L'analisi del ciclo cellulare con etichettatura 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) e fosfo-istone H3 (pH3) è una procedura in più fasi che può richiedere un'ampia ottimizzazione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive tutti i passaggi per questa procedura, compresa l'analisi e la quantificazione delle immagini per distinguere le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare.
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Articolo metodologico
Protocollo a doppia marcatura 5-etinil-2'-deossiuridina/fosfo-istone H3 per l'analisi della progressione del ciclo cellulare nelle cellule staminali neurali della drosofila
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'analisi della progressione del ciclo cellulare in vivo viene eseguita di routine in studi sui geni che regolano la mitosi e la replicazione del DNA. La 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) è stata utilizzata per studiare la progressione replicativa / fase S, mentre gli anticorpi contro il fosfo-istone H3 sono stati utilizzati per marcare nuclei e cellule mitotiche. Una combinazione di entrambe le etichette consentirebbe la classificazione delle fasi G0/G1 (fase Gap), S (replicativa) e M (mitotica) e servirebbe come strumento importante per valutare gli effetti dei knockdown dei geni mitotici o dei mutanti nulli sulla progressione del ciclo cellulare. Tuttavia, i reagenti utilizzati per contrassegnare le cellule marcate con EdU sono incompatibili con diversi tag fluorescenti anticorpali secondari. Ciò complica l'immunocolorazione, in cui gli anticorpi primari e secondari marcati vengono utilizzati per contrassegnare le cellule mitotiche pH3-positive. Questo documento descrive un protocollo passo-passo per la doppia etichettatura di EdU e pH3 nelle cellule staminali neurali larvali di Drosophila, un sistema ampiamente utilizzato per studiare i fattori mitotici. Inoltre, viene fornito un protocollo per l'analisi e la quantificazione delle immagini per allocare le cellule etichettate in 3 categorie distinte, G0 / G1, S, S >G2 / M (progressione da S a G2 / M) e M fasi.
Introduzione
Il ciclo di divisione cellulare comprende una fase G1 (prima fase gap), una fase replicativa/S, una G2 (seconda fase gap) e una fase M (mitotica). Passando attraverso queste fasi, la cellula subisce cambiamenti drammatici nella trascrizione cellulare, nella traduzione e nella riorganizzazione del macchinario citoscheletrico1,2. In risposta a segnali di sviluppo e ambientali, le cellule possono temporaneamente cessare di dividersi e diventare quiescenti (G0) o differenziarsi e cessare permanentemente di dividersi3. Altri scenari, come il danno al DNA, possono causare differenziazione pre....
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Protocollo
1. Preparazione dei reagenti e delle scorte per il test Click-it EdU
NOTA: fare riferimento alla Tabella dei materiali e alla Tabella 1 per i dettagli sul kit e sui reagenti forniti con il kit.
- Portare i flaconcini a temperatura ambiente prima di preparare le soluzioni.
- Preparare 10 mM di soluzione madre EdU (componente A) aggiungendo 2 mL di dimetilsolfossido (DMSO, componente C). Mescolare bene e conservare a -20 °C.
- Preparare una soluzione di lavoro di Alexa Fluor 647-azide (componente B) aggiungendo 70μL di DMSO (componente C). Mescolare bene e conservare a -20 °C.
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Risultati
Il cervello larvale bilobato di Drosophila terzo instar è stato utilizzato come sistema modello per studiare i processi cellulari e di sviluppo fondamentali9. L'obiettivo del presente studio è stato quello di presentare un protocollo per l'analisi della progressione del ciclo cellulare nei NB marcati con EdU e pH3 della regione CB (Figura 1). I CB NB sono suddivisi in tipo I e tipo II e presentano il caratteristico modello di divisione asimmetrica
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Discussione
L'incorporazione di EdU e la sua successiva reazione "click" con azide permeabile alle cellule presenta vantaggi pratici di questa tecnica rispetto al metodo BrdU utilizzato in precedenza7. Tuttavia, questa reazione è catalizzata dagli ioni Cu(I) e diversi coloranti possono essere instabili in presenza di questo catalizzatore di rame, come è chiaramente consigliato dal produttore del kit Click-it EdU. Quando sono stati eseguiti esperimenti di immunocolorazione dopo aver eseguito la fase di rilevam.......
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Dichiarazioni
Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (sovvenzione del progetto 31003A_173188; www.snf.ch) e dell'Università di Berna (www.unibe.ch) a BS. I finanziatori non avevano alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | Inserimento di elementi P nel terzo esone di Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Proteina | marcata con eGFP espressa in background Mms19p | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Anticorpi | Diluizione Ratto | ||
| anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Anticorpi secondari | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Supporto supporto supporto | supporto Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Kit di incorporazione Click-it EdU, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider' s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) frazione V Merck | 10735078001 | ||
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | detergente non ionico |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad | software Versione 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 microscopio confocale a scansione laser con obiettivo plan-apochromat 63x a immersione in olio, 1,4 NA | |||
| Materiali | |||
| Aqua Poly/Mezzo di montaggio Mezzo | montaggio solubile in acqua, non fluorescente | ||
| Piastra | |||
| Carta |
Riferimenti
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeut....
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Ristampe e permessi
