Ricostruire il retinoblastoma umano in vitro

Il retinoblastoma umano (RB) è un tumore raro e fatale derivato dai precursori dei coni retinici ^1,2,3, è il tipo più comune di neoplasia intraoculare nell'infanzia⁴. L'inattivazione omozigote del gene RB1 è la lesione genetica iniziale in RB⁵. Tuttavia, i topi con mutazioni RB1 non riescono a formare il tumore retinico². Sebbene i tumori del topo possano essere generati con la combinazione di mutazioni di Rb1 e altre modificazioni genetiche, mancano ancora delle caratteristiche di RB 6^umano. Grazie allo sviluppo della differenziazione organoide retinica, è stato possibile ottenere il RB derivato da hESC, che mostra i caratteri dell'RB umano¹.

Negli ultimi dieci anni sono stati stabiliti numerosi protocolli per la differenziazione degli organoidi retinici, tra cui 2D⁷, 3D⁸ e una combinazione di 2D e 3D⁹. Il metodo utilizzato qui per generare il RB umano è il consolidamento della cultura aderente e della cultura fluttuante⁹. Differenziando l'hESC mutato RB1 in organoidi retinici, la formazione di RB viene rilevata intorno al giorno 45, e quindi prolifera rapidamente intorno al giorno 60. Il giorno 90, è possibile l'isolamento dei RB e la generazione della linea cellulare RB; inoltre, RB circonda quasi tutti gli organoidi retinici al giorno 120.

La RB derivata da hESC è un modello innovativo per esplorare l'origine, la tumorigenesi e i trattamenti per la RB. In questo protocollo, la generazione di hESC di editing genetico, la differenziazione di RB e la caratterizzazione per RB sono descritte in dettaglio.

Questo studio è approvato dal Comitato etico istituzionale del Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. Le H9 hESC sono ottenute dal WiCell Research Institute.

1. Generazione di hESC RB1 mutato

1. Vettore di targeting CRISPR/Cas9 per il knockout (KO) di RB1.
   1. Progetta una coppia di sgRNA. Per l'ablazione di RB1, colpire il primo esone di questo gene. La sequenza di primer in avanti è CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, e la sequenza di primer inversa è AAACCCGAAAAACGGCCCCCCCCGC.
      NOTA: per la mutazione RB1 specifica, è necessario anche un modello riparato. In questo protocollo, la linea cellulare RB1-KO viene utilizzata come esempio.
   2. Digerire 1 μg di pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro con enzimi di restrizione BbsI (vedere Tabella dei materiali) per 30 minuti a 37 °C seguendo le istruzioni del produttore.
   3. Purificare i plasmidi digeriti utilizzando un kit di purificazione secondo le istruzioni dei produttori.
      NOTA: Le reazioni enzimatiche possono essere pulite direttamente senza gel di agarosio utilizzando il kit di purificazione (vedere Tabella dei materiali).
   4. Fosforilare e ricottura ogni coppia di oligo utilizzando la polinucleotide chinasi T4 (PNK) (Tabella dei materiali) con la reazione comprendente 1 μL di oligo1 (100 μM), 1 μL di oligo2 (100 μM), 1 μL di tampone di legatura T4 10x, 6,5 μL di ddH₂O e 0,5 μL di PNK T4.
      NOTA: i primer avanti e indietro nel punto 1.1.1 sono una coppia di oligo. Fosforilare e ricottura gli oligo in un termociclatore utilizzando i seguenti parametri: 37 °C per 30 min; 95 °C per 5 min; scendere a 25 °C a 5 °C al minuto.
   5. Diluire gli oligo fosforilati e ricotti 200 volte aggiungendo 1 μL di oligo reagente a 199 μL di acqua priva di nucleasi a temperatura ambiente (RT).
   6. Impostare la reazione di legatura e incubare a RT per 10 minuti mescolando quanto segue: 50 ng di plasmide digerito Bbs1 dal punto 1.1.3, 1 μL di oligo duplex dal punto 1.1.5, 5 μL di tampone di legatura 2x, 1 μL di ligasi e rabboccare fino a 10 μL utilizzando acqua priva di nucleasi.
   7. Trasformare la miscela di legatura e sequenziare le colonie positive per il passaggio successivo.
      NOTA: utilizzare il primer U6 avanti o indietro per il sequenziamento.
      1. Scongelare le cellule competenti sul ghiaccio.
      2. Prelevare 50 μL delle cellule competenti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
      3. Aggiungere 1 μL della miscela di legatura del punto 1.1.6 nelle cellule competenti.
      4. Mescolare delicatamente pipettando su e giù per il tubo tre volte.
         NOTA: Non vortice.
      5. Mettere il composto sul ghiaccio per 30 minuti.
      6. Shock termico della miscela a 42 °C per 90 s.
      7. Aggiungere 950 μL di brodo Luria-Bertani (LB) a temperatura ambiente senza antibiotico al tubo.
      8. Posizionare il tubo in uno shaker a 300 giri/min a 37 °C per 60 minuti.
      9. Riscaldare le piastre LB (peptone, peptone da caseina, cloruro di sodio, agar-agar e ampicillina) a 37 °C in anticipo.
      10. Distribuire 50-100 μL delle cellule e della miscela di legatura sulle piastre a RT.
      11. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
      12. Raccogliere 12 colonie dalla piastra e trasferirle al mezzo LB con ampicillina. Posizionare il mezzo su uno shaker a 300 giri / min per 60 minuti.
      13. Utilizzare 1 μL della soluzione batterica (dal punto 1.1.7.12) come modello per la PCR e selezionare le colonie positive.
      14. Sequenziare le colonie positive con i primer U6, utilizzare la colonia con le sequenze di sgRNA progettate nella fase successiva.
   8. Estrarre il plasmide usando un kit midi (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: La qualità e la quantità del plasmide utilizzando un mini kit non sono sufficienti per il seguente esperimento di nucleofezione. Il kit Midi o maxi è più adatto del mini kit.
2. Coltura HESC e nucleofezione.
   NOTA: Preriscaldare tutti i reagenti a RT.
   1. Scongelare 1 x 10 6 cellule H9 in una piastra a⁶ pozzetti pre-rivestita con 10 μM di Y-27632 (inibitore di ROCK) e 2 ml di terreno di coltura fresco ncEpic-hiPSC/hESC.
      NOTA: Rivestire la piastra a 6 pozzetti con matrice di membrana basale ridotta con fattore di crescita dell'1% per almeno 30 minuti a 37 °C prima dell'uso.
   2. Il giorno successivo, rimuovere il surnatante, sciacquare le cellule con 1x soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS), quindi aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco ncEpic-hiPSC/hESC.
   3. Cambiare il terreno ogni giorno con 2 ml di terreno di coltura fresco ncEpic-hiPSC/hESC nei successivi 3-5 giorni fino a quando le cellule crescono fino a circa l'80% di confluenza.
   4. Passare una o due volte per regolare lo stato dell'hESC.
      NOTA: Il modo più semplice per identificare lo stato dell'hESC è la morfologia.
   5. Coltivare le cellule H9 indifferenziate in una piastra a 6 pozzetti fino a raggiungere l'80% di confluenza.
   6. Cambiare il terreno 2 ore prima della nucleofezione con 2 ml di terreno di coltura fresco ncEpic-hiPSC/hESC miscelato con 10 μM di Y-27632 e precoat un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti utilizzando la matrice di membrana basale ridotta al fattore di crescita all'1%.
   7. Aspirare il mezzo e risciacquare con 1 mL di DPBS preriscaldato.
   8. Rimuovere il DPBS e incubare con 1 mL di enzima di dissociazione cellulare (vedere Tabella dei materiali) per 3,5 minuti a 37 °C.
   9. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura fresco ncEpic-hiPSC/hESC alle cellule e pipettare due volte per trasformare le cellule H9 in una sospensione a cellula singola.
   10. Estrarre 100 μL della miscela per il conteggio delle cellule e trasferire il resto in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente altri 2 mL di terreno di coltura ncEpic-hiPSC/hESC all'interno.
   11. Centrifugare a 200 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere circa 2 x 10⁶ cellule in un volume di reazione di 100 μL. Secondo il protocollo del produttore, ottimizzare il volume per le cellule, i plasmidi, il nucleofector e le condizioni di reazione. Vedere la tabella dei materiali per il sistema di nucleofezione utilizzato in questo protocollo.
       NOTA: Generalmente, le bolle non sono consentite durante la nucleofezione.
   12. Dopo la trasfezione, trasferire le cellule nella piastra prepatinata a 12 pozzetti, integrare con 1,5 ml di terreno di coltura ncEpic-hiPSC/hESC e 10 μM di Y-27632, quindi coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ .
   13. Cambia il mezzo ogni giorno. Dopo 48 ore, aggiungere 2 μg/ml di puromicina per la selezione cellulare circa una settimana.
       NOTA: Numerose cellule muoiono durante i primi 3 giorni. Le cellule rimanenti possono proliferare e generare in colonie nella settimana successiva alla selezione della puromicina. Nella settimana di selezione, assicurarsi che il terreno contenga sempre 2 μg/ml di puromicina.
   14. Scegli le colonie manualmente al microscopio.
       NOTA: La morfologia della colonia è la stessa della colonia hES. Tagliare le colonie in pezzi (2-6 pezzi per colonia) con una punta di pipetta bianca/normale da 10 μL nel mezzo e trasferire una colonia in un pozzetto preverniciato di una piastra a 12 pozzetti.
   15. In primo luogo, identificare le mutazioni RB1 e le situazioni off-target (Tabella 1), e quindi pluripotenza per caratterizzare la linea cellulare H9 knockout RB1.
       NOTA: Rilevare le mutazioni RB1 e le situazioni off-target utilizzando PCR e sequenziamento sanger. Identificare i marcatori di pluripotenza mediante RT-PCR e immunofluorescenza.

2. Generazione di retinoblastoma umano

1. Manutenzione di RB1-KO hESC.
   1. Coltura delle cellule H9 geneticamente modificate in una piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice basale ridotta con fattore di crescita con 2 ml di terreno di coltura ncEpic-hiPSC/hESC e cambia il terreno ogni giorno.
   2. Passaggio con tampone EDTA per 3,5 minuti a 37 °C o 5 minuti a RT.
      NOTA: il tampone EDTA è la miscela di 1x DPBS, 5 mM EDTA e 0,9 mg / mL di NaCl.
2. Differenziazione delle cellule retiniche.
   NOTA: preparare il mezzo I prima della differenziazione. Per preparare Medium I, mescolare 24,5 ml di Modified Eagle Medium (DMEM)/Miscela di nutrienti F-12(F12)-Glutammina (1x), 24,5 mL di terreno basale neuronale, 250 μL di 100x supplemento A, 500 μL di 50x supplemento B, 0,1 mM ß-mercaptoetanolo e 250 μL di 100x L-glutammina. Preriscaldare tutte le miscele a RT prima dell'uso.
   1. Far crescere l'hESC RB1-KO fino all'80% di confluenza in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
   2. Rimuovere il mezzo e risciacquare le celle con 1 mL di 1x DPBS.
   3. Elevare le colonie cellulari utilizzando 1 mL di tampone dispase (vedere Tabella dei materiali) per 5 minuti a 37 °C.
      NOTA: Controllare le colonie cellulari al microscopio. Di solito, ci vogliono 5 minuti per il bordo delle colonie per rotolare.
   4. Aspirare il tampone dispase e sciacquare delicatamente le cellule una volta con 1 mL di 1x DPBS.
   5. Aggiungere 1 mL di Medium I nel pozzetto.
   6. Tagliare le colonie in pezzi (6-9 pezzi per colonia) con una punta di pipetta bianca / normale da 10 μL nel mezzo.
      NOTA: Generalmente, circa il 60% -70% delle cellule si stacca dal pozzo. Utilizzare un raschietto cellulare per raschiare le cellule rimanenti nel mezzo.
   7. Raccogliere tutte le cellule centrifugando in una provetta da 15 ml a 200 x g per 5 minuti.
   8. Lasciare circa 50 μL del surnatante per disperdere le cellule nel mezzo, quindi mescolare le cellule con 250 μL di matrice di membrana basale ridotta dal fattore di crescita agitando delicatamente.
      NOTA: Mantenere la matrice della membrana basale ridotta con fattore di crescita a 4 °C o sul ghiaccio prima dell'uso. Se è aliquotato e conservato a -20 °C, porlo a 4 °C per una notte o almeno 1 ora prima dell'uso.
   9. Conservare il tubo da 15 ml con le celle sospese in un incubatore a 37 °C per 20 minuti.
      NOTA: Assicurarsi che le cellule e la matrice della membrana basale ridotta dal fattore di crescita formino un gel solidificato.
   10. Aggiungere 1 mL di Medium I nel tubo da 15 mL, quindi pipetare leggermente il gel solidificato due o tre volte per disperdere il grumo con una pipetta da 1 mL.
   11. Aggiungere 9 mL di Medium I e trasferire la sospensione cellulare in un piatto di coltura cellulare da 10 cm.
   12. Spostare il piatto in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂ e impostare il giorno come giorno 0.
   13. Esaminare le cellule usando un microscopio il giorno 1.
       NOTA: Migliaia di cisti cave potrebbero essere osservate nel piatto. In media, si osservano da 3 a 4 cisti in un pezzo di gel.
   14. Cambia il mezzo il giorno 5. Raccogliere il surnatante in un tubo da 15 ml, attendere che le cisti si depositino sul fondo, quindi rimuovere il mezzo e sostituirlo con Medium I fresco.
       NOTA: se il mezzo diventa giallo il giorno 4, cambiare il mezzo il giorno 4, altrimenti il giorno 5. Aggiungere 10 ml di Medium I fresco nel piatto originale. Centinaia di cisti si sono già attaccate alla superficie della coltura; Tienili lì.
   15. Disperdere le cisti nel tubo in due piatti di 10 cm.
       NOTA: Assicurati che almeno 300 cisti siano in un piatto. Se le cisti non sono confluenti, non separare le cisti in altri piatti; Riportateli al piatto originale da 10 cm.
   16. Il giorno 7, la maggior parte delle cisti (superiori al 95%) si attaccano al piatto, si diffondono e formano colonie aderenti.
       NOTA: Già dal giorno 3, si possono osservare le colonie aderenti.
   17. Il giorno 10, cambia il mezzo con Medium I fresco. Assicurati che tutte le cisti siano attaccate al piatto.
   18. Preparare Medium II prima della fase successiva miscelando quanto segue: 36 mL di DMEM, 12 mL di F12, 2% del supplemento B (v/v), 0,1 mM MEM Non-Essential Acids Solution (NEAA).
   19. Assicurarsi che le cellule siano distribuite entro il giorno 13-17. Esegui il passaggio successivo il giorno 15 quando le cellule sono sparse ma non interagiscono con le colonie vicine.
   20. Risciacquare le cellule una volta con 1 mL di DPBS e aggiungere 1 mL di soluzione di dispase per 5 minuti a 37 °C.
       NOTA: Entro 5 minuti, il bordo delle celle si eleva.
   21. Rimuovere il tampone dispase e risciacquare delicatamente le colture con 1 mL di 1x DPBS.
   22. Aggiungere 10 ml di Medium II a ciascun piatto da 10 cm e coltura in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ .
   23. Le colture aderenti si staccano spontaneamente dopo 24 ore e si assemblano in organoidi retinici.
       NOTA: Numerose cellule che non formano gli organoidi morirebbero nei 2 giorni successivi.
   24. Tre giorni dopo il distacco, raccogliere le cellule dal piatto di coltura cellulare e lasciare che gli organoidi si depositino in un tubo da 15 ml.
   25. Rimuovere il surnatante dalla provetta e trasferire gli organoidi in una nuova capsula non aderente (capsula di Petri) con 10 ml di Medium II per i quattro giorni successivi.
   26. Preparare Medium III miscelando DMEM: F12 con rapporto 3:1 (v/v), supplemento B al 2% (v/v), 0,1 mM di soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (NEAA), siero bovino fetale all'8% (FBS) (v/v), 100 μM di taurina e 2 mM di glutammina.
   27. Una settimana dopo il distacco, cambia il mezzo in Medio III.
   28. Da questo giorno in poi, coltivare gli organoidi in Medium III e rinfrescare il terreno due volte alla settimana.
3. Istituzione della linea cellulare RB.
   NOTA: Tutti i reagenti sono preriscaldati a RT.
   1. Il giorno 90, i RB (80% -90%) comprendono gli organoidi retinici. Pertanto, scegliere gli organoidi RB di 90 giorni per la generazione della linea cellulare RB.
   2. Preparare il mezzo 1640 mescolando il mezzo Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 con il 10% di FBS.
   3. Tagliare il RB a pezzi (20-25 pezzi per RB) con un coltello microchirurgico al microscopio in mezzo RPMI-1640.
   4. Rimuovere il mezzo RPMI-1640 e trattare i pezzi con tripsina/EDTA allo 0,25% per 10 minuti a 37 °C.
   5. Aggiungere il mezzo RPMI-1640 per terminare la reazione e centrifugare a 200 x g per 5 minuti.
   6. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1640 mezzo in un piatto non aderente.
   7. La linea cellulare RB è una coltura galleggiante. Cambiare il mezzo due volte a settimana e passare le cellule RB entro 2 settimane.
      NOTA: Il tasso di proliferazione delle cellule RB primarie è piuttosto lento.

La procedura di generazione di RB è spiegata nella Figura 1, che combina la coltura aderente e fluttuante. È stato possibile raccogliere il RB umano da RB1-KO hESC e ottenere la linea cellulare RB isolando gli organoidi RB.

Qui, il protocollo fornisce i dettagli della differenziazione in diverse fasi (Figura 2). Nei primi 3 giorni si formano sfere cave che si attaccano alla superficie della coltura e poi si espandono (Figura 2A-E). Dal giorno 15 in poi, le cellule sono elevate e la coltura in sospensione (Figura 2F). Il giorno dopo il distacco, si formano organoidi retinici e sono visibili i bordi luminosi (Figura 2G, frecce nere). Inoltre, è probabile che le cellule al di fuori degli organoidi muoiano nella settimana successiva (Figura 2G, frecce arancioni). Il giorno 27, l'architettura delle vescicole ottiche è evidente e circa il 90% degli organoidi mostra questa struttura (Figura 2H); Gli organoidi senza questa struttura potrebbero essere scartati. Il primo rilevamento del RB avviene il giorno 45, e poi diventa palpabile il giorno 50 (Figura 2I). Quando cresce fino al giorno 90, le strutture delle vescicole ottiche sono principalmente avvolte dal RB (Figura 2J). Nel frattempo, il RB potrebbe essere isolato come linea cellulare RB per un'ulteriore coltura (Figura 2K). Oltre l'80% degli organoidi retinici verrebbe completamente avvolto dal RB il giorno 105 (Figura 2L). Essi mostrano un'elevata espressione di Ki67 (marcatore di proliferazione) e SYK (marcatore oncogenetico) confrontandosi con gli organoidi retinici derivati da H9, che indica la tumorigenesi negli organoidi RB (Figura 2M,N). Inoltre, l'alta espressione di ARR3 (precursore del cono) e CRX (marcatore precursore dei fotorecettori) negli organoidi RB dimostra che provengono da cellule precursori dei coni (Figura 2O,P).

La procedura di generazione di RB subisce principalmente tre fasi con cambiamenti morfologici prima della formazione di RB; qui, lo studio fornisce i risultati inferiori e superiori in quelle fasi (Figura 3). L'hESC differenziato e indifferenziato (Figura 3A,B) è facile da distinguere dalla morfologia, e l'hESC indifferenziato è scelto per la formazione di RB. Il giorno 5, dovrebbe essere generata una sfera cava (Figura 3D) piuttosto che quella solida (Figura 3C). Il RB è derivato dagli organoidi retinici, che mostrano l'architettura delle vescicole ottiche (Figura 3F). Non c'è RB che si genererebbe negli organoidi inferiori (Figura 3E).

Figura 1: Vista schematica della differenziazione degli organoidi RB. Giorno 0-giorno 15, le cellule sono coltura 2D in mezzo I, e dopo il giorno 15, le cellule sono coltura di sospensione. RB si forma intorno al giorno 45. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Generazione e caratterizzazione di RB. (A-C) La procedura della fase iniziale, hESC è elevata per formare le cisti. Le frecce nere in (B) mostrano i bordi arrotolati di hESC dopo il trattamento dispase. (D,E) Le cisti si attaccano alle piastre (D) e poi si espandono (E). (F) Le cellule aderenti sono elevate per formare gli organoidi retinici. Le frecce nere indicano i bordi arrotolati dopo il trattamento di dispase. (G,H) Organoidi retinici dei primi giorni senza RB. (I, J) Gli organoidi retinici con RB al giorno 50 (I) e al giorno 90 (J), i cerchi verdi evidenziano le parti RB. (K) La linea cellulare RB isolata da organoidi retinici di 90 giorni. (L) Gli organoidi RB il giorno 105. (M-P) Le immagini di immunofluorescenza per i marcatori oncogenici (M,N) e i marcatori fotorecettoriali (O,P). In A-L, barre di scala = 200 μm; in M-P, barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Confronto dei risultati negativi e positivi. Le immagini inferiori e superiori per la differenziazione nei giorni 0 (A,B), 5 (C,D) e 30 (E,F). Barre di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non sono a conoscenza di affiliazioni, appartenenze, finanziamenti o partecipazioni finanziarie che potrebbero influenzare l'obiettività di questo studio.