Articolo metodologico

Modello biomimetico tridimensionale in vitro di neuroblastoma utilizzando scaffold a base di collagene

DOI:

10.3791/62627

⸱

9 luglio 2021

 ,  ,  ,  , 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 4National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland, 5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland, 6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland

* These authors contributed equally

In questo articolo

Avviso di errata corrige

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo documento elenca i passaggi necessari per seminare linee cellulari di neuroblastoma su scaffold tridimensionali a base di collagene precedentemente descritti, mantenere la crescita cellulare per un periodo di tempo predeterminato e recuperare scaffold per diverse analisi della crescita cellulare e del comportamento cellulare e applicazioni a valle, adattabili per soddisfare una serie di obiettivi sperimentali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il neuroblastoma è il tumore solido extracranico più comune nei bambini, rappresentando il 15% dei decessi complessivi per cancro pediatrico. Il tessuto tumorale nativo è un complesso microambiente tridimensionale (3D) che coinvolge strati di cellule cancerose e non cancerose circondate da una matrice extracellulare (ECM). L'ECM fornisce supporto fisico e biologico e contribuisce alla progressione della malattia, alla prognosi del paziente e alla risposta terapeutica.

Questo documento descrive un protocollo per l'assemblaggio di un sistema basato su scaffold 3D per imitare il microambiente del neuroblastoma utilizzando linee cellulari di neuroblastoma e scaffold a base di collagene. Gli scaffold sono integrati con nanoidrossiapatite (nHA) o glicosaminoglicani (GAG), che si trovano naturalmente ad alte concentrazioni nell'osso e nel midollo osseo, i siti metastatici più comuni del neuroblastoma. La struttura porosa 3D di questi scaffold consente l'attaccamento, la proliferazione e la migrazione delle cellule di neuroblastoma e la formazione di cluster cellulari. In questa matrice 3D, la risposta cellulare alle terapie riflette maggiormente la situazione in vivo .

Il sistema di coltura basato su scaffold è in grado di mantenere densità cellulari più elevate rispetto alle colture cellulari bidimensionali (2D) convenzionali. Pertanto, i protocolli di ottimizzazione per il numero di celle di semina iniziali dipendono dai tempi sperimentali desiderati. Il modello viene monitorato valutando la crescita cellulare tramite la quantificazione del DNA, la vitalità cellulare tramite saggi metabolici e la distribuzione cellulare all'interno degli scaffold tramite colorazione istologica.

Le applicazioni di questo modello includono la valutazione dei profili di espressione genica e proteica, nonché i test di citotossicità utilizzando farmaci convenzionali e miRNA. Il sistema di coltura 3D consente la manipolazione precisa dei componenti cellulari e dell'ECM, creando un ambiente fisiologicamente più simile al tessuto tumorale nativo. Pertanto, questo modello 3D in vitro farà progredire la comprensione della patogenesi della malattia e migliorerà la correlazione tra i risultati ottenuti in vitro, in vivo in modelli animali e soggetti umani.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il neuroblastoma è un tumore pediatrico del sistema nervoso simpatico che insorge durante lo sviluppo embrionale o nei primi anni di vita post-natale a causa della trasformazione delle cellule della cresta neurale1. È il tumore extracranico solido più comune nei bambini, rappresenta l'8% delle neoplasie maligne diagnosticate nei pazienti sotto i 15 anni ed è responsabile del 15% di tutti i decessi per cancro infantile. La malattia mostra comportamenti clinici altamente eterogenei a causa di specifiche alterazioni cromosomiche, genetiche ed epigenetiche e di caratteristiche istopatologiche.

Queste alterazioni contribuiscono all'aggressività del neuroblastoma e agli scarsi esiti nei pazienti pediatrici. Pertanto, le attuali terapie si rivelano inefficaci a lungo termine per quasi l'80% dei pazienti con la malattia clinicamente aggressiva2, evidenziando il fatto che il trattamento per questo gruppo di pazienti rimane impegnativo. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che i meccanismi dell'eterogeneità del neuroblastoma e delle metastasi non sono ancora del tutto compresi. Tuttavia, si ritiene che il microambiente tumorale (TME) svolga un ruolo nella progressione di molti tumori; Eppure rimane poco studiato nel neuroblastoma 3,4.

La TME nativa è un complesso microambiente 3D che coinvolge cellule cancerose e non cancerose circondate da una ECM. L'ECM si riferisce alla componente acellulare di un tessuto che fornisce supporto strutturale e biochimico ai suoi residenti cellulari e contribuisce alla progressione della malattia, alla prognosi del paziente e alla risposta terapeutica5. Questa promozione della progressione della malattia è dovuta alla "reciprocità dinamica" o comunicazione bidirezionale in corso tra le cellule e l'ECM 6,7,8. Man mano che il cancro progredisce, il collagene stromale viene spesso riorganizzato in schemi lineari perpendicolari all'interfaccia stroma-cancro, che le cellule tumorali usano come via migratoria verso le metastasi 9,10,11.

I componenti principali di questa impalcatura biologica funzionale nativa includono una rete fibrosa di collageni di tipo I e II e altre proteine, tra cui elastina, glicoproteine come la laminina, nonché una serie di proteoglicani e altri componenti solubili12,13. Queste proteine dell'ECM nativa sono ora diventate interessanti biomolecole naturali per lo sviluppo di modelli 3D in vitro 3. L'applicazione di scaffold 3D per la coltura cellulare in vitro sta diventando sempre più popolare grazie alla sua maggiore rappresentazione fisiologica della TME rispetto alla tradizionale coltura monostrato 2D. Gli scaffold 3D prodotti assistono l'attaccamento, la proliferazione, la migrazione, il metabolismo e la risposta delle cellule agli stimoli osservati nei sistemi biologici in vivo.

Il componente principale di queste impalcature 3D è il collagene, che è un attore chiave in molti normali processi biologici tra cui la riparazione dei tessuti, l'angiogenesi, la morfogenesi dei tessuti, l'adesione cellulare e la migrazione11. Le matrici 3D a base di collagene hanno dimostrato la loro robusta funzionalità per modellare l'ECM, fungendo da microambiente biomimetico in vitro e consentendo al contempo interazioni cellula-ECM, nonché la migrazione e l'invasione cellulare. Queste matrici 3D forniscono anche un'analisi più accurata della risposta cellulare ai farmaci chemioterapici rispetto alla tradizionale coltura 2D o "piatta" in molti modelli di cancro 14,15,16, incluso il neuroblastoma 17,18. L'analisi genetica delle colture cellulari 3D ha riportato una maggiore correlazione con il profilo tissutale umano anche rispetto ai modelli animali19. Nel complesso, la pietra angolare di questi scaffold 3D è quella di fornire alle cellule un ambiente in vitro adatto, che ricapitola l'architettura tissutale nativa e facilita la diafonia molecolare bidirezionale8.

Per aumentare la complessità dei modelli a base di collagene, altri componenti comuni dell'ECM vengono incorporati nel processo di ingegneria tissutale, creando così modelli fisiologicamente più rilevanti per riflettere le TME di nicchia di diversi tessuti. Ad esempio, i GAG, polisaccaridi caricati negativamente presenti in tutti i tessuti dei mammiferi20, facilitano l'attaccamento, la migrazione, la proliferazione e la differenziazione cellulare. Il solfato di condroitina è un tipo specifico di GAG presente nell'osso e nella cartilagine, che è stato precedentemente utilizzato in applicazioni di ingegneria tissutale per la riparazione ossea 21,22,23,24,25. La nano-idrossiapatite (nHA) è il principale costituente inorganico della composizione minerale dei tessuti ossei umani, costituendo fino al 65% dell'osso in peso26 ed è quindi ampiamente utilizzata per la sostituzione e la rigenerazione ossea27. Pertanto, GAGs e nHA sono compositi interessanti per ricostruire l'ECM del neuroblastoma primario e modellare i siti metastatici più comuni del neuroblastoma, del midollo osseo (70,5%) e dell'osso (55,7%)28.

Gli scaffold che incorporano questi componenti ECM sono stati originariamente sviluppati per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo con un'analisi approfondita della loro biocompatibilità, tossicità e caratteristiche osteoconduttive e osteoinduttive29,30. Sono matrici porose a base di collagene prodotte utilizzando tecniche di liofilizzazione per controllarne le proprietà fisiche e biologiche. Gli scaffold di collagene integrati con nHA (Coll-I-nHA) o condroitin-6-solfato (Coll-I-GAG) hanno dimostrato successo nell'imitare la TME primaria nel cancro al seno31 e le metastasi ossee nel cancro alla prostata15 e nel neuroblastoma17. La tecnica di liofilizzazione utilizzata per produrre questi scaffold compositi produce un'omogeneità riproducibile nella dimensione dei pori e nella porosità all'interno degli scaffold22,23,24. In breve, un impasto di collagene (0,5% in peso) viene fabbricato miscelando collagene fibrillare con acido acetico 0,05 M. Per Coll-I-GAG, lo 0,05% in peso di chrondoitin-6-solfato isolato dalla cartilagine di squalo viene aggiunto al liquame di collagene durante la miscelazione. Per gli scaffold compositi Coll-I-nHA, le particelle di idrossiapatite di dimensioni nanometriche vengono sintetizzate come descritto in precedenza27 e aggiunte al liquame di collagene in un rapporto di 2:1 rispetto al peso del collagene durante il processo di miscelazione. Tutti i ponteggi sono reticolati fisicamente e sterilizzati mediante trattamento deidrotermale a 105 °C per 24 h25. Gli scaffold cilindrici (6 mm di diametro, 4 mm di altezza) sono ottenuti utilizzando un punzone per biopsia e possono essere chimicamente reticolati con 3 mM di N-(3-dimetilamminopropil)-N'-etilcarbodiimmide cloridrato e 5,5 mM di N-idrossisuccinimide (EDAC/NHS) in acqua distillata (dH2O) per migliorare le proprietà meccaniche dei costrutti30. Questo processo di produzione ben ottimizzato di due scaffold di collagene crea scaffold con proprietà meccaniche riproducibili, tra cui la dimensione dei pori, la porosità e la rigidità (kPa). Sia gli scaffold Coll-I-GAG che quelli Coll-I-nHA hanno proprietà fisiche diverse, creando condizioni ambientali diverse. Le proprietà di ciascuna impalcatura sono visualizzate nella Tabella 1.

Coll-I-GAGColl-I-nHA
Dimensione dell'impalcatura
(diametro [mm] x altezza [mm])		6 x 4 176 x 4 17
Concentrazione di collagene (% in peso)0.5 170.5 17
Concentrazione del substrato (% in peso)
[in base al peso del collagene]		0.05 15,17200 17
Dimensione media dei pori (mm)96 2296 – 120 29
Porosità (%)99.5 2398,9 – 99,4 27
Rigidezza (kPa)1.5 275,5 - 8,63 29

Tabella 1: Panoramica delle proprietà meccaniche dei due scaffold adottati per lo studio della biologia del neuroblastoma.

Questo documento descrive un protocollo di assemblaggio di un sistema basato su scaffold 3D per imitare meglio il microambiente del neuroblastoma utilizzando linee cellulari di neuroblastoma e scaffold a base di collagene precedentemente descritti integrati con nHA (Coll-I-nHA) o condroitin-6-solfato (Coll-I-GAG). Il protocollo include metodi a valle per analizzare i meccanismi di crescita delle cellule di neuroblastoma in un ambiente fisiologicamente più rilevante, utilizzando metodi precedentemente ottimizzati e poco costosi adattati dalla coltura monostrato 2D Figura 1.

figure-introduction-1
Figura 1: Flusso di lavoro complessivo del protocollo. (A) Le cellule vengono cresciute fino a raggiungere un numero sufficiente, divise, contate e risospese in un volume appropriato di terreno. (B) Questo stock di cellule viene quindi sottoposto a diluizione seriale per preparare un totale di 4 sospensioni cellulari di diversa densità. (C) Gli scaffold a base di collagene sono placcati sterilmente in piastre a 24 pozzetti non aderenti e (D) 20 μL di sospensione cellulare vengono aggiunti al centro di ogni scaffold e lasciati incubare a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità per 3-5 ore. (E) Il terreno di crescita completo (1 mL) viene quindi aggiunto lentamente a ciascuna impalcatura e le piastre vengono rimesse nell'incubatore per consentire la crescita cellulare per il periodo di tempo desiderato. (F) In ogni momento predeterminato, vengono recuperati diversi scaffold per la valutazione della vitalità e della crescita cellulare, l'analisi dell'espressione genica e la colorazione istologica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Disegno sperimentale

NOTA: Il numero di scaffold e celle necessari per ciascun esperimento dipenderà dalla scala dell'esperimento e può essere calcolato utilizzando gli strumenti in questa sezione sul disegno sperimentale.

  1. Numero di impalcature necessarie
    1. Determinare la tempistica sperimentale complessiva e gli intervalli di valutazione per i cambiamenti nella biologia cellulare (ad esempio, crescita cellulare e metabolismo).
      NOTA: Ad esempio, il periodo sperimentale è di 14 giorni, con una valutazione della crescita cellulare ogni 7 giorni. Pertanto, i punti temporali sperimentali sono i giorni 1, 7, 14 per un totale di 3 punti temporali.
    2. Successivamente, decidi il numero di applicazioni sperimentali da applicare in ogni momento. Prova a completare le stesse analisi in ogni momento per monitorare i cambiamenti.
      NOTA: Le analisi tipiche della crescita cellulare sugli scaffold includono saggi di vitalità cellulare, quantificazione del DNA, colorazione istologica e imaging e analisi dell'espressione genica. Questi saranno ulteriormente discussi nella sezione 5.
    3. Decidere quando utilizzare lo stesso scaffold per più applicazioni a valle, ad esempio, dopo la valutazione della vitalità cellulare utilizzando un saggio appropriato, riutilizzare lo scaffold per l'isolamento di DNA/RNA (discusso in 5.1.11).
    4. Mantenere un minimo di 3 repliche biologiche per ogni applicazione, ad esempio 3 scaffold per la vitalità cellulare e la quantificazione del DNA, 3 per l'istologia e 3 per l'analisi dell'espressione genica. Poiché ciò equivale a 9 impalcature per punto temporale, pianificare l'utilizzo di 27 impalcature per 3 punti temporali.
    5. Infine, moltiplicare questo numero per il numero di parametri o condizioni sperimentali (ad esempio, valutazione di più linee cellulari, densità di semina iniziale, composizioni di scaffold).
      NOTA: In questo protocollo, sono state valutate 4 diverse densità di semina iniziali per una linea cellulare, con il risultato di 108 (27 scaffold x 4 condizioni) scaffold necessari. Per tenere conto dell'errore umano e fornire una copertura extra, aggiungere ~10% a questo numero, ad esempio, se sono necessari 108 scaffold, preparare 120 scaffold.
  2. Numero di celle necessarie
    NOTA: Si consiglia un volume di 20 μL di sospensione cellulare per la semina delle cellule su un'impalcatura cilindrica (diametro 6 mm, altezza 4 mm) il giorno 0. Il numero di cellule per questi 20 μL di sospensione cellulare è regolato in base al disegno sperimentale, calcolato nella sezione 1.1. Una densità di semina iniziale comune è di 2 × 105 cellule per 20 μL, utilizzata come esempio per il protocollo seguente.
    1. Per calcolare la quantità totale di cellule necessarie per l'esperimento, moltiplicare le 2 × 105 cellule iniziali per 20 μL per il numero di scaffold necessari.
      NOTA: Ad esempio, 30 scaffold moltiplicati per 20 μL danno un volume totale di 600 μL. Se ogni scaffold richiede 2 × 10 5 cellule, 600 μL di sospensione contengono un totale di 6 × 10 6 cellule (2 × 105 × 30), per un fabbisogno finale di 6 × 106 cellule in 600 μL. Il numero dei parametri sperimentali determinerà il numero totale di celle necessarie. Questo protocollo, quindi, delinea la coltura cellulare utilizzando un pallone per coltura cellulare multistrato, in grado di gestire lo stesso numero di cellule di 10 matracci tradizionalida 175 cm 2.

2. Preparazione di scaffold a base di collagene

NOTA: Gli scaffold cilindrici Coll-I-nHA e Coll-I-GAG (diametro 6 mm, altezza 4 mm) sono preparati utilizzando i metodi stabiliti 15,21,27. Una volta reticolati chimicamente secondo i metodi17 precedentemente pubblicati, gli scaffold devono essere utilizzati entro 1 settimana.

  1. Dopo la fabbricazione degli scaffold con le proprietà meccaniche desiderate, assicurarsi che gli scaffold siano completamente idratati e accuratamente lavati in soluzione salina tamponata con fosfati (PBS).
    NOTA: Questa operazione richiede generalmente ~12 ore dopo la reticolazione degli scaffold e può essere eseguita in contenitori per rifiuti di coltura tissutale da 100 mL a 4 °C, con un massimo di 50 scaffold per contenitore e 2 mL di PBS per scaffold.
  2. Conservare gli scaffold in PBS a 4 °C fino al momento dell'uso.

3. Propagare le cellule di neuroblastoma in un pallone di coltura cellulare multistrato

NOTA: La densità di semina ottimale per il pallone multistrato può variare. Per il pallone utilizzato in questo esperimento, la densità ottimale secondo le istruzioni del produttore è 1 × 107 celle. Prima di seminare il pallone multistrato, propagare le cellule a una densità di 1 × 10-7 cellule o superiore in un pallone per coltura tissutale appropriato (ad esempio, un pallone per coltura tissutale T175 cm2). Per seminare le cellule nel pallone multistrato (paragrafo 3.1), farle crescere fino al 70-80% confluente, raccogliere e contare il numero di cellule per ml, facendo riferimento ai passaggi 3.2.16-3.2.20 per eseguire la conta delle cellule. Una volta contata la sospensione cellulare, procedere immediatamente alla semina del pallone multistrato. Il lavoro di coltura cellulare deve essere eseguito in una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità.

  1. Semina del pallone per coltura cellulare multistrato
    1. Preriscaldare 550 mL di terreno di coltura completo (varia a seconda della linea cellulare in uso) e 100 mL di PBS sterile a bagnomaria a 37 °C per 20 min.
    2. Utilizzando la sospensione cellulare raccolta, calcolare il volume richiesto della sospensione cellulare necessaria per ottenere la densità di semina ottimale di 1 × 107 celle utilizzando l'equazione (1), dove WANT si riferisce al numero di cellule necessarie per la semina del pallone multistrato e HAVE si riferisce al numero di cellule/mL nella sospensione cellulare:
      figure-protocol-1(1)
      ad esempio, figure-protocol-2
    3. Aggiungere il volume richiesto della sospensione cellulare a 100 mL del terreno di coltura preriscaldato.
    4. Prendi un nuovo pallone multistrato nel cofano, rimuovi il tappo e tieni il pallone con un angolo di 60°. Pipettare lentamente tutti i 100 ml di sospensione cellulare nel pallone, lungo il lato angolato del collo. Tappare il pallone e posizionarlo su un lato per consentire alle cellule di distribuirsi uniformemente tra gli strati.
    5. Con un angolo di 60°, aggiungere 400 mL del terreno di coltura preriscaldato al pallone multistrato versando lentamente o pipettando lungo il lato angolato del collo. Se il collo si riempie, riportare il pallone in posizione verticale o tappare il pallone e posizionarlo su un lato prima di tornare a versare.
      NOTA: Versare lentamente per evitare un'eccessiva formazione di bolle. Picchiettare delicatamente il pallone in posizione verticale per consentire a tutte le bolle di salire verso l'alto e rimuoverle con una pipetta da 10 ml. Assicurarsi che il pallone sia riempito fino alla filettatura inferiore del collo; Aggiungere altro terreno, se necessario, per raggiungere questo obiettivo.
    6. Tappare il pallone multistrato e incubarlo con il collo angolato rivolto verso il basso a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità.
    7. Controllare la crescita ogni 2-3 giorni per la confluenza. Per controllare la confluenza dei due strati inferiori del pallone multistrato, osservarli sotto una lente obiettivo 4x di un microscopio invertito.
      NOTA: Se seminato con 1 × 107 cellule di neuroblastoma, il pallone a 10 strati impiegherà in genere una settimana per diventare confluente, anche se questo può variare a seconda della linea cellulare utilizzata.
  2. Manutenzione ordinaria delle cellule nel matraccio multistrato
    1. Preriscaldare 550 mL di terreno di coltura completo (varia a seconda della linea cellulare in uso), 50-100 mL di tripsina e 300 mL di PBS sterile in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 minuti.
    2. Controllare che il pallone multistrato abbia una confluenza del 70-80%.
    3. Collocare il pallone multistrato in una cappa a flusso laminare ed eliminare il fluido esausto dal pallone versandolo. Inizialmente, inclinare il pallone in modo che il fluido si versi sopra la diga d'aria in un contenitore per rifiuti. Durante il versamento, ruotare il pallone di 180° fino a quando il fluido scorre lungo il collo angolato del pallone. Ruotare il pallone avanti e indietro lungo questo asse per eliminare il liquido residuo.
    4. Lavare le cellule aggiungendo lentamente 100 ml di PBS sterile preriscaldato lungo il collo angolato. Tappare il pallone, posizionarlo su un lato per consentire una distribuzione uniforme del PBS e ruotare il pallone avanti e indietro per lavare le celle.
    5. Smaltire il lavaggio PBS nello stesso modo di 3.2.3. Ripetere le fasi di lavaggio.
    6. Diluire 50 mL di tripsina preriscaldata in 50 mL di PBS sterile preriscaldato. Aggiungere 100 mL di soluzione di tripsina diluita al pallone multistrato, al tappo e posizionare il pallone su un lato per consentire una distribuzione uniforme della tripsina. Se la linea cellulare è altamente aderente, utilizzare 100 ml di tripsina non diluita.
    7. Incubare il matraccio per 2-5 minuti a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità, monitorando il distacco delle cellule al microscopio. Se necessario, picchiettare con decisione il pallone per favorirne il distacco o rimetterlo nell'incubatrice per un altro minuto.
    8. Posizionare il pallone multistrato in una cappa a flusso laminare e neutralizzare la tripsina con 100 mL di terreno di coltura. Tappate il pallone, posizionatelo su un lato e oscillate avanti e indietro per garantire la completa neutralizzazione.
    9. Versare la sospensione cellulare neutralizzata in 4 provette da centrifuga coniche da 50 ml.
      NOTA: Se è necessario un prelievo completo delle cellule, lavare nuovamente il matraccio multistrato con 100 mL di PBS sterile e versarlo in 2 provette da centrifuga da 50 mL.
    10. Centrifugare la sospensione cellulare in provette da centrifuga da 50 mL a 340 × g per 3-4 minuti per pellettare le cellule.
    11. Rimettere le provette da centrifuga nella cappa a flusso laminare ed eliminare con cura quanto più surnatante possibile da ciascun pellet.
      NOTA: Il pellet sarà grande e relativamente sciolto e quindi può essere interrotto facilmente.
    12. Aggiungere 1-5 ml di terreno di coltura a ciascun pellet e risospenderlo pipettando su e giù più volte.
    13. Raggruppare i 4 pellet risospesi in una provetta da centrifuga da 50 ml, mescolarli accuratamente con la pipetta e annotare il volume totale.
    14. Effettuare un'opportuna diluizione della sospensione cellulare per il conteggio delle cellule in modo che ogni quadrato esterno dell'emocitometro contenga 30-100 cellule.
      NOTA: Una diluizione iniziale adeguata è 1:100; a tale scopo, pipettare 10 μL della sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga conica da 15 mL e diluirla con 990 μL di PBS sterile. Pipettare la miscela su e giù più volte per mescolare accuratamente.
    15. Posizionare una provetta da centrifuga da 50 mL contenente il brodo di cellule nell'incubatrice durante il conteggio.
    16. Prendendo un emocitometro pulito, posizionare un vetrino coprioggetti pulito sulla griglia, come mostrato nella Figura 2.
    17. Pipettare 10 μL della sospensione cellulare diluita nella camera dell'emocitometro. Se la camera si riempie prima dell'erogazione di tutti i 10 μL, interrompere il pipettaggio.
    18. Posizionare l'emocitometro sotto l'obiettivo 4x di un microscopio ottico. Regolare la messa a fuoco grossolana e fine per visualizzare le celle.
    19. Contare il numero di celle nei quattro quadrati degli angoli esterni della camera, come evidenziato nella Figura 2. Somma i quattro conteggi e dividi per 4 per calcolare la media delle celle per quadrato.

figure-protocol-3
Figura 2: Conteggio delle cellule con un emocitometro. Dieci microlitri di sospensione cellulare vengono aggiunti all'emocitometro sotto il vetrino coprioggetto. La camera viene quindi posizionata sotto l'obiettivo 4x di un microscopio e viene contato il numero di cellule nei quattro angoli esterni della griglia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Moltiplicare il conteggio medio per il fattore di diluizione (ad esempio, 100) e moltiplicare questo numero per 10.000 per ottenere il numero di cellule per mL utilizzando l'equazione (2).
    figure-protocol-4 (2)
  2. Calcolare il numero totale di cellule nella soluzione madre moltiplicando per il volume totale della cella (ad esempio, se i 4 pellet risospesi raggruppati formano una soluzione da 20 mL, moltiplicare le cellule/mL per 20).
  3. Per mantenere il pallone multistrato, utilizzare l'equazione (1) descritta al punto 3.1.2 per calcolare il volume di cellule necessarie per riseminare 1 × 107 cellule nel pallone ed eseguire i passaggi da 3.1.3 a 3.1.6 per riseminare il pallone. Se si è pronti a seminare le impalcature, passare alla sezione successiva.

4. Cellule di neuroblastoma da seme su scaffold

  1. Preparare la sospensione di cellule madri
    NOTA: Questo protocollo delineerà i passaggi per la creazione di quattro diverse densità di semina delle cellule di neuroblastoma, con un fattore di moltiplicazione di 2 tra ciascuna densità. Una diluizione seriale sarà quindi utilizzata per creare altre tre sospensioni cellulari dalla sospensione di serie. Il lavoro di coltura cellulare deve essere eseguito in una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità.
    1. Utilizzare l'equazione (3) per calcolare il volume di cellule necessario dal numero totale di cellule nel matraccio multistrato (conteggiato al punto 3.2.19) per preparare la prima densità di semina o la sospensione del materiale cellulare.
      figure-protocol-5(3)
      NOTA: Ad esempio, se la massima densità di semina è di 6 × 105 celle per scaffold richiesta per 30 scaffold, con ogni scaffold che riceve 20 μL di sospensione cellulare, la sospensione di celle stock richiederebbe 1,8 × 107 celle (6 × 105 celle × 30 scaffold) in un volume totale di 600 μL (20 μL × 30 scaffold).
      Poiché da questo preparato verrà eseguita una diluizione seriale, questi numeri devono essere raddoppiati, cioè 3,6 × 107 cellule in un volume totale di 1200 μL. Per convertirlo in WANT in cellule per mL; dividere 3,6 × 10 7 per 1200 μL e moltiplicare per 1000 μL, ottenendo 3 × 107 cellule per mL.
      ​figure-protocol-6
    2. Aggiungere il volume richiesto di cellule in una provetta da centrifuga sterile da 2 mL o 15 mL e portare a un volume finale di 1200 μL con terreno di crescita. Etichettare questo tubo come Densità 1 (Figura 3).
  2. Eseguire la diluizione seriale per creare sospensioni cellulari a densità di semina multipla.
    1. Dalla densità 1 preparata nel passaggio 4.1.1, preparare altre tre densità di sospensione cellulare attraverso la diluizione seriale come da Figura 3.
    2. Diluire ogni densità di un fattore 2 nel terreno di coltura. Innanzitutto, aggiungere il volume finale richiesto (600 μL dall'esempio precedente) di terreno di crescita a tre provette da centrifuga sterili da 2 mL o 15 mL.
    3. Trasferire metà della densità 1 (600 μL) in una delle provette, mescolando accuratamente la sospensione cellulare con il mezzo da diluire. Etichettare questo tubo come Densità 2.
    4. Trasferire metà della densità 2 (600 μL) nella provetta successiva, mescolando accuratamente la sospensione cellulare con il mezzo da diluire. Etichettare questo tubo come Densità 3.
    5. Trasferire metà della densità 3 (600 μL) nella provetta successiva, mescolando accuratamente la sospensione cellulare con il mezzo da diluire. Etichettare questo tubo come Densità 4.
    6. Scartare 600 μL dalla densità 4 in modo che tutte e quattro le preparazioni abbiano un volume finale di 600 μL.
    7. Come controllo negativo, aggiungere 600 μL di terreno di coltura solo a una provetta da centrifuga sterile da 2 mL. Vedere la Figura 3 per uno schema del processo di diluizione seriale.

figure-protocol-7
Figura 3: Diluizione seriale del materiale cellulare per preparare 4 sospensioni per 4 diverse densità di semina dell'impalcatura. (A) I numeri possono essere regolati per adattarsi alla densità di semina desiderata per scaffold e (B) moltiplicati per il numero totale di scaffold per densità, con ogni scaffold che riceve 20 μL di sospensione cellulare. In questo esempio, la densità 1 richiede 6 × 105 celle per scaffold, equivalenti a 1,8 × 107 celle in 600 μL per 30 scaffold. Questo numero viene raddoppiato per iniziare la diluizione seriale, poiché 600 μL vengono quindi trasferiti e diluiti in 600 μL di terreno di coltura nella provetta successiva. Questo processo continua fino a quando non ci sono 4 sospensioni cellulari con un fattore di 2 tra ciascuna. Un controllo negativo viene effettuato aggiungendo 600 μL di mezzo solo a una provetta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Aggiunta di sospensioni cellulari agli scaffold
    NOTA: Rimuovere gli scaffold (conservati in PBS) dal frigorifero e lasciarli a temperatura ambiente (RT) prima di aggiungere le celle.
    1. Portare gli scaffold in PBS nella cappa a flusso laminare.
    2. Utilizzando una pinzetta sterile, posizionare gli scaffold in piastre non aderenti da 24 pozzetti con uno scaffold per pozzetto (Figura 1C). Sollevare delicatamente le impalcature dagli angoli e premerle leggermente contro il lato del contenitore per rimuovere il PBS in eccesso. Aggiungere le impalcature al centro dei pozzetti con la pelle rivolta verso il basso (il lato dello strato lucido dell'impalcatura, rivolto verso il basso nelle piastre di plastica a 24 pozzetti).
    3. Etichettare le piastre a 24 pozzetti con i dettagli della linea cellulare, i parametri rilevanti (ad esempio, la densità di semina) e i punti temporali. Lavorare con una densità di semina cellulare alla volta, mantenendo le densità rimanenti nell'incubatore a 37 °C fino al momento dell'uso.
    4. Nella cappa a flusso laminare, utilizzare una pipetta P20 e puntali sterili per aggiungere delicatamente 20 μL della sospensione cellulare pertinente al centro di ciascuna impalcatura (Figura 1D). Tenere le cellule accuratamente in sospensione mescolando bene mentre si aggiungono le cellule alle impalcature. Assicurarsi che la sospensione rimanga sopra l'impalcatura e non scivoli sulla base del pozzetto, poiché ciò non consentirà l'attacco delle celle all'impalcatura.
    5. Una volta aggiunte le cellule, incubare le piastre per 3-5 ore (37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità) per consentire alla maggior parte delle cellule di attaccarsi.
    6. Dopo l'incubazione, aggiungere lentamente e delicatamente 1 mL di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto (Figura 1E). Utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere il terreno per consentire un movimento più lento e controllato, evitando lo spostamento degli scaffold. Se si lavora con un numero molto elevato di scaffold, utilizzare una pipetta da 10 ml con la pistola per pipette impostata su "drop" e "low".
    7. Incubare le piastre a 24 pozzetti per una notte (37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità).
  2. Manutenzione delle celle sugli scaffold
    1. Dopo le prime 24 ore di attacco cellulare (Giorno 1), trasferire gli scaffold seminati in nuove piastre a 24 pozzetti non aderenti e aggiungere 1-2 ml di terreno di coltura fresco.
      NOTA: Questo passaggio rimuove le cellule che sono cadute sul fondo delle piastre di plastica a 24 pozzetti piuttosto che consentire loro di crescere sugli scaffold. Le repliche dell'impalcatura designate come Giorno 1 verranno rimosse dopo 24 ore, come discusso nella sezione 5; Pertanto, la manutenzione non si applica a queste impalcature.
    2. Monitorare gli scaffold inizialmente ogni 2-3 giorni per un cambiamento di colore del mezzo di crescita. Man mano che il tempo passa e le cellule proliferano all'interno degli scaffold, nutri le cellule più frequentemente.
    3. Utilizzando una pistola per pipette da 10 mL, in modalità lenta, rimuovere 1 mL del terreno esausto e gettarlo. Se si eseguono esperimenti che richiedono un terreno condizionato, raccogliere il terreno esaurito delle repliche biologiche in una provetta da centrifuga da 15 mL, centrifugare a 340 × g per 2 minuti per pellettare i detriti cellulari, trasferire il surnatante in una provetta fresca e conservare a -80 °C.
    4. Aggiungere delicatamente 2 mL di terreno di coltura preriscaldato agli scaffold, utilizzando nuovamente la funzione di gocciolamento sulla pipetta, e riportare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore (37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità). Ripetere ogni volta che il terreno viene esaurito per la durata del periodo di crescita desiderato.

5. Recupero e applicazioni dello scaffold

NOTA: In ogni momento, diverse applicazioni possono essere utilizzate per monitorare la crescita cellulare sugli scaffold o valutare i profili di espressione genica e proteica. Le condizioni di recupero dello scaffold dipenderanno dall'analisi da eseguire, con più metodi di recupero descritti nelle sottosezioni seguenti e dimostrati nella Figura 4.

  1. Valutazione della vitalità cellulare all'interno di scaffold
    1. Sterilizzare il reagente appropriato per il saggio di vitalità cellulare filtrando attraverso un filtro sterile da 0,2 μm in una provetta da centrifuga nella cappa a flusso laminare. Preriscaldare questa soluzione sterile insieme al terreno di coltura completo e al PBS sterile in un bagno d'acqua a 37 °C.
    2. Nella cappa a flusso laminare, utilizzare pinzette sterili per trasferire gli scaffold da analizzare su una nuova piastra a 24 pozzetti. Etichettare la targhetta con tutti i dettagli pertinenti.
      NOTA: Eseguire l'analisi in triplice copia.
    3. Aggiungere 900 μL del terreno di crescita preriscaldato a ciascun pozzetto, seguiti da 100 μL del reagente sterile per la vitalità cellulare. Includere un controllo negativo aggiungendo 900 μL di terreno e 100 μL di reagente sterile di vitalità cellulare in un pozzetto senza scaffold. Riposizionare il coperchio sulla piastra e far oscillare delicatamente la piastra per ~3 minuti per distribuire uniformemente il reagente di vitalità cellulare diluito in tutto il pozzetto. Incubare la piastra a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità.
      NOTA: I tempi di incubazione dovranno essere ottimizzati per ogni linea cellulare; Fare riferimento alle linee guida del produttore. Per le linee cellulari di neuroblastoma, l'incubazione di 4-6 ore sembra ottimale.
    4. Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra dall'incubatrice e scuoterla delicatamente per alcuni secondi.
    5. Nella cappa a flusso laminare, aprire una nuova piastra traslucida a 96 pozzetti. Da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti, trasferire il terreno incubato e il reagente in tre pozzetti della piastra a 96 pozzetti con 100 μL per pozzetto, ottenendo triplicati tecnici.
      NOTA: Questo trasferimento lascerà 700 μL nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti.
    6. Coprire la piastra a 96 pozzetti con un foglio di alluminio per proteggere il reagente di vitalità cellulare dalla luce.
    7. Rimuovere ed eliminare i restanti 700 μL del contenuto del pozzetto da ciascuna impalcatura nella piastra a 24 pozzetti. Lavare ogni impalcatura due volte con 1 mL di PBS sterile.
      NOTA: Tutto il colore non verrà rimosso dalle impalcature. Questi scaffold possono quindi essere utilizzati per ulteriori applicazioni, ad esempio per la quantificazione del DNA, inserendoli in 1 mL di Triton X-100 all'1% in una soluzione di bicarbonato di sodio (NaHCO3 0,1 M) e conservandoli a -80 °C (vedere paragrafo 5.2, Figura 4B).
    8. Rimuovere la piastra a 96 pozzetti dalla cappa a flusso laminare e misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a lunghezze d'onda di 570 nm e 600 nm utilizzando un lettore per micropiastre. Registrare i valori di assorbanza a entrambe le lunghezze d'onda e seguire le istruzioni del produttore per calcolare la riduzione percentuale del reagente di vitalità cellulare da parte delle cellule.
    9. Rappresentare graficamente e analizzare statisticamente i risultati della vitalità cellulare utilizzando un software appropriato. Immettere valori biologici triplicati per produrre barre di errore e indicare la variabilità del saggio.
    10. Per esaminare i cambiamenti nella vitalità cellulare nell'arco di tempo sperimentale, eseguire un test di analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con confronti multipli delle medie utilizzando un software biostatistico appropriato.
    11. Indicare differenze significative tra i punti temporali sui grafici come ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) e **** (P≤0,0001).

figure-protocol-8
Figura 4: Recupero di scaffold per analisi diverse in ogni punto temporale. (A) Vengono recuperate tre repliche di scaffold per l'analisi della vitalità cellulare. (B) Questi scaffold possono quindi essere lavati in PBS, posti in Triton X-100 all'1% in NaHCO3 0,1 M e conservati a -80 °C per la quantificazione del DNA. (C) Altre tre repliche vengono fissate in PFA al 10% per 15 minuti, neutralizzate in PBS e conservate a 4 °C per la colorazione istologica e l'imaging. (D) Infine, 3 repliche vengono aggiunte a un reagente di lisi cellulare a base di fenolo/guanidina e conservate a -20 °C per l'analisi dell'espressione genica. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfati; PFA = paraformaldeide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Quantificazione del DNA dalle cellule negli scaffold
    NOTA: Come accennato nella nota dopo il passaggio 5.1.7, il recupero degli scaffold per la quantificazione del DNA comporta il posizionamento degli scaffold in provette da centrifuga da 2 mL contenenti 1 mL di Triton X-100 all'1% in una soluzione di NaHCO3 0,1 M seguita da conservazione a -80 °C. Prima che l'analisi del DNA possa essere eseguita, le cellule devono essere sottoposte a tre cicli di congelamento-scongelamento per lisare le cellule di neuroblastoma in modo appropriato e rilasciare il DNA per la quantificazione.
    1. Rimuovere i campioni precedentemente conservati in Triton X-100 da -80 °C. Lasciare i campioni a RT per 1-3 ore o fino allo scongelamento.
    2. Agitare i campioni per 10-20 secondi e riposizionare i campioni a -80 °C per 18-24 ore o fino a completo congelamento. Ripetere questo processo per un totale di tre cicli di gelo-scongelamento.
    3. Per massimizzare la resa del DNA, utilizzare un lisatore tissutale per distruggere le cellule negli scaffold.
      1. Posizionare una perlina di metallo nella provetta da centrifuga da 2 mL contenente un'impalcatura in Triton X-100 e posizionare la provetta all'interno dell'adattatore per agitare il campione a 50 oscillazioni al secondo per 2-3 minuti.
        NOTA: Utilizzare provette da centrifuga a fondo tondo poiché la perlina metallica potrebbe depositarsi in una provetta a fondo conico.
    4. Quantificare il DNA nella soluzione Triton X-100 applicando un colorante fluorescente di DNA a doppio filamento (dsDNA) e misurare l'emissione utilizzando un lettore di micropiastre. Fare riferimento alle linee guida del produttore; diluire i campioni in modo appropriato nel tampone di acido tris-etilendiammina tetraacetico (TE) per preparare 8 standard di dsDNA mediante diluizione seriale nel tampone TE (Figura 5).
    5. Nelle piastre nere opache a 96 pozzetti, aggiungere 100 μL di ogni standard o campione ai pozzetti in triplice copia.
    6. Diluire il colorante fluorescente di dsDNA 200 volte nel tampone TE e aggiungere 100 μL a ciascun standard/campione utilizzando una pipetta multicanale. Coprire la piastra con carta stagnola e incubare a RT per 5 min.
    7. Misurare e registrare la fluorescenza di ciascun pozzetto a 520 nm. Seguire le linee guida del produttore per calcolare la concentrazione di DNA in ciascun campione.
      NOTA: Se la concentrazione media di DNA per cellula è nota per la linea cellulare utilizzata, i valori di concentrazione del DNA possono essere convertiti in numeri di cellule utilizzando l'equazione (4).
      figure-protocol-9(4)
    8. Rappresentare graficamente e analizzare statisticamente i risultati della quantificazione del DNA utilizzando un software appropriato. Immettere valori biologici triplicati per produrre barre di errore e indicare la variabilità del saggio.
    9. Per esaminare le variazioni della concentrazione di DNA/numero di cellule nel periodo di tempo sperimentale, eseguire un test ANOVA unidirezionale con confronti multipli delle medie utilizzando un software biostatistico appropriato.
    10. Indicare differenze significative tra i punti temporali sui grafici come ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) e **** (P≤0,0001).

figure-protocol-10
Figura 5: Preparazione di otto standard di DNA per la generazione di una curva standard. Una soluzione madre di λDNA viene fornita a 100 μg/mL. Questo viene diluito 50 volte in tampone TE per creare lo standard A a 2000 ng/mL; 400 μL di A vengono quindi trasferiti nella provetta B, contenente 400 μL di tampone TE; 400 μL di B vengono quindi trasferiti e diluiti 2 volte in C, e così via fino a G. Lo standard H è composto solo da tampone TE e quindi ha una concentrazione di DNA di 0 ng/mL. Abbreviazione: TE = Tris-EDTA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Preparazione di scaffold per la colorazione istologica
    NOTA: Gli scaffold possono essere fissati e colorati per scopi di microscopia e imaging sia come scaffold interi per l'immunofluorescenza (IF) che come fette fissate in formalina e incluse in paraffina (FFPE) per la colorazione istologica o l'immunoistochimica (IHC). Ciò consente la valutazione qualitativa della penetrazione e della distribuzione cellulare all'interno degli scaffold e può essere utilizzato per valutare l'espressione delle proteine.
    1. Preparare una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 10% in PBS. Assicurarsi che vi sia una soluzione sufficiente per un volume finale di 500 μL per scaffold.
    2. Preriscaldare questa soluzione a 37 °C e aggiungere 500 μL alle provette da centrifuga da 2 mL etichettate per il recupero dello scaffold.
    3. Rimuovere gli scaffold dalle piastre a 24 pozzetti non aderenti (passaggio 4.4.4) e posizionarli nella cappa a flusso laminare.
    4. Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire gli scaffold nelle provette da centrifuga etichettate contenenti il 10% di PFA. Lasciare fissare gli scaffold nella soluzione di PFA per 15 minuti. Neutralizzare il PFA aggiungendo 500 μL di PBS a ciascuna provetta e conservare a 4 °C.
    5. Per preparare gli scaffold per l'Automatic Tissue Processor, rimuoverli da 4 °C e posizionarli con una pinzetta in cassette di plastica etichettate a matita con tutti i dettagli pertinenti. Collocare tutte le cassette nel contenitore metallico del processatore di tessuti.
    6. Iniziare il protocollo in 12 fasi sul processatore di tessuti per riparare, disidratare, eliminare le impalcature e infiltrarle con paraffina durante la notte. Raccogliere le cassette contenenti i campioni processati.
    7. Successivamente, incorporare gli scaffold in blocchi di cera di paraffina per consentire la microtomia degli scaffold in fette molto sottili per la colorazione.
      NOTA: È particolarmente importante considerare l'orientamento delle impalcature quando le si rimuove dalle cassette e le si incorpora nella cera, poiché ciò influirà sull'angolazione con cui vengono scattate le immagini. Questo è importante quando si valuta l'infiltrazione cellulare negli scaffold.
    8. Accendere l'incastro di cera e la piastra fredda; Sollevare il coperchio per controllare il livello della cera. Rabboccare se necessario.
    9. Lavorando con un campione alla volta, aprire la cassetta, rimuovere l'impalcatura e centrarla nello stampo di plastica.
    10. Versare la cera calda sul campione, assicurandosi di mantenere il corretto orientamento e regolando con pinzette calde, se necessario, prima che la cera si solidifichi. Versare altra cera per riempire lo stampo.
    11. Posiziona il coperchio della cassetta etichettato sopra lo stampo di plastica e aggiungi la cera sopra. Posizionare lo stampo sulla piastra fredda per solidificare la cera. Conservare per una notte a 4 °C per garantire che la cera di paraffina sia completamente solidificata prima della microtomia.
    12. Per prepararsi alla microtomia, accendere un bagnomaria a 35 °C, la piastra di asciugatura e il microtomo.
    13. Inserire una lama nel supporto e serrare la leva per fissarla.
    14. Impostare il rifilo e lo spessore della sezione, generalmente 5 mm per le sezioni di ponteggio.
    15. Rimuovere l'impalcatura FFPE dallo stampo, fissarla nel supporto sulla parte anteriore del microtomo e tagliare con cura la cera in eccesso attorno ai bordi del campione prima di tagliare le sezioni.
    16. Inizia a tagliare il blocco di cera ruotando la leva del microtomo, assicurando un movimento fluido.
    17. Raccogliere le sezioni a nastro, circa 3 sezioni di impalcatura alla volta, e posizionarle delicatamente nel bagnomaria a 35 °C per rimuovere le rughe. Separare delicatamente le sezioni mentre si trovano a bagnomaria usando una pinzetta.
    18. Utilizzando vetrini da microscopio rivestiti in polisseno, sollevare ogni sezione dal bagnomaria in modo che si trovi al centro del vetrino. Etichetta ogni diapositiva con una matita.
    19. Posizionare i vetrini sulla piastra di essiccazione o in un forno di essiccazione a 60 °C. Una volta essiccati, conservarli a 4 °C e procedere con la colorazione istologica o IHC richiesta.
  2. Recupero di scaffold per l'analisi dell'espressione genica
    1. Rimuovere gli scaffold dalle piastre a 24 pozzetti non aderenti dall'incubatore (passaggio 4.4.4) e posizionarli nella cappa a flusso laminare.
    2. Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire gli scaffold in provette da centrifuga da 2 mL fresche etichettate.
    3. In una cappa aspirante, aggiungere 1 mL di un reagente di lisi cellulare a base di fenolo/guanidina a ciascuna provetta per lisare le cellule negli scaffold e consentire il recupero di RNA di alta qualità.
    4. Conservare le provette a -20 °C fino al momento di eseguire l'estrazione dell'RNA utilizzando un kit appropriato. Utilizzando una reazione a catena della polimerasi quantitativa standard a trascrizione inversa (RT-qPCR)17, valutare l'espressione genica nelle cellule negli scaffold.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il modello di scaffold a base di collagene qui descritto ha molte applicazioni che vanno dallo studio della biologia del neuroblastoma allo screening di terapie antitumorali in un ambiente che è fisiologicamente più simile ai tumori nativi rispetto alla coltura cellulare 2D convenzionale. Prima di testare una determinata domanda di ricerca, è fondamentale ottenere una caratterizzazione completa dell'attaccamento, della proliferazione e dell'infiltrazione cellulare entro il periodo di tempo sperimentale desiderato. Le condizioni di crescita dipenderanno dalla biologia di ogni specifica linea cellulare. È importante sottolineare che devono essere implementati diversi metodi di valutazione della crescita cellulare per determinare le condizioni ottimali e le prestazioni robuste.

Qui, la vitalità delle cellule di neuroblastoma cresciute su scaffold è stata valutata utilizzando un test colorimetrico di vitalità cellulare. Questo test può essere eseguito con la frequenza desiderata durante tutto il periodo sperimentale. Per l'esperimento descritto, la valutazione della vitalità cellulare è stata eseguita nei giorni 1, 7 e 14 per due linee cellulari di neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cresciute su scaffold Coll-I-nHA a 4 diverse densità (Figura 6). La vitalità del giorno 1 è stata impostata come linea di base per confrontare tutte le misurazioni successive. Il tasso di riduzione del reagente di vitalità cellulare riflette la biologia cellulare e le caratteristiche di crescita delle singole linee cellulari, compresi i loro tassi di proliferazione e il metabolismo. Ci si aspettava una correlazione tra il numero di cellule seminate sugli scaffold e il livello di riduzione. In questo esperimento, la riduzione del reagente di vitalità cellulare è generalmente aumentata con ogni punto temporale per entrambe le linee cellulari a tutte le densità, come previsto.

Ogni densità è stata quindi valutata individualmente per entrambe le linee cellulari per confrontare la riduzione in diversi punti temporali. È stata eseguita un'ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Tukey per rilevare differenze significative nella riduzione tra i punti temporali (Figura 7). Sia per le linee cellulari che per tutte le densità di semina, c'è stato un aumento significativo (P<0,05) nella riduzione del reagente di vitalità cellulare confrontando il giorno 1 e il giorno 14. Ciò ha indicato un aumento significativo delle cellule metabolicamente attive presenti sugli scaffold. Questo aumento non è stato significativo in tutti i casi quando si valutano gli intervalli di 7 giorni (giorno 1 vs. giorno 7, giorno 7 vs. giorno 14), dimostrando l'importanza dell'ottimizzazione della densità di semina per raggiungere la finestra di crescita desiderata.

Per supportare i risultati del saggio di vitalità cellulare, la crescita cellulare sugli scaffold può anche essere misurata indirettamente tramite la quantificazione del dsDNA estratto dagli scaffold utilizzando un colorante fluorescente di dsDNA (Figura 8A). Come la vitalità cellulare, la quantificazione del DNA può essere eseguita con la frequenza desiderata all'interno della linea temporale sperimentale. Tuttavia, questa analisi richiede il recupero completo degli scaffold e la cessazione della crescita cellulare e quindi deve essere presa in considerazione nella pianificazione sperimentale come discusso nella sezione 1. Per questo esperimento, il DNA è stato quantificato nei giorni 1, 7 e 14 per due linee cellulari di neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cresciute su scaffold Coll-I-nHA a 4 diverse densità. Poiché la concentrazione media di dsDNA per cellula è nota per queste linee cellulari, è stato possibile ricavare il numero di cellule per campione dal DNA quantificato (Figura 8B).

La quantificazione del DNA ha dato luogo a una maggiore variabilità tra le repliche biologiche rispetto alla valutazione della vitalità cellulare, ma generalmente è aumentata per ogni punto temporale, con i livelli più alti quantificati il giorno 14. Le cellule IMR32 sembrano raggiungere un numero di cellule più elevato sugli scaffold Coll-I-nHA, come indicato dalla concentrazione di DNA, rispetto alle cellule KellyLuc. Ogni densità è stata quindi valutata individualmente per le due linee cellulari per confrontare la riduzione in tutti i punti temporali. È stata eseguita un'ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Tukey per rilevare differenze significative nella riduzione tra i punti temporali (Figura 8B).

Per entrambe le linee cellulari e per tutte le densità di semina, c'è stato un aumento significativo (P<0,05) del numero di cellule quando si confrontano il giorno 1 e il giorno 14, con l'eccezione di KellyLuc alla densità di semina 4 (1 × 105 cellule/scaffold), che non ha prodotto aumenti significativi in nessuno dei punti temporali. Analogamente ai risultati di vitalità cellulare, gli aumenti non sono stati significativi in tutti i casi durante la valutazione degli intervalli di 7 giorni (giorno 1 vs giorno 7, giorno 7 vs giorno 14). Quando si confrontano le tendenze temporali per la vitalità cellulare e la quantificazione del DNA, sono emerse alcune lievi differenze tra le due analisi. Tuttavia, nel complesso sono state osservate tendenze simili, con valori medi in aumento tra intervalli di 7 giorni per la maggior parte delle densità. Ciò dimostra l'importanza di monitorare la crescita cellulare utilizzando più di un metodo.

Successivamente è stata implementata una valutazione visiva della morfologia e della distribuzione della crescita cellulare sugli scaffold, che comprende la colorazione tradizionale dell'ematossilina e dell'eosina (H&E) e l'IHC. Si prevede che i diversi modelli di crescita delle singole linee cellulari porteranno a varie disposizioni spaziali sugli scaffold, compresi diversi gradi di penetrazione nello scaffold e il raggruppamento cellulare. Gli scaffold sono stati fissati in formalina, inclusi in paraffina e tagliati in sezioni di 5 mm (Figura 9A), preparando gli scaffold per molteplici tecniche di visualizzazione, tra cui la colorazione istologica e l'IHC.

La colorazione di routine H&E è stata applicata alle cellule Kelly, KellyCis83 e IMR32 cresciute su scaffold a base di collagene nei giorni 1, 7 e 14 (Figura 9B). Ciò ha permesso di visualizzare l'orientamento spaziale delle cellule su due scaffold a base di collagene per un periodo di 14 giorni. Le cellule Kelly sensibili al cisplatino e le cellule resistenti KellyCis83 sono state coltivate su scaffold Coll-I-nHA (Figura 9B, i) e scaffold Coll-I-GAG (Figura 9B, ii). Coerentemente con i dati pubblicati in precedenza, le cellule KellyCis83 sono cresciute a un tasso più elevato e si sono infiltrate più in profondità in entrambe le composizioni dell'impalcatura rispetto alla linea cellulare Kelly meno invasiva. La colorazione H&E di un'altra linea cellulare di neuroblastoma, IMR32, coltivata su Coll-I-nHA mostra un modello di crescita contrastante (Figura 9B, iii). Questa linea cellulare è cresciuta in grandi grappoli densamente impacchettati sugli scaffold di collagene durante il periodo di 14 giorni. La microscopia confocale in campo chiaro può essere utilizzata per visualizzare l'architettura porosa degli scaffold a base di collagene (Figura 9C) grazie all'autofluorescenza delle fibre di collagene.

Abbiamo colorato le cellule con falloidina mirata all'actina del citoscheletro e al controcolorante nucleare, 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), per monitorare tratti cellulari specifici durante la linea temporale sperimentale. Un'abbondanza di actina è stata osservata nelle cellule Kelly e KellyCis83 sugli scaffold Coll-I-GAG utilizzando questa tecnica (Figura 9D). Questi risultati dimostrano come più tecniche di imaging possano essere utilizzate per derivare informazioni spazialmente risolte da cellule di neuroblastoma cresciute su scaffold utilizzando questo protocollo. Questa caratterizzazione dei modelli di crescita cellulare su scaffold a base di collagene in un determinato periodo migliorerà la comprensione e l'interpretazione di qualsiasi saggio biochimico a valle.

L'espressione proteica da parte di cellule cresciute su scaffold a base di collagene può essere analizzata per confrontare l'attività cellulare con scenari in vivo . I dati pubblicati in precedenza hanno esaminato l'espressione della cromogranina A (CgA) come marcatore surrogato secreto di neuroblastoma da parte di cellule KellyLuc e KellyCis83Luc cresciute in monostrati cellulari e su scaffold Coll-I-nHA e Coll-I-GAG (Figura 10). La CgA è stata valutata nei terreni condizionati utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) (Figura 10A). La CgA è secreta a un tasso più elevato nella linea cellulare KellyCis83 chemio-resistente più aggressiva rispetto a Kelly (Figura 10B,C). Ciò è stato significativo il giorno 7 su entrambi gli scaffold Coll-I-GAG e Coll-I-nHA (P<0,05), mentre non c'era alcuna differenza significativa in questo momento per le cellule cresciute come monostrato da colture 2D convenzionali.

Questi risultati evidenziano anche la tempistica sperimentale ristretta quando si coltivano le cellule in un monostrato, con soli 7 giorni di crescita che si rivelano fattibili prima che le cellule raggiungano la confluenza. La crescita delle cellule sugli scaffold supera questa limitazione in quanto possono essere mantenute per un periodo più lungo in condizioni fisiologicamente più rilevanti. La suddetta combinazione di tecniche per acquisire informazioni sulla vitalità cellulare, sul contenuto di DNA, sulla morfologia cellulare e sulla disposizione spaziale e sui profili di espressione facilita la valutazione della crescita delle cellule di neuroblastoma su una serie di scaffold a base di collagene. Questo protocollo può anche essere facilmente adattato per soddisfare specifiche esigenze sperimentali e applicazioni desiderate.

figure-results-1
Figura 6: Analisi della vitalità cellulare. (A) Procedura generale per misurare la vitalità delle cellule di neuroblastoma su scaffold a base di collagene utilizzando un saggio colorimetrico di vitalità cellulare. Il periodo di incubazione deve essere ottimizzato per ogni nuova linea cellulare, facendo riferimento alle linee guida del produttore. (B) Riduzione percentuale del reagente di vitalità cellulare da parte di cellule KellyLuc e IMR32 cresciute su scaffold Coll-I-nHA a quattro diverse densità di semina iniziali, misurate nei giorni 1, 7 e 14. I campioni sono stati valutati in triplice copia biologica con barre di errore che rappresentano la deviazione standard. Abbreviazioni: nHA = nanoidrossiapatite; Coll-I-nHA = scaffold di collagene integrati con nHA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 7: Vitalità cellulare per densità di semina per cellule cresciute su Coll-I-nHA in un periodo di 14 giorni. (A) KellyLuc; (B) IMR32. I numeri di cella titolati si riferiscono alla densità iniziale di semina delle cellule sugli scaffold il giorno 0. I campioni sono stati valutati in triplice copia biologica, indicata da punti triplicati, con barre che rappresentano la media. L'ANOVA unidirezionale con confronti multipli è stata utilizzata per rilevare differenze significative nella riduzione della percentuale di reagenti di vitalità cellulare nei tre punti temporali, annotati sui grafici (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Abbreviazioni: nHA = nanoidrossiapatite; Coll-I-nHA = scaffold di collagene integrati con nHA; ANOVA = analisi della varianza; ns = non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 8: Quantificazione del DNA estratto da cellule in scaffold. (A) Processo di quantificazione del dsDNA da cellule cresciute su scaffold a base di collagene utilizzando una colorazione fluorescente di dsDNA. (B) Numero di cellule dall'analisi di quantificazione del DNA per densità di semina per cellule KellyLuc e IMR32 cresciute su Coll-I-nHA per un periodo di 14 giorni. I numeri di cella titolati si riferiscono alla densità iniziale di semina delle cellule sugli scaffold il giorno 0. I campioni sono stati valutati in triplice copia biologica, indicata da punti triplicati, con barre che rappresentano la media. L'ANOVA unidirezionale con confronti multipli è stata utilizzata per rilevare differenze significative nel numero di cellule nei tre punti temporali, annotate sui grafici (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Abbreviazioni: nHA = nanoidrossiapatite; Coll-I-nHA = scaffold di collagene integrati con nHA; dsDNA = DNA a doppio filamento; TE = Tris-EDTA; ANOVA = analisi della varianza; ns = non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 9: Fasi di processamento tissutale per l'analisi immunoistochimica degli scaffold . (A) Rappresentazione schematica del protocollo per l'elaborazione degli scaffold per l'analisi delle immagini. Questo processo consente la colorazione istologica di routine e il sondaggio di anticorpi specifici utilizzando anticorpi primari e anticorpi secondari marcati con fluorescenza. (B) Immagini rappresentative di tre linee cellulari di neuroblastoma sottoposte a colorazione H&E. Le immagini H&E vengono scattate nei giorni 1, 7, 14 per monitorare i modelli di crescita nel corso dell'esperimento. Barra della scala = 200 μm. I quadrati tratteggiati rappresentano l'area scelta per le immagini ingrandite 20x sul bordo inferiore sinistro. Barra della scala = 20 μm. (i e ii) H&E delle linee cellulari di neuroblastoma Kelly e KellyCis83 (pannelli superiore e inferiore, rispettivamente) su due tipi di scaffold a base di collagene. (iii) H&E della linea cellulare IMR32, che rappresenta la crescita cellulare raggruppata sullo scaffold Coll-I-nHA. (C) Immagine rappresentativa della linea cellulare di Kelly, sottoposta a microscopia confocale in campo chiaro. L'autofluorescenza del collagene consente la visualizzazione dell'impalcatura porosa. Barra della scala 10x = 200 μm, barra della scala 20x = 20 μm. (D) Immagine rappresentativa degli scaffold incorporati seguita da analisi mediante IHC con falloidina e DAPI a ingrandimento 10x, barra della scala = 200 μm. I quadrati interni più piccoli rappresentano le immagini ingrandite (20x), la barra della scala = 20 μm. Abbreviazioni: nHA = nanoidrossiapatite; Coll-I-nHA = scaffold di collagene integrati con nHA; GAG = glicosaminoglicano; Coll-I-GAG = scaffold di collagene integrati con condroitina-6-solfato; H&E = ematossilina ed eosina; IHC = immunoistochimica; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 10: Espressione proteica da parte di cellule di neuroblastoma cresciute su scaffold a base di collagene 3D rispetto alla plastica 2D. (A) Uno schema di come l'ELISA CgA è stato eseguito su terreni condizionati di cellule cresciute su scaffold plastici 2D o a base di collagene 3D. (B) Livelli di espressione della proteina CgA prelevati da terreni condizionati di cellule cresciute su un monostrato plastico 2D. Poiché le cellule hanno raggiunto la confluenza dopo 7 giorni, il punto temporale di 14 giorni non era leggibile. Al giorno 7 sulla plastica, non c'era alcuna differenza significativa nei livelli di CgA tra le linee cellulari Kelly e KellyCis83. (C) L'ELISA CgA è stato eseguito utilizzando terreni condizionati di cellule cresciute su scaffold a base di collagene per 14 giorni consecutivi. Il giorno 7, su entrambi gli scaffold di collagene, i livelli di CgA sono più alti nella linea cellulare KellyCis83 più aggressiva, evidenziando livelli più rilevanti fisiologici di CgA nella matrice 3D rispetto al monostrato 2D. Questa figura è stata modificata da Curtin et al.17. Abbreviazioni: 3D = tridimensionale; 2D = bidimensionale; CgA = cromogranina A; ELISA = saggio di immunoassorbimento enzimatico; nHA = nanoidrossiapatite; Coll-I-nHA = scaffold di collagene integrati con nHA; GAG = glicosaminoglicano; Coll-I-GAG = scaffold di collagene integrati con condroitina-6-solfato; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; HRP = perossidasi di rafano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il modello 3D di cellule tumorali con scaffold si è dimostrato uno strumento prezioso e versatile per ottenere informazioni meccanicistiche sulla crescita, la vitalità e l'infiltrazione delle cellule di neuroblastoma in una TME32 semplificata. Il modello 3D di neuroblastoma qui descritto imita la TME minima e fornisce dati fisiologicamente più rilevanti rispetto a una coltura monostrato 2D. Uno dei principali svantaggi della coltura cellulare 3D è l'aumento della complessità sperimentale e i tempi più lunghi. Qui è descritto un protocollo ottimizzato per la semina, la crescita e il mantenimento di cellule di neuroblastoma su scaffold a base di collagene, seguito da analisi e applicazioni a valle, che producono una robusta caratterizzazione della crescita cellulare. Il nostro obiettivo era quello di ottenere informazioni sulla densità ottimale di semina cellulare per gli scaffold per creare un ambiente prevedibile e controllabile per la valutazione dei trattamenti farmacologici antitumorali in una rapida finestra sperimentale di 14 giorni. La combinazione di tutti questi semplici protocolli descritti fornisce una valutazione completa della crescita delle cellule di neuroblastoma nel sistema di coltura in vitro basato su scaffold.

I punti critici nell'impostazione del protocollo sono stati enfatizzati per consentire agli scienziati di stabilire rapidamente lo stesso nei loro laboratori. Ad esempio, i tempi di incubazione indicati per una migliore esecuzione del test colorimetrico di vitalità cellulare consentono una penetrazione più profonda del reagente nei pori dell'impalcatura per raggiungere tutte le cellule. Inoltre, la tecnica di colorazione fluorescente del dsDNA è robusta e semplice; tuttavia, il rilascio di DNA dagli scaffold richiede una vigorosa lisi cellulare poiché le cellule sono "intrappolate" all'interno delle fibre di collagene.

Utilizzando il semplice saggio di quantificazione del DNA descritto, possiamo identificare la fase di crescita logaritmica su scaffold a base di collagene per lo screening di farmaci antitumorali utilizzando questo modello. Nel contesto sperimentale descritto, sono state utilizzate 4 densità iniziali di semina cellulare con un periodo complessivo di 14 giorni e punti temporali di analisi nei giorni 1, 7 e 14. Abbiamo identificato che le cellule KellyLuc seminate a 4 × 105 cellule/scaffold hanno la finestra di proliferazione attiva più significativa tra i giorni 7 e 14. Questi dati di crescita della fase logaritmica consentiranno un'interpretazione affidabile di vari esperimenti di citotossicità cellulare. Elimina le speculazioni su qualsiasi declino della crescita o morte cellulare derivante dalla crescita soppressa sulla piattaforma porosa 3D piuttosto che dalla tossicità dei farmaci. La vitalità cellulare è anche una valutazione ampiamente utilizzata per l'idoneità delle piattaforme 3D a supportare la crescita di diversi tipi di cellule33,34. Sebbene esistano molti saggi per misurare la vitalità cellulare, tra cui la colorazione viva/morta, la misurazione dell'ATP, i saggi di proliferazione, abbiamo scoperto che l'uso del test di vitalità cellulare colorimetrica Alamar Blue è una tecnica semplice ed efficace per supportare i dati di quantificazione del DNA.

L'uso combinato della quantificazione del DNA e della vitalità cellulare ha fornito prove complementari che, in media, la densità ottimale per le cellule del seme sullo scaffold per ottenere una crescita continua per un periodo di 14 giorni è di 2-4 × 105 cellule/scaffold. Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per soddisfare diversi intervalli di tempo sperimentali, punti temporali di analisi e applicazioni a valle. Sebbene questo protocollo descriva la valutazione della crescita cellulare in monocoltura di cellule di neuroblastoma su scaffold, gli scaffold sono facilmente modificabili per l'uso come piattaforma per la co-coltura, descritta da do Amaral et al., che hanno utilizzato scaffold di collagene-GAG per co-coltivare cheratinociti e fibroblasti in un'indagine sulla guarigione delle ferite35.

Il modello 3D descritto consente la visualizzazione della crescita e dell'infiltrazione cellulare utilizzando diverse tecniche ben note, come l'immunofluorescenza e l'H&E standard. È importante visualizzare le cellule insieme alla caratterizzazione della crescita utilizzando saggi biochimici a causa della diversità della morfologia cellulare e dei modelli di crescita sugli scaffold. La comprensione del modello di crescita può fornire informazioni sul comportamento di crescita e sulla risposta futura ai farmaci antitumorali. Ad esempio, la crescita di IMR32 utilizzando la quantificazione del DNA produce modelli simili a quelli di Kelly, anche se dopo la visualizzazione utilizzando H&E, IMR32 cresce in cluster più grandi rispetto a Kelly, che ha mostrato una crescita più dispersa (Figura 9). Questi diversi modelli di crescita delle linee cellulari negli scaffold riflettono lo scenario clinico di eterogeneità tumorale. L'esame della risposta ai farmaci antitumorali utilizzando un pannello di linee cellulari con morfologie diverse in scaffold 3D aumenterà il valore predittivo per la risposta del paziente agli stessi farmaci.

Il rilevamento dell'espressione genica o proteica può essere eseguito anche utilizzando altri approcci come la RT-qPCR o l'ELISA se la proteina di interesse è secreta. Un marcatore surrogato della progressione del neuroblastoma, la cromogranina A (CgA)36, è stato utilizzato per caratterizzare ulteriormente la crescita delle cellule di neuroblastoma in 3D. Come descritto nel precedente lavoro17, la secrezione di CgA aumentava con la proliferazione delle cellule (Figura 10). Mentre la coltura cellulare monostrato non è stata in grado di catturare questo aumento, poiché la proliferazione ha fatto sì che le cellule raggiungessero la piena confluenza nelle piastre di coltura, l'uso degli scaffold di collagene 3D ha permesso una valutazione prolungata della secrezione di CgA.

Questo modello 3D in vitro potrebbe non essere adatto a tutte le domande di ricerca per studiare la biologia del neuroblastoma e la risposta alle terapie. Una delle limitazioni è la penetrazione irregolare delle cellule all'interno degli scaffold e la formazione di gruppi cellulari di dimensioni variabili, che dipende da una determinata linea cellulare e può portare a una diffusione incontrollabile di nutrienti e farmaci testati. Questa caratteristica influisce sulla robustezza nello screening terapeutico. Tuttavia, nonostante questa limitazione, è importante considerare che i tumori nativi sono anche eterogenei per dimensioni e distribuzione delle cellule tumorali e contengono molti altri tipi di cellule all'interno del tessuto tumorale. Per superare questa limitazione, proponiamo l'uso di ogni scaffold popolato da cellule come un singolo microtessuto per il quale saranno ottimizzati i seguenti parametri: (a) tempi di incubazione affinché il reagente di vitalità cellulare raggiunga le cellule e i cluster cellulari, e (b) lisatura delle cellule nel tampone Triton X-100 mediante preprocessamento delle cellule su scaffold con un liser tissutale per rilasciare il DNA delle cellule contenute in profondità nello scaffold.

Un'altra limitazione tecnica di questo protocollo è la mancanza di test meccanici di ogni lotto di scaffold di nuova fabbricazione per questo modello. Tuttavia, l'utilizzo del robusto processo di produzione degli scaffold, che sono stati ampiamente caratterizzati in relazione alle proprietà fisiche e chimiche degli scaffold, come il modulo di compressione e trazione, la porosità e la struttura visiva dei pori e l'omogeneità, garantisce che le qualità dell'impalcatura siano mantenute attraverso i lotti 21,24,27,30,37.

In sintesi, questo articolo presenta una serie di semplici metodi per l'analisi della crescita cellulare su scaffold a base di collagene. Sia la timeline sperimentale che i punti di analisi possono essere scambiati a seconda delle specifiche domande di ricerca. Questo protocollo è adattabile anche ad altri tipi di cellule. I risultati mostrati sopra forniscono prove su come questa raccolta di metodi abbia fornito informazioni sulla densità di semina ottimale per varie linee cellulari di neuroblastoma per creare una crescita continua nell'arco di 14 giorni. L'amalgama dei risultati ottenuti da tutti i metodi di questo protocollo produce una comprensione superiore della crescita cellulare all'interno della matrice di collagene 3D. L'utilizzo futuro di questo modello comporterà probabilmente sistemi di co-coltura specifici per il neuroblastoma TME e la sperimentazione di vari nuovi farmaci antitumorali.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Children's Research Centre (NCRC), dall'Irish Research Council (IRC) e da Neuroblastoma UK. Le illustrazioni sono state realizzate con BioRender.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellule
IMR-32ATCCCCL-127
KellyECACC82110411
KellyCis83Prodotto in laboratorio – derivato da Kelly (Piskareva et al., 2015)-Aumento dell'esposizione al cisplatino. Acquisizione di resistenza crociata
SH-SY5YATCCCRL-2266
Monouso
Filtro siringa 0,22 µmMillexSLHP033RS
Eppendorf 1,5 mLEppendorf0030 120.086
Flacone sterile da 100 mLStarstedt-
Pipetta in plastica da 10 mLCellstar607 180
Falcon tube da 15 mLStarstedt62.554.502
Pipetta in plastica da 25 mLCellstar760 180
Falcon tube da 50 mLStarstedt62.547.254
Pipetta in plastica da 5 mLCellstar606 180
Punzone per biopsia da 6 mmKai MedicalBP-60F
Carta stagnola--
Cover SlipMenzel-Glaser-
HYPERflaskCorningCLS10030
Vetrine per microscopioThermo ScientificJ1840AMNT
Piatto 96 pozzetti nero opacoCostar3915
Stecche P10 steriliStarlabS1121-3810
Stecche P1000 steriliStarlabS1122-1830
Stecche P20 steriliStarlabS1123-1810
Stecche P200 steriliStarlabS1120-8810
T-175 (175 cm2 flask)Sarstedt83.3912
T-75 (75 cm2 flask)Sarstedt83.3911.302
Piatto 96 pozzetti trasparenteCellstar655180
Piatto 24 pozzetti traslucido non aderenteCellstar83.3922.500
Attrezzatura
AutoclaveAstell-
Processore automatico di tessutiLeicaTP1020
Centrifugatrice 5804Eppendorf-
EmatocitometroHausser  Scientific-
IncubatriceThermoScientific-
MicrotomoLeicaRM2255
FornoMemmertCalibrato da: Cruinn diagnostics Ltd
Pipetta P10Gilson
Pipetta P100Gilson
Pipetta P1000Gilson
Pipetta P20GilsonCalibrato da: Cruinn diagnostics Ltd
Pipetta P200GilsonCalibrato da: Cruinn diagnostics Ltd
Vaschetta per galleggiamento di sezioni in paraffinaElectrothermalMH8517Calibrato da: Cruinn diagnostics Ltd
Dispensatore elettronico per pipetteCorningStripipetterUltraCalibrato da: Cruinn diagnostics Ltd
Cooler per piastreLeicaEG1140CCalibrato da: Cruinn diagnostics Ltd
Frigorifero -20 °CLiebherr-
Frigorifero -80 °CLiebherr-
Frigorifero 4 °CLiebherr-
Seesaw RockerDLAbSK-D1807-E
Spectrophotometer – Victor3V PlatereaderPerkinElmer1420
Cappuccio per coltura tissutale/Cappuccio a flusso laminareGMI8038-30-1044
Tissue LyserQiagenTissueLyser LT
Pinzette--
Bagno d'acquaGrant-
Incorporatore di ceraLeicaEG1140H
Materiali
1 L AcquaAdrona - Biosciences568
1% Triton-XSigma Aldrich9002-93-1
Compresse 10x PBSSigma AldrichP4417-100TAB
Paraformaldeide al 37%Sigma-AldrichF8775
Alamar Blue Cell Viability ReagentInvitrogenDAL1100
Scafandro collagene-glicosaminoglicanoTissue engineering research group (TERG)
Scafandro collagene-nanoidrossiapatiteTissue engineering research group (TERG)
dH20Adrona - Biosciences568
EosinaSigma-AldrichE4009Prodotto come indicato in: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
EtOHSigma-Aldrich1.00983.2500Prodotto come indicato in: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
F12Gibco21765-029
FBSGibco10270-106
EmatossilinaSigma-AldrichHHS32-1L
L-GlutamminaGibco25030-024
MEMGibco21090-022
miRNA easy KitQiagen217004
MNEAA’sGibco11140-035
Penicillina/strep

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davidoff, A. M. Neuroblastoma. Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).
  2. Matthay, K. K., et al. Neuroblastoma. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078(2016).
  3. Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models. Acta Biomaterialia. , (2021).
  4. Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma. Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).
  5. Walker, C., Mojares, E., Del Río Hernández, A. Role of extracellular matrix in development and cancer progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028(2018).
  6. Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
  7. Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. Dynamic reciprocity in the wound microenvironment. Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).
  8. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744(2020).
  9. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6, 11(2008).
  10. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4, 38(2006).
  11. Ouellette, J. N., et al. Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer. Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).
  12. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  13. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  14. Hume, R. D., et al. Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds. Scientific Reports. 8 (1), 12658(2018).
  15. Fitzgerald, K. A., et al. The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics. Biomaterials. 66, 53-66 (2015).
  16. Sapudom, J., Pompe, T. Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices. Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).
  17. Curtin, C., et al. A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models. Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).
  18. Gavin, C., et al. Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix. Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).
  19. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).
  20. Casal, eJ., Crane, J. S. Biochemistry, Glycosaminoglycans. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2019).
  21. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).
  22. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).
  23. Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).
  24. Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).
  25. Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).
  26. Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering. ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).
  27. Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).
  28. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  29. Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair. Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).
  30. Tierney, C. M., et al. The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).
  31. Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment. PLoS One. 7 (7), 41679(2012).
  32. Nolan, J. C., et al. Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges. Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).
  33. Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration. Interface Focus. 4 (1), 20130050(2014).
  34. Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds. Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
  35. do Amaral, R. J. F. C., et al. Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371(2019).
  36. Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes. World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).
  37. O'Brien, F. J., et al. The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering. Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Errata corrige

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds
Posted by JoVE Editors on 6/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Fergal J. O’Brien3,4,5
Olga Piskareva1,2,3,5,6
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
6National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

to:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Graeme Kelly4
Fergal J. O’Brien3,5,6
Olga Piskareva1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen’s Green, Dublin 2, Ireland
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

Tag

Modello di neuroblastomascaffold di collagenecoltura tridimensionalemicroambiente tumoralesaggio di viabilit cellularequantificazione del DNAcolorazione immunoistochimicascaffold di glicosaminoglicaniscaffold di nanoidrossiapatiteproliferazione cellulare

Articoli correlati