttavia, richiede competenze specialistiche, è invasivo e soffre di falsi positivi e negativi perché il numero di cromosomi nella TE e nella massa cellulare interna (ICM), che si sviluppa nel feto, non sono sempre gli stessi. La NICS, una tecnologia che richiede il sequenziamento del DNA che viene rilasciato nel terreno di coltura sia da TE che da ICM, può offrire una via d'uscita a questi problemi, ma in precedenza ha dimostrato di avere un'efficacia limitata. Il presente studio riporta il protocollo completo del NICS, che include i metodi di campionamento del terreno di coltura, l'amplificazione dell'intero genoma (WGA) e la preparazione della libreria, e l'analisi dei dati NGS tramite software di analisi. Considerando i diversi tempi di crioconservazione nei diversi laboratori di embrioni, gli embriologi hanno due metodi per raccogliere il terreno di coltura embrionale che possono essere selezionati in base alle condizioni effettive del laboratorio di fecondazione in vitro.
Introduzione
Le tecnologie di riproduzione assistita (PMA) sono sempre più utilizzate per il trattamento dell'infertilità. Tuttavia, il tasso di successo della fecondazione assistita, come la fecondazione in vitro, è stato limitato e il tasso di aborto è significativamente superiore a quellodella popolazione normale. La causa principale di questi problemi sono le anomalie cromosomiche, che esistono comunemente negli embrioni umani preimpianto2. La PGT-A è un metodo efficace per lo screening dell'equilibrio cromosomico degli embrioni prima dell'impianto 3,4. Alcuni studi hanno....
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Protocollo
Il permesso etico è stato ottenuto dal Comitato Etico del Terzo Ospedale dell'Università di Pechino.
1. Preparazione
NOTA: I materiali e le attrezzature richiesti sono elencati nella Tabella dei materiali.
- Reagenti
- Preriscaldare ed equilibrare (bilanciato) 20-30 μL di terreno di gameti/terreno di fertilizzazione e terreno di coltura allo stadio di scissione/blastocisti (ricoperto di olio minerale) e ialuronidasi (in una provetta ben tappata) a 37 °C, 5% CO2 e 5 % O2 in un incubatore Tri-gas per una notte prima dell'uso.
- Preriscaldare la ialuronida....
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Risultati
Il presente studio ha applicato il metodo proposto ad un paziente. L'approvazione dell'IRB e il consenso informato sono stati ottenuti prima dell'applicazione dell'analisi NICS. Il presente studio ha ottenuto 6 blastocisti da pazienti e ha eseguito NICS su tutti e 6 gli embrioni dal giorno 4 al giorno 5 medio. Le anomalie cromosomiche causate dalla traslocazione bilanciata dei genitori sono state rilevate in cinque dei cromosomi con il test NICS; pertanto, non potevano essere utilizzati per il trasferimento (
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Discussione
Modifiche e risoluzione dei problemi
Se i risultati del NICS sono contaminati da materiale genetico parentale, assicurarsi che tutte le cellule del cumulo-corona radiata siano state rimosse e assicurarsi che l'ICSI venga eseguita per la fecondazione. Si evitano processi impropri di conservazione del terreno o di preparazione del modello, che possono degradare il DNA. Lo spazio di lavoro è stato accuratamente purificato con reagenti di decontaminazione DNasi e RNasi. Per evitar.......
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Dichiarazioni
Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang e Sijia Lu sono dipendenti di Yikon Genomics Co., Ltd.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Shiping Bo e Shujie Ma per la loro assistenza nell'analisi dei dati NGS. Finanziamento: questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program (Grant No. 2018YFC1003100).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| provette EP da 1,5 mL, provette PCR da 0,2 mL | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | prive di DNasi/RNasi, provette per PCR a basso legame e provette per microcentrifuga da 1,5 mL. |
| 10 µ L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L DNasi /Punte prive di RNasi | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per il trasferimento di campioni |
| 100 % etanolo | Sinopharm Chemical | 10009218 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per la purificazione della libreria di DNA |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | in NICSInst kit di preparazione della libreria | Per l'amplificazione della libreria |
| BD Falcon Piatto per coltura d'organo, Sterile | BD Bioscience | 363037 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per la coltura di embrioni |
| BD Falcon Piastre per la coltura dei tessuti (Easy Grip), Sterile | BD Bioscience | 353001 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per la coltura di embrioni |
| BD Falcon Piastre per la coltura dei tessuti, Sterile | BD Bioscience | 353002 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per la coltura di embrioni |
| Tampone per lisi cellulare | Yikon Reagente | genomico in NICSInst kit di preparazione della libreria | Per il pretrattamento del terreno |
| di coltura Enzima di lisi cellulare | Yikon Genomics | in NICSInst kit di preparazione della libreria | Per il pretrattamento del terreno di coltura |
| Software ChromGo | Yikon Genomics | Analisi dei dati | |
| CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagente in NICSInst kit di preparazione della libreria | Per la purificazione della libreria |
| Cryotop sistema aperto | KITAZATO BioPharma | 81110 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per la vitrificazione degli embrioni |
| Distillare l'acqua | Reagente Yikon Genomics | in NICSInst kit di preparazione della libreria | Per sciogliere il DNA |
| ES (kit di vetrificazione) | Kit | invitrificazione del reagente | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per la vitrificazione di embrioni |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | Questo può essere sostituito da un'altra marca /Per soluzione ICSI |
| di ialuronidasi, 80 U/mL | di salvia | ART4007-A | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Digerire il complesso ovocita-corona-cumulo |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per ICSI |
| Illumina MiSeq® Sistema | Illumina | SY-410-1001 | Per il sequenziamento della libreria |
| Incubatore | Labotect | Inkubator C16 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per la coltura di embrioni |
| Tampone della libreria | Reagente Yikon Genomics | in NICSInst kit di preparazione della libreria | Per l'amplificazione della |
| libreria Miscela enzimatica | Yikon Reagente per la preparazione della | libreria NICSInst | amplificaton |
| Supporto magnetico | DynaMagTM-2 | 12321D | Per la purificazione della libreria |
| Microscopio | OLYMPUS | 1X71 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per l'osservazione degli embrioni |
| Mini-centrifuga | ESSENSCIEN | ELF6 | Per la separazione |
| MT Miscela di enzimi | Yikon Reagente | genomico in NICSInst kit di preparazione della libreria | Per il pretrattamento del terreno di coltura |
| NICSInst kit di preparazione della libreria | Yikon Genomics | KT1000800324 | Amplificazione dell'intero genoma e costruzione di librerie |
| NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificare DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per il lavaggio degli embrioni e la coltura di blastocisti |
| Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per pipette Pasteur per il trasferimento di embrioni |
| ORIGIO | PP-9-1000 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per il laboratorio di fecondazione in vitro | |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagente in NICSInst kit di preparazione della libreria | Pre-Lib |
| Enzyme | Yikon Genomics | Reagente in NICSInst kit di preparazione della libreria | Pre-library |
| Qubit® 3.0 Fluorimetro | Thermo Scientific | Q33216 | Per la quantificazione della libreria |
| Quinn's Advantage Blastocisti Medium | SAGE | ART-1029 | Per la coltura della fase di blastocisti embrionale |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per la coltura della fase di scissione dell'embrione |
| Fecondazione Quinn's Advantage Medium | SAGE | ART-1020 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per la fecondazione di ovociti e spermatozoi |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium con HEPES | SAGE | ART-1023 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per l'embrione clutrure |
| Quinn's Advantage SPS Kit sostitutivo delle proteine del siero | SAGE | ART-3010 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per denudare l'ovocita |
| Quinn's Advantage Olio minerale per colture tissutali | SAGE | ART-4008P | Questo può essere sostituito da un'altra marca / Per coprire il terreno di coltura |
| PUNTE PER STRIPPER | ORIGIO | MXL3-IND-135 | Questo può essere sostituito da un'altra marca / Per la denudazione di cellule della granulosa |
| Vitrificazione Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | Questo può essere sostituito da un'altra marca / Per la vitrificazione di embrioni |
| Kit | di vitrificazione KITAZATO BioPharma | VT101 | Questo può essere sostituito da un'altra marca/Per la vitrificazione di embrioni |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Mix di campioni |
| VS (kit di vitrificazione) | Kit | invetrificazione per reagenti | Può essere sostituito da un'altra marca/Per la vitrificazione di embrioni |
| Sistema laser ZILOS-tk | Hamilton Thorne | CLASSE 1 | Può essere sostituito da un'altra marca/Per il collasso artificiale del blastocele |
Riferimenti
- Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
- Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationshi....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.
In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
to:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
In the Representative Results, Figure 3 was updated from:
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.
