Caratterizzazione a una cellula dell'afflusso di calcio e dell'infezione da HIV-1 utilizzando una piattaforma optofluidica multiparametro

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo in cui le singole cellule vengono monitorate per eventi acuti e infezioni produttive da HIV-1 su un dispositivo nanofluidico. I dati di imaging definiscono le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Questo è il primo metodo per la coltura e l'imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica per studiare la cinetica segnalante e le interazioni molecolari.

Abstract

L'HIV-1 causa un'infezione cronica che colpisce più di 37 milioni di persone in tutto il mondo. Le persone che vivono con il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) sperimentano comorbilità correlata all'infiammazione cronica nonostante la terapia antiretrovirale. Tuttavia, questi segnali infiammatori non sono stati completamente caratterizzati. Il ruolo degli eventi di ingresso precoce sull'attivazione degli eventi di segnalazione cellulare e sull'espressione genica a valle non è stato catturato a livello di singola cellula. Qui gli autori descrivono un metodo che applica i principi della microscopia a fluorescenza a cellule vive a una piattaforma automatizzata a cella singola che colture e immagini le cellule rispetto ai corsi di tempo personalizzati dall'utente, consentendo l'analisi ad alta produttività dei processi cellulari dinamici. Questo saggio può tracciare la microscopia a fluorescenza viva a singola cellula dei primi eventi che seguono immediatamente l'infezione da HIV-1, in particolare l'afflusso di calcio che accompagna l'esposizione al virus e lo sviluppo di infezioni produttive utilizzando un virus reporter fluorescente. Le cellule MT-4 sono caricate con un colorante sensibile al calcio e coltivate in penne isolate su un dispositivo nanofluidico. Le cellule coltivate sono infettate da un virus reporter HIV-1 (HIV-1 NLCI). Un microscopio a fluorescenza posizionato sopra il dispositivo nanofluidico misura l'afflusso di calcio su un decorso di 8 minuti dopo l'esposizione acuta all'HIV-1. L'infezione produttiva dell'HIV-1 viene misurata in quelle stesse cellule per un intervallo di 4 giorni. I dati di imaging di questi corsi di tempo vengono analizzati per definire le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Gli autori presentano un'alternativa integrata e scalabile ai metodi di imaging tradizionali utilizzando una nuova piattaforma optofluidica in grado di smistamento, 1500, imaging e automazione del software a cella singola. Questo saggio può misurare la cinetica degli eventi in varie condizioni, tra cui il tipo di cellula, l'agonista o l'effetto antagonista, misurando al contempo una serie di parametri. Questo è il primo metodo stabilito per la coltura e l'imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica: questa tecnica può essere ampiamente adattata per studiare la cinetica di segnalazione cellulare e le interazioni molecolari dinamiche.

Introduzione

L'infiammazione cronica è una delle principali cause di morbilità precoce associata all'HIV e^{mortalità 1,2,3}. Esistono diversi meccanismi in base ai quali l'HIV può attivare la segnalazione infiammatoria, e recenti prove suggeriscono un ruolo per i recettori P2X nell'ingresso dell'HIV che sono recettori del trifosfato di adenosina (ATP) che gating^{calcio 3,4,5,6,7,8,}

Protocollo

1. Preparazione di cellule per l'imaging

1. Preparare la soluzione di carico Fluo-4 AM fresca: Aggiungere 25 μL di solvente detergente concentrato 100x, quindi aggiungere 2,5 μL di Fluo-4 AM 1000x a un tubo da 1,5 ml. Vortice da mescolare.
2. Pipetta 2,5 mL di mezzi di coltura nella soluzione di carico e invertire la miscela. Proteggere dalla luce.
3. Centrifuga 2 x 10⁶ cellule MT-4 a 500 x g per 3 min.
4. Rimuovere i mezzi e rimosogliere il pellet in 2 mL della soluzione di carico Fluo-4 AM preparata. Proteggere dalla luce.
5. Pipetta risospense le cellule in una piastra di Petri da 35 mm. Incubare a 37 °C per 15....

Risultati

La figura 1 illustra il formato dei dati di imaging grezzo e del chip acquisiti attraverso il microscopio a fluorescenza. L'identificazione e il raggruppamento di cellule non infette e infette mediante misurazione mCherry sono mostrati nella figura 2. Questi ammassi vengono analizzati per la cinetica dell'afflusso di calcio nella figura 3, che dimostra l'afflusso precoce di calcio nelle cellule infettate dall'HIV.

Discussione

La metodologia descritta per studiare la relazione tra l'afflusso di calcio e l'infezione produttiva dell'HIV-1 in singole cellule può essere adattata per studiare la cinetica del calcio intracellulare in risposta ad altri agonisti o antagonisti di interesse. La preparazione delle celle per l'imaging è semplice, minimamente richiede molto tempo e i reagenti sono disponibili in comodi kit di produttori ampiamente utilizzati. La misurazione del calcio a base di Fluo-4 è ben descritta in letteratura e l'HIV-1 può essere fac.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Faro Sistema Optofluidico	Berkeley Lights
Siero fetale bovino	Gibco
FIJI	Software open source	PMID: 22743772, 22930834
Kit di imaging del calcio Fluo-4	Thermo Fisher	F10489
HIV-1 NLCINL4-3	Laboratorio di Benjamin Chen	PMID: 28148796
Soluzione di iclone pennecillina streptomicina	GE Healthcare Scienze della vita	SV30010
Reagente NIH AIDS di cellule MT-4			ARP-120
Luci Berkeley con chip OptoSelect 3500
Punte per pipettatore	Denville Scientific	P3020-CPS
Prisma 9.0.0	GraphPad
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758
Pipette sierologiche	Fisher Brand	13-678-11E
Cappa per coltura tissutale	Vari modelli
Palloni T75	Corning	3073

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