Method Article

Implementazione AAV di costrutti di espressione basati su enhancer in vivo nel cervello di topo

DOI:

10.3791/62650

⸱

March 31st, 2022

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un nuovo test di enhancer-reporter transitorio basato su rAAV. Questo test può essere utilizzato per indurre l'espressione guidata dal potenziatore in vivo nel cervello del topo.

Abstract

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Gli enhancer sono piattaforme di legame per una vasta gamma di fattori di trascrizione che guidano specifici modelli di espressione di geni specifici del tipo di tessuto e della cellula. Molteplici mezzi per valutare il DNA non codificante e vari stati della cromatina si sono dimostrati utili nel predire la presenza di sequenze enhancer nel genoma, ma convalidare l'attività di queste sequenze e trovare gli organi e gli stadi di sviluppo in cui sono attivi è un processo ad alta intensità di lavoro. I recenti progressi nei vettori del virus adeno-associato (AAV) hanno permesso la consegna diffusa di transgeni ai tessuti del topo, consentendo test di potenziatori in vivo senza la necessità di un animale transgenico. Questo protocollo mostra come un costrutto reporter che esprime EGFP sotto il controllo di un promotore minimo, che non guida l'espressione significativa da solo, può essere utilizzato per studiare i modelli di attività delle sequenze di potenziatori candidati nel cervello del topo. Un costrutto reporter confezionato AAV viene consegnato al cervello del topo e incubato per 1-4 settimane, dopo di che l'animale viene sacrificato e le sezioni cerebrali vengono osservate al microscopio. EGFP appare nelle cellule in cui il potenziatore testato è sufficiente per avviare l'espressione genica, individuando la posizione e lo stadio di sviluppo in cui il potenziatore è attivo nel cervello. I metodi di clonazione standard, l'imballaggio AAV a basso costo e l'espansione dei sierotipi e dei metodi AAV per la consegna in vivo e la lettura standard dell'imaging rendono questo un approccio accessibile per lo studio di come l'espressione genica è regolata nel cervello.

Introduction

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Gli enhancer sono elementi cis-regolatori genomici che fungono da siti di legame del fattore di trascrizione e possono guidare l'espressione di un gene bersaglio in modo spazio-temporale specifico 1,2. Sono differenzialmente attivi in diversi tipi cellulari, tessuti e stadi di sviluppo e possono essere substrati della variazione genomica correlata al rischio di malattia 3,4. Pertanto, la necessità di comprendere le dinamiche della funzione enhancer è fondamentale per il progresso nelle applicazioni sia traslazionali che scientifiche di base all'interno della genomica. In silico le previsioni dell'attività dell'enhancer possono servire come risorse eccellenti per generare ipotesi come capacità di enhancer 5,6. Tale attività di enhancer prevista può richiedere ulteriori validazioni e interrogazioni per una piena comprensione dell'attività funzionale. I saggi Enhancer reporter si sono dimostrati preziosi per questo scopo in una varietà di sistemi, dalle cellule agli animali 7,8,9. Per estendere questi studi in un contesto transitorio in vivo flessibile ed economico, questo protocollo descrive l'uso di metodi basati su AAV in vivo per testare sequenze di potenziatori putativi per la loro capacità di guidare l'espressione di un gene reporter ectopico nel cervello postnatale del topo. Questa famiglia di metodi ha utilità per interrogare singole sequenze candidate o screening di librerie parallele ed è rilevante per la ricerca di base e traslazionale.

Questo metodo combina in un singolo plasmide una presunta sequenza di DNA candidato enhancer con un gene reporter (qui EGFP), sotto il controllo di un promotore minimo che da solo non guida l'espressione significativa. Il plasmide viene confezionato in AAV ricombinante (rAAV) e iniettato in un modello animale. Mentre l'applicazione qui è al cervello, vari sierotipi rAAV consentono l'infezione attraverso diversi tipi di tessuto in modo che questo approccio possa essere esteso ad altri sistemi10. Dopo un periodo di tempo, il cervello può essere raccolto e analizzato per l'espressione del gene reporter. L'espressione forte, rispetto ai controlli, indica che la sequenza candidata testata è stata in grado di "migliorare" l'espressione del gene (Figura 1). Questo semplice design offre un approccio semplice e chiaro per testare una sequenza per l'attività del potenziatore in vivo nel cervello.

Oltre a testare la capacità di enhancer di una sequenza, questo metodo può essere combinato con tecniche per determinare l'attività del potenziatore di tipo cellulare. Negli approcci basati sulla sequenza per determinare l'attività del potenziatore differenziale, l'ordinamento delle cellule su marcatori specifici del tipo di cellula prima del sequenziamento del DNA e dell'RNA può consentire ai ricercatori di determinare se diversi tipi di cellule mostrano attività di potenziatore differenziale, come è stato descritto in Gisselbrecht et al.11. Negli approcci basati sull'imaging, la co-etichettatura delle immagini con marcatori specifici del tipo di cellula consente di esaminare se le cellule che mostrano fluorescenza guidata dal potenziatore mostrano anche marcatori di tipo cellulare di interesse 12,13,14,15,16. I saggi dei reporter enhancer consentono di testare direttamente la variazione allelica associata al rischio nei potenziatori per gli effetti sulla capacità del potenziatore. La stragrande maggioranza dei loci di rischio identificati negli studi di associazione genome-wide (GWAS) si trova in regioni non codificanti del genoma17. Studi di annotazione funzionale di questi loci di rischio indicano che una grande porzione probabilmente agisce come potenziatori18,19,20. Il dispiegamento di MPRA in vivo può consentire di testare queste varianti associate al rischio per l'attività del potenziatore nel cervello12,21. Infine, la consegna e la raccolta in diversi momenti possono offrire approfondimenti sulle fasi di sviluppo durante le quali un potenziatore è attivo.

I design dei plasmidi enhancer-reporter sono diversi e possono essere personalizzati per soddisfare obiettivi sperimentali. Ci sono diverse opzioni per i promotori minimi che sono stati utilizzati nella ricerca sugli enhancer, come il promotore minimo umano β-globina22 e il promotore minimo Hsp68 del topo23. Questi promotori sono noti per guidare bassi livelli di espressione a meno che non siano accoppiati con un elemento enhancer per attivarli. Al contrario, gli elementi promotori costitutivi guidano una forte espressione del transgene, utile per il controllo positivo o per testare la funzione enhancer su uno sfondo di espressione robusta. Le scelte comuni per i promotori costitutivi includono CAG, un promotore ibrido derivato dal promotore di pollo β-actina e dal citomegalovirus immediate-early enhancer24, o EF1α25 umano. Poiché è noto che i potenziatori funzionano in modo bidirezionale26, l'orientamento e la posizione del potenziatore rispetto al promotore minimo sono flessibili (Figura 2A). I tradizionali saggi enhancer-reporter posizionano il enhancer a monte del promotore e, nelle consegne in libreria, includono una sequenza di codici a barre a valle del gene reporter per associare le letture di sequenziamento con il enhancer27 testato. Tuttavia, gli enhancer possono anche essere posizionati nel frame di lettura aperto del gene reporter e fungere da sequenza di codici a barre, come viene fatto in STARR-seq28. Il protocollo qui descritto utilizza il disegno del saggio STARR-seq, posizionando la sequenza del potenziatore candidato nel 3' UTR del gene reporter. Mentre l'orientamento STARR-seq offre il vantaggio di una clonazione più snella, è meno compreso rispetto all'approccio convenzionale e può indurre stabilità variabile dell'RNA tra i costrutti. I metodi descritti possono essere facilmente adattati sia allo STARR-seq che all'orientamento convenzionale con piccole modifiche al processo di clonazione che sono state descritte altrove27,29.

Diversi metodi di erogazione di AAV possono essere impiegati per personalizzare ulteriormente questa tecnica per adattarla agli obiettivi sperimentali (Figura 2B). Le iniezioni intracraniche dirette, descritte ulteriormente in questo protocollo, forniscono un'alta concentrazione di virus direttamente al cervello30. Ciò fornisce un'elevata efficienza di trasduzione centrata nel sito di iniezione, rendendola una tecnica eccellente per esperimenti che cercano di massimizzare la densità delle cellule trasdotte su un'area di tessuto. L'iniezione stereotassica può aiutare a standardizzare il sito di iniezione tra gli animali per una trasduzione localizzata riproducibile. Le iniezioni intracraniche sono più semplici negli animali postnatali precoci. Come tecnica alternativa, le iniezioni sistemiche possono fornire transgeni utilizzando AAV con sierotipi in grado di attraversare la barriera emato-encefalica31. Le iniezioni di vene della coda consentono al virus di circolare in tutto il corpo, consentendo la consegna generalizzata attraverso molti tessuti10. Le iniezioni retro-orbitali sono un'altra tecnica di iniezione sistemica che trasporta il virus dietro l'occhio nel seno retroorbitale32. Ciò offre un percorso più diretto per l'AAV dal sistema venoso al cervello, con conseguente maggiore concentrazione di cellule trasdotte nel cervello rispetto alle iniezioni in più vasi sanguigni periferici33.

Un altro aspetto flessibile di questa tecnica è il metodo di lettura. In generale, le opzioni possono essere descritte come basate su reporter o sequenziali (Figura 2C). L'incorporazione di un reporter fluorescente come GFP nel frame di lettura aperto del costrutto si traduce nell'espressione della proteina fluorescente in qualsiasi cellula trasdotta in cui il candidato enhancer ha guidato l'espressione. Le tecniche di etichettatura e imaging come l'immunoistochimica consentono l'amplificazione del segnale. Le tecniche di lettura basate sul sequenziamento comportano l'identificazione di sequenze dal costrutto consegnato nell'RNA raccolto dal tessuto. Quantificando la quantità di DNA virale che è stata inizialmente consegnata, il confronto tra RNA espresso e DNA consegnato può essere utilizzato per determinare il grado in cui una sequenza enhancer testata era in grado di guidare una maggiore espressione del transgene, ad esempio, nel contesto di un saggio reporter massively parallel (MPRA). Gli MPRA offrono una potente espansione di queste tecniche per testare fino a migliaia di candidati potenziatori per l'attività contemporaneamente e sono stati ampiamente descritti nella ricerca genomica 12,27,34,35,36. Lo screening a throughput più elevato si ottiene eseguendo fasi di clonazione, confezionamento, consegna e sequenziamento per i potenziatori candidati in batch anziché singolarmente.

La selezione del potenziatore dei candidati offre un'altra opportunità di flessibilità (Figura 2D). Ad esempio, questo test può essere utilizzato per identificare i potenziatori di un gene specifico, per accertare la funzione delle regioni di interesse del DNA non codificanti o per determinare specifici tipi di cellule o fasi di sviluppo durante le quali un potenziatore è attivo - tutti elementi che servono obiettivi sia nella scienza di base che nella ricerca sulle malattie. Generalmente, la selezione del potenziatore candidato è guidata dalle previsioni in silico dell'attività del potenziatore. Comunemente, le previsioni in silico includono ChIP-seq per le modifiche degli istoni che indicano probabili potenziatori, come H3K27ac37 e la mappatura dell'accessibilità della cromatina38. Infine, un'area di ricerca crescente è lo screening basato sulla funzione di elementi enhancer progettati sinteticamente, consentendo studi su come la sequenza enhancer dirige la funzione39 e la progettazione di enhancer con proprietà specifiche40.

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Protocol

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Questo protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della UC Davis (Protocollo #22339) e dal Comitato istituzionale per la biosicurezza della UC Davis (BUA-R1903). Questo protocollo è stato testato su topi C57BL/6J di entrambi i sessi al giorno postnatale 0-1.

1. Clonare la sequenza del candidato enhancer nel plasmide vettore AAV.

NOTA: vengono forniti i protocolli rappresentativi, ma la strategia di clonazione ha un alto grado di flessibilità.

  1. Selezionare o progettare un costrutto reporter. Qui, il candidato enhancer viene inserito nella regione 3' non tradotta (UTR) del gene reporter EGFP, che è espressa sotto il controllo del promotore minimo Hsp68.
    NOTA: Molti costrutti plasmidici MPRA appropriati per questo test sono stati depositati su Addgene41 e sono disponibili per uso di ricerca.
  2. Progettare primer PCR per amplificare una sequenza di interesse. Aggiungere all'estremità 5' dei primer il braccio di omologia appropriato per la clonazione di Gibson (~35 bp corrispondente alla sequenza 5' a monte della posizione di inserimento, filamento superiore per il primer anteriore e filamento inferiore per il primer inverso).
    NOTA: Assicurarsi che la sequenza di primer di base sia lunga ~18-24 bp e contenuta in GC di ~50%-60% con una temperatura di fusione di circa 57-59 °C.
  3. Eseguire la PCR da un campione di DNA utilizzando i primer progettati.
    1. Assemblare la miscela di reazioni PCR in provette da 0,2 mL PCR come descritto nella Tabella 1.
    2. Posizionare la miscela o le miscele di reazione PCR su un termociclatore e fare un ciclo secondo il programma menzionato nella Tabella 1.
    3. Confermare il successo della PCR eseguendo 5 μL di prodotto PCR su un gel di agarosio allo 0,7%-1% a 100 V per 30-60 minuti. Verificare la presenza del frammento di lunghezza prevista.
    4. Pulire il prodotto PCR utilizzando un kit commerciale di colonna di pulizia della reazione enzimatica. L'eluato finale è l'inserto di clonazione.
  4. Eseguire la digestione di restrizione per linearizzare il vettore AAV nel sito di clonazione univoco per inserire il potenziatore nel vettore.
    1. Il sito di clonazione nel 3' UTR del costrutto enhancer reporter utilizzato qui è delimitato da siti di restrizione PacI e AscI unici. Eseguire un digest per linearizzare il plasmide in questa posizione secondo i seguenti parametri (passi 1.4.2-1.4.4).
    2. Digerire 1-10 μg di DNA vettoriale utilizzando PacI e AscI, a seconda di quante reazioni di clonazione saranno necessarie. Preparare le reazioni utilizzando il tampone in dotazione secondo le istruzioni del produttore.
    3. Incubare a 37 °C per 1-2 ore per digerire il DNA vettore. (Se si digeriscono più di 5 μg in una reazione di 50 μL, può essere necessaria un'incubazione più lunga.)
    4. Dopo 1-2 ore di incubazione, inattivare l'enzima incubando a 65 °C per 20 min.
    5. Separare i frammenti di digestione di restrizione mediante elettroforesi su gel utilizzando un gel di agarosio allo 0,7%-1%, eseguito a 100 V per 30-60 minuti.
    6. Eliminare la fascia per il vettore linearizzato e purificare utilizzando un kit commerciale di estrazione del gel.
  5. Eseguire reazioni di clonazione Gibson e trasformare
    1. Determinare la concentrazione del vettore purificato e dell'inserto di clonazione utilizzando uno spettrofotometro.
      NOTA: Il DNA assorbe la luce a 260 nm, mentre i contaminanti assorbono la luce a 230 nm e 280 nm. Rapporti elevati (>1,8) di 260/230 e 260/280 indicano DNA altamente purificato.
    2. Assemblare reazioni di clonazione Gibson in provette PCR da 0,2 ml: 5 μL di 2x master mix Gibson, frammenti di DNA 0,02-0,5 pmol in un rapporto di 3:1 inserire al vettore (la concentrazione ottimale di DNA per la reazione deve essere determinata empiricamente) e acqua priva di nucleasi (portare il volume a 10 μL).
    3. Incubare le reazioni di Gibson a 50 °C per 20 minuti in un termociclatore.
  6. Trasformare Escherichia coli (E. coli) carente di ricombinazione (recA-) competente.
    1. Impostare un bagnomaria a 42 °C e scongelare le celle competenti disponibili in commercio sul ghiaccio.
      NOTA: Questo passaggio può essere eseguito prima del passaggio 1.4 e le cellule possono scongelarsi durante la preparazione e l'incubazione della reazione di Gibson.
    2. Aliquote 30-50 μL di cellule in provette da microcentrifuga da 2,0 ml. Aggiungere 2 μL di reazione di Gibson ad un'aliquota ed etichettare il tubo con l'identità del Gibson. Incubare le cellule sul ghiaccio per 30 minuti.
      NOTA: Utilizzare 5-10 ng di vettore vuoto non digerito come controllo positivo e acqua come controllo negativo.
    3. Shock termico delle celle nel bagno d'acqua a 42 °C per 30-45 secondi, riportare immediatamente i tubi nel ghiaccio e lasciarli recuperare per 5 minuti.
    4. Mentre si è in ghiaccio, aggiungere 400-950 μL dei mezzi di recupero disponibili in commercio.
      NOTA: I terreni di recupero utilizzati in questi esperimenti contengono il 2% di peptone vegetale, lo 0,5% di estratto di lievito, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 e 20 mM di glucosio.
    5. Dopo il recupero su ghiaccio, recuperare completamente le cellule incubando a 37 °C con delicata agitazione di 250 RPM per 30-60 minuti.
    6. Pellettare le cellule mediante centrifugazione a 5.000 x g per 5 minuti e rimuovere 400 μL di surnatante, lasciando ~ 50 μL di batteri alla piastra.
    7. Piastre su terreni selettivi e incubare a 37 °C durante la notte.
      NOTA: I mezzi selettivi utilizzati in questi esperimenti contengono 1,0% di triptone, 0,5% di estratto di lievito, 1,0% di cloruro di sodio, 1-2% di agar, 96-97% di acqua e carbenicillina ad una concentrazione di 100 μg/ml. Utilizzare sempre ceppi di batteri carenti di ricombinazione per clonare plasmidi virali perché le ripetizioni terminali invertite virali (ITR) hanno sequenze corrispondenti e possono subire una ricombinazione omologa. Tuttavia, i ceppi di batteri recA- subiscono ancora bassi livelli di ricombinazione. Il plasmide reporter utilizzato qui è un AAV auto-complementare, in cui la sequenza di uno degli ITR è stata alterata e non corrisponde più perfettamente all'altro ITR. Si raccomanda inoltre di far crescere i batteri a 30 °C per rallentare ulteriormente la velocità di ricombinazione omologa.
  7. Verificare i cloni e recuperare i plasmidi.
    1. Preparare una miscela master PCR utilizzando primer avanti e indietro (Table of Materials) che ricottura al vettore, fiancheggiando la posizione dell'inserto. Aliquote 10 μL volumi in provette da 0,2 mL PCR.
    2. In provette a fondo tondo da 14 ml, preparare 5 ml di aliquote di brodo LB antibiotico selettivo, una per ogni colonia sottoposta a test tramite PCR e controllo negativo.
    3. Utilizzare uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta per scegliere una singola colonia e raschiare approssimativamente la colonia sul fondo di un tubo PCR.
    4. Quando la colonia si è dissociata nella miscela principale PCR, far cadere lo stuzzicadenti o la punta in una delle aliquote LB ed etichettare il tubo da 14 mL con la reazione di Gibson e il numero del tubo PCR.
    5. Posizionare le reazioni di PCR della colonia su un termociclatore e seguire il programma descritto nella Tabella 2.
    6. Incubare le colture liquide da 5 mL inoculate con stuzzicadenti o punte di pipette in un incubatore agitatore impostato a 37 °C e 180 giri/min.
    7. Eseguire le reazioni di PCR della colonia su un gel di agarosio allo 0,7%-1% a 100 V per 30-60 minuti e visualizzare le bande in un sistema di imaging gel doc.
    8. Scartare le colture da 5 mL che non visualizzano la banda PCR prevista.
    9. Per ogni clone integrato con successo, lasciare crescere le colture da 5 ml durante la notte e quindi eseguire una mini preparazione plasmidica da 4,5 ml utilizzando un kit commerciale. Riservare 0,5 ml di coltura liquida e risparmiare a -80 °C come scorta di glicerolo.
    10. Confermare che i transgeni contenuti nei plasmidi sono privi di mutazioni indesiderate utilizzando il sequenziamento Sanger42.
    11. Dopo che il costrutto reporter è stato confermato essere stato clonato con successo, utilizzare lo stock di glicerolo salvato per inoculare una coltura starter da 5 ml e crescere per 8-16 ore in un'incubatrice vibrante a 30 °C e 180 giri/min.
    12. Una volta che il brodo è torbido, diluire la coltura starter 1.000x in 250-300 ml di brodo LB fresco selettivo e incubare almeno per una notte in un incubatore agitatore a 30 °C e 180 giri/min. Quindi purificare il plasmide utilizzando un maxi kit plasmidico commerciale.
      NOTA: I batteri cresceranno più lentamente a 30 °C rispetto ai 37 °C, ma questa è la temperatura migliore per rallentare il tasso di ricombinazione spontanea quando si coltivano grandi colture.
    13. Eseguire un digest XmaI per verificare la ricombinazione degli ITR utilizzando i passaggi 1.4.2-1.4.5, sostituendo XmaI anziché PacI e AscI. Visualizza le bande su un sistema di imaging gel doc.
      NOTA: Un plasmide rAAV con entrambi gli ITR presenti produrrà due bande su un gel dopo questo digest: una della lunghezza del genoma rAAV e l'altra la lunghezza del resto della spina dorsale plasmidica. Se c'è solo una banda, allora gli ITR hanno subito una ricombinazione omologa e il plasmide rAAV non sarà in grado di confezionare particelle virali. La spina dorsale del plasmide rAAV qui descritta è stata progettata in modo che i siti XmaI si verifichino solo negli ITR. Se l'inserto candidato enhancer contiene anche siti XmaI, aggiornare i risultati della banda previsti e analizzare di conseguenza.

2. Ottenere rAAV confezionato.

  1. Utilizzare rAAV confezionato (professionalmente o internamente) per gli esperimenti in questo studio.
    NOTA: ci sono molte opzioni per l'imballaggio di un rAAV. Un rAAV può essere confezionato professionalmente presso un'azienda o una struttura di base universitaria. L'rAAV può anche essere confezionato internamente utilizzando diverse tecniche che variano in complessità e necessità di attrezzature specializzate43,44. La preoccupazione principale è ottenere un vettore di alta qualità e che il titolo infettivo sia stato determinato con un alto grado di certezza. Sia rAAV confezionati professionalmente che confezionati internamente sono stati utilizzati per diversi esperimenti descritti in questo studio.

3. Iniettare per via intracranica plasmide confezionato con rAAV in topi neonatali.

  1. Preparare la miscela rAAV per la consegna.
    1. Se l'intento è quello di confrontare i modelli di espressione tra diversi virus enhancer reporter, equalizzare i titoli di tutti i virus da confrontare diluendo tutti in modo che corrispondano al virus meno concentrato.
    2. Mescolare insieme un rapporto 2: 1 o 3: 1 di virus reporter enhancer e virus reporter di controllo costitutivamente espresso e aggiungere una piccola quantità (concentrazione finale 0,06%) di colorante Fast Green.
      NOTA: Fast Green è un colorante ampiamente utilizzato nelle iniezioni di animali da esperimento, anche con AAV, per visualizzare il sito di iniezione durante e immediatamente dopo la procedura45,46,47,48. Sebbene questo sia un importante passo di garanzia della qualità, è possibile che l'aggiunta di colorante possa interferire con la trasduzione. Riconsiderare l'uso del colorante per iniezione può essere importante per l'ottimizzazione del protocollo in alcuni casi. Il virus di controllo guidato costitutivamente è assolutamente fondamentale per confrontare le iniezioni indipendenti. Le iniezioni di virus variano in posizione ed entità della trasduzione da animale ad animale. Il controllo costitutivo consentirà di escludere le iniezioni fallite dall'analisi e fornirà uno standard per la normalizzazione della variazione nella consegna del virus.
    3. Rompere la punta di una pipetta sterile di vetro tirato ricavata da un tubo capillare graduato μL perforandola delicatamente attraverso una delicata salvietta sterilizzata immergendola in etanolo al 70% e lasciata asciugare completamente. Quindi inserire la pipetta di vetro tirata nel gruppo aspiratore costituito da un dispositivo per l'applicazione della pressione collegato a tubi di gomma lunghi 15 pollici che termina con una guarnizione in gomma per contenere una pipetta micro-capillare.
      NOTA: Il "dispositivo per l'applicazione della pressione" può essere una siringa o un boccaglio. Se deve essere utilizzata una siringa, una seconda persona dovrà esercitare pressione attraverso la siringa mentre lo sperimentatore manipola la pipetta in una mano e l'animale nell'altra. Se si utilizza un boccaglio, che consente allo sperimentatore di controllare con precisione sia le posizioni dell'animale e della pipetta che la pressione applicata alla siringa, è necessaria una maggiore attenzione per evitare la contaminazione da virus.
    4. Applicare una pressione negativa attraverso il gruppo aspiratore per aspirare un piccolo volume (~0,2-0,5 μL) di olio minerale nella pipetta di vetro.
      NOTA: questo passaggio è molto importante per fornire una barriera per impedire alle particelle virali aerosolizzate di contaminare il gruppo aspiratore.
    5. Mettere da parte il gruppo aspiratore preparato e tenere il virus sul ghiaccio fino al momento dell'iniezione.
  2. Crio-anestetizzare i topi neonatali in un piatto di plastica asciutto parzialmente immerso nel ghiaccio fino alla cessazione del riflesso di ritiro del pedale (~5 min). Assicurarsi che i topi non siano in contatto diretto con il ghiaccio.
  3. Utilizzare la pressione negativa attraverso il gruppo aspiratore per aspirare la miscela virale nella pipetta di vetro tirata fino a quando il menisco supera il segno di zecca di 2 μL.
  4. Rimuovere il mouse dalla camera fredda e posizionarlo sul piano di lavoro. Individuare i siti di iniezione bilaterale a metà strada tra lambda e bregma e a metà strada tra la sutura sagittale e ciascun occhio. Disinfettare entrambe le aree con una salvietta imbevuta di alcool.
  5. Utilizzare la pipetta di vetro tirata per perforare il cranio dei topi neonatali e applicare delicatamente una pressione positiva attraverso il gruppo aspiratore mentre l'ago entra nel cervello. Guarda il menisco della miscela di virus. La resistenza alla pressione applicata diminuirà quando la punta della pipetta raggiunge il ventricolo laterale. Erogare 1 μL del virus, ritirare la pipetta e ripetere per l'altro ventricolo laterale.
  6. Posizionare il mouse su una piastra elettrica o una camera di riscaldamento per recuperare. Una volta sveglio e attivo, riporta l'animale nella sua gabbia di casa.

4. Raccogliere il tessuto ed eseguire l'immunoistochimica.

  1. Dopo un tempo sufficiente dopo la trasduzione del virus, anestetizzare i topi e sacrificarli mediante perfusione transcardica.
    NOTA: Molti esperimenti, inclusi i risultati rappresentativi mostrati qui, consentono un periodo di 4 settimane o più per la trasduzione del virus. Tuttavia, gli AAV auto-complementari possono mostrare una forte espressione già a partire da 7 giorni12. Potrebbe essere necessario ottimizzare il periodo di incubazione desiderato in base a specifiche tecniche e obiettivi sperimentali.
    1. Preparare una pompa peristaltica con tubo per infusione endovenosa e un ago da 25 G.
    2. Preparare 1x PBS e 4% paraformaldeide (PFA) e metterli su ghiaccio.
    3. Posizionare l'estremità di aspirazione del tubo nel 1x PBS ghiacciato. Impostare la portata (2,5 ml/min per i topi P7, 3,5 ml/min per i topi P28) e far funzionare la pompa fino a quando il tampone non viene aspirato fino in fondo al tubo e viene eliminato dalle bolle. Mettere da parte l'ago fino al momento della perfusione.
    4. All'interno di una cappa aspirante, pipettare un piccolo volume di isoflurano su un tovagliolo di carta sul fondo di una camera di goccia. Posizionare il mouse precedentemente iniettato su una griglia sopra il tovagliolo di carta, assicurandosi che non entri in contatto diretto con l'isoflurano. Sigillare la camera per anestetizzare il topo. Attendere ~ 5 minuti, quindi aprire la camera e verificare la presenza di un riflesso di ritiro del pedale. Procedere una volta che l'animale è incosciente.
      NOTA: Durante la perfusione, il topo deve essere mantenuto sull'isoflurano con un cono nasale per evitare di riprendere conoscenza.
    5. Utilizzare forbici chirurgiche per aprire l'addome e il torace del topo, rimuovere la gabbia toracica ed esporre il cuore.
    6. Utilizzare un paio di micro forbici dell'iride per praticare una piccola incisione nell'atrio destro del topo, inserire l'ago IV nel ventricolo sinistro e attivare la pompa peristaltica.
    7. Perfondere l'animale con 1x PBS ghiacciato fino a quando il sangue che fuoriesce dall'incisione nell'atrio destro diventa chiaro. La pulizia del tessuto dal sangue è molto importante perché i globuli rossi hanno autofluorescenza e i vasi sanguigni possono compromettere la capacità di visualizzare le cellule che esprimono il reporter.
    8. Mettere in pausa la pompa peristaltica e spostare il tubo di aspirazione dal PBS al 4% di PFA. Riattivare la pompa e perfondere 1 mL/g di peso corporeo, ~25 mL per un topo adulto.
      NOTA: i tremori di fissazione dovrebbero essere osservabili e il corpo del mouse dovrebbe irrigidirsi.
  2. Sezionare e post-fissare il cervello.
    1. Rimuovere la testa del topo con le forbici chirurgiche.
    2. Usando piccole forbici chirurgiche, iniziare dalla base del cranio e fare un'incisione lungo la linea mediana della testa e tirare indietro la pelle e il tessuto sottostante per esporre il cranio.
    3. Usando le forbici dell'iride, tagliare con cura la parte posteriore del cranio, iniziando dal forame magno e continuando verso e lungo la sutura sagittale fino a quando i bulbi olfattivi sono passati.
    4. Inserire le forbici nel cranio sopra i bulbi olfattivi e fare due tagli orizzontali nel cranio. Fai una coppia simile di tagli orizzontali nell'osso occipitale. I tagli orizzontali e mediani creano un paio di alette simili a porte nella parte superiore del cranio.
    5. Staccare i lembi del cranio per esporre completamente il cervello. Usa un paio di pinzette per recidere i bulbi olfattivi dal cranio e per tagliare i nervi cranici, liberando il cervello dal cranio.
    6. Far cadere il cervello in un tubo conico da 15 ml con 3-5 ml di PFA al 4% in PBS. Post-fix 6 h a notte. Non fissare eccessivamente il tessuto.
  3. Preparare il cervello per la criosezione.
    1. Trasferire il cervello fisso in un nuovo tubo conico da 15 ml con 12-14 ml di saccarosio al 30% in PBS per la disidratazione. Incubare a 4 °C fino a quando il cervello affonda sul fondo del tubo (2-3 giorni).
    2. Immergere il cervello fisso e disidratato in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) in un criostampo di 15 mm x 15 mm x 5 mm. Aggiungi OCT fino a quando il cervello è completamente coperto.
    3. Posizionare il criomold su un blocco di ghiaccio secco e congelare il campione in un blocco solido di OCT (~ 5 min).
      NOTA: i blocchi OCT possono essere conservati a -80 °C per mesi o anni.
    4. Etichettare il criomold con il nome del campione e l'orientamento del cervello.
  4. Ottenere sezioni coronali usando un microtomo criostato.
    1. Segnare l'orientamento del cervello sul blocco OCT a matita e rimuovere il blocco dal criomold all'interno del criostato.
    2. Posizionare il blocco OCT in modo che il cervello sia orientato con i bulbi olfattivi rivolti verso la lama del criostato e far aderire il blocco al detentore dell'oggetto del criostato con un po 'di OCT fresco.
    3. Una volta congelato sul posto, iniziare a tagliare sezioni da 50 μm attraverso il blocco seguendo i passaggi 4.4.4-4.4.6.
    4. Non utilizzare la piastra antirollio. Le sezioni si arricciano in rotoli stretti mentre vengono tagliate e si raccolgono sopra il blocco o cadono sotto in un vassoio di raccolta.
    5. Guarda la forma del blocco nei primi tagli che vengono fatti. Effettua tagli verticali attraverso il blocco, producendo una faccia uniforme quando inizi a tagliare. Se necessario, regolate l'angolo utilizzando i bracci di regolazione del campione.
    6. Quando i bulbi olfattivi sono visibili, prestare molta attenzione alla forma delle sezioni. Se uno appare più grande dell'altro, i tagli sono ad angolo rispetto al cervello ed è necessario raddrizzare l'orientamento del cervello contro la lama usando i bracci di regolazione del campione.
      NOTA: Se si taglia dritto, la corteccia dovrebbe iniziare ad apparire sopra ogni bulbo olfattivo allo stesso tempo.
    7. Una volta che il bulbo olfattivo è stato sezionato e il tessuto cerebrale rostrale è visibile, ridurre lo spessore di taglio a 30-35 μm e iniziare a raccogliere le sezioni galleggianti. Seguire i passaggi 4.4.8-4.4.13 per sezionare il cervello.
    8. Spazzolare tutte le sezioni precedenti dal blocco e dal portaoggetti in modo che cadano nel vassoio di raccolta. Spazzolarli su un lato del vassoio e tenerli separati. Se la pila è troppo grande, svuota il vassoio.
    9. Erogare 1 mL di PBS in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Etichetta 1 riga per ogni cervello.
    10. Tagliare 6 sezioni coronali. Recuperare le sezioni usando una pinzetta fredda e disporle sullo stadio del criostato. Ripeti questo passaggio 2 o 3 volte, mantenendo separati i gruppi di 6 sezioni.
    11. Bagnare un pennello di taglia 000 con PBS e tamponare il liquido in eccesso su un fazzoletto privo di lanugine o tovagliolo di carta. Utilizzare il pennello per raccogliere delicatamente ogni sezione, una alla volta, e posizionarla negli appositi pozzetti della piastra a 24 pozzetti.
    12. Posizionare una delle 6 sezioni del gruppo di fette in ciascuno dei 6 pozzetti in una fila della piastra a 24 pozzetti. Ciò garantisce che ogni pozzetto contenga sezioni rappresentative che si estendono sull'area sezionata del cervello.
    13. Continuare la sezione in gruppi di 6 fino a quando l'estremità caudale della corteccia cerebrale è stata sezionata.
    14. Per lo stoccaggio, sigillare la piastra a 24 pozzetti con parafilm e conservare a 4 °C.
      NOTA: Le sezioni sono stabili per 1-2 mesi a 4 °C. Una soluzione PBS con 0,1% di azoturo di sodio può essere utilizzata per inibire la crescita batterica e prolungare la durata di conservazione delle sezioni. Tuttavia, se le sezioni devono essere conservate per più di 2 mesi, devono essere poste in soluzione crioprotettiva e congelate a -20 °C per ottenere i migliori risultati.
  5. Eseguire immunoistochimica per l'amplificazione del segnale genico reporter.
    NOTA: Tutte le fasi tranne il recupero dell'antigene devono essere eseguite utilizzando agitazione da lieve a moderata (~100 RPM) su uno shaker orbitale. Per preservare la fluorescenza nativa del reporter di controllo (mRuby3), tutti i passaggi devono essere protetti dalla luce il più possibile.
    1. Preparare i buffer necessari come descritto nella tabella 3.
    2. Prepara una nuova piastra da 24 pozzetti con una fila per ogni cervello macchiato. Nella prima colonna di pozzetti, aggiungere 1 mL di PBS a ciascun pozzetto.
    3. Utilizzando un pennello di dimensioni 000, trasferire delicatamente 1 pozzetto di sezioni dal pozzetto di raccolta originale al PBS fresco nella nuova piastra a 24 pozzetti per un rapido risciacquo per rimuovere il composto OCT residuo.
    4. Aggiungere 1 mL di ARB al pozzetto successivo nella piastra del pozzetto 24 e trasferire le sezioni a questo pozzetto. Incubare in forno a 60 °C per 1 h.
    5. Lasciare raffreddare la piastra a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti.
    6. Aggiungere 1 mL di PB al pozzetto successivo e trasferire le sezioni in questo pozzetto. Incubare a RT per 20 min.
    7. Aggiungere 500 μL di BB al pozzetto successivo e trasferire le sezioni in questo pozzetto. Incubare a RT per 1 ora.
    8. Aggiungere 2 mL di WB al BB e quindi pipettare ~2 mL di soluzione ed eliminare, lasciando una soluzione BB diluita nel pozzetto. Ripetete l'operazione fino a quando le sezioni sono chiaramente visibili.
    9. Diluire l'anticorpo primario (Chicken IgY anti-GFP, 1:1000) in BB. Aggiungere 350-500 μL di soluzione anticorpale primaria al pozzetto successivo e trasferire le sezioni in questo pozzetto. Sigillare la piastra con parafilm e incubare a 4 °C per una notte.
    10. Diluire BB con WB come fatto in precedenza fino a quando le sezioni sono chiaramente visibili.
    11. Aggiungere 1 mL di WB al pozzetto successivo e trasferire le sezioni in questo pozzetto. Incubare a RT per 20 min.
    12. Rimuovere ~800-900 μL di tampone e scartare. Aggiungere 1 mL di WB fresco e incubare 20 min. Sostituire 1 mL di WB altre 4 volte per un totale di 5 lavaggi, 20 minuti ciascuno.
    13. Diluire l'anticorpo secondario (Donkey anti-pollo Alexa Fluor 488 coniugato, 1:500) in BB. Aggiungere 350-500 μL della soluzione anticorpale secondaria in un nuovo pozzetto. Incubare a RT per 45 minuti a 1 ora.
      NOTA: Questo è il settimo pozzo, quindi se si colorano sezioni da più di 2 cervelli, sarà necessaria una nuova piastra a questo punto.
    14. Diluire BB con WB come in precedenza e trasferire le sezioni in un nuovo pozzetto riempito con 1 mL di WB. Lavare le sezioni come fatto in precedenza per 20 minuti 3 volte.
    15. Preparare una soluzione di lavoro di DAPI in PBS (concentrazione finale 0,04-0,8 μg/ml). Proteggere la soluzione dalla luce.
    16. Aggiungere 1 mL di soluzione DAPI al pozzetto successivo e trasferire le sezioni in questo pozzetto. Incubare a RT per ~ 5 min.
    17. Trasferire nuovamente le sezioni su WB e montarle delicatamente su vetrini da microscopio utilizzando un pennello di dimensioni 000. Lasciare asciugare i vetrini all'aria.
    18. Applicare i vetrini con un supporto di montaggio appropriato. Lascia che le diapositive si induriscano a RT al buio durante la notte.

5. Immagine e analizzare sezioni di tessuto cerebrale per l'attività del potenziatore.

  1. Utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento (5x) per registrare immagini a fluorescenza che attraversano la sezione del cervello.
  2. Individuare il sito di iniezione e valutare l'entità della trasduzione del virus in base alla densità e all'intensità dei globuli fluorescenti rossi. Fare attenzione a confrontare gli animali che sono stati trasdotti in modo simile.
  3. Registrare immagini fluorescenti dettagliate con un obiettivo ad ingrandimento più elevato (≥25x), se lo si desidera.
    NOTA: assicurarsi sempre di utilizzare le stesse impostazioni per i parametri di acquisizione quali l'intensità della luce di eccitazione, i filtri e il tempo di esposizione tra i campioni da confrontare.
  4. Elabora le immagini utilizzando il software di analisi delle immagini.
    NOTA: l'elaborazione può essere eseguita in qualsiasi pacchetto software di analisi delle immagini. I passaggi seguenti sono suggerimenti per determinare se una sequenza funge da potenziatore nel contesto del costrutto del reporter (una domanda sì o no) utilizzando la distribuzione FIJI open source di ImageJ. Una fotometria più approfondita può essere appropriata quando si confrontano i gradi di attività tra le varianti del potenziatore. Le immagini provenienti da campioni diversi devono sempre essere elaborate in modo coerente per poter essere confrontate.
    1. Applicare filtri per ridurre il rumore. Nelle Figi selezionare l'opzione Despeckle nel menu Elabora > rumore .
      NOTA: si tratta di un filtro mediano 3 x 3.
    2. Sottrarre la fluorescenza di fondo seguendo i passi 5.4.3-5.4.6.
    3. Separare i canali di un'immagine multicanale. Nelle Figi, selezionare l'opzione Dividi canali nel menu Immagine > Colore .
    4. Usa lo strumento di selezione del rettangolo o del cerchio per disegnare una piccola forma in un'area dell'immagine che non ha celle fluorescenti e misura l'intensità media dei pixel dello sfondo usando Analisi > Misura. Ripetere l'operazione per campionare più aree.
      NOTA: assicurarsi che l'opzione Valore grigio medio sia selezionata nel menu Analizza > Imposta misure .
    5. Calcola la media del valore di grigio da 5 a 8 aree di sfondo e rilascia la virgola decimale. Sottrarre questo valore da ogni pixel dell'immagine utilizzando Elabora > Matematica > Sottrai.
      NOTA: l'arrotondamento al numero intero più vicino potrebbe sovrastimare lo sfondo da sottrarre. È più prudente eliminare semplicemente il punto decimale. Ad esempio, 6,4 verrebbe arrotondato per difetto a 6, ma 6,5 dovrebbe anche essere arrotondato per difetto a 6 per evitare il rischio di sottrarre 0,5 unità di segnale reale da ogni pixel.
    6. Se lo si desidera, unire nuovamente i canali in un'immagine multicanale. Nelle Figi, utilizzare Immagine > Colore > Unisci canali.
    7. Unisci insieme tutte le immagini sovrapposte. Nelle Figi, usa Plugins > Stitching > Grid/Collection stitching.
    8. Regola luminosità e contrasto. Nelle Figi, utilizzare Image > Adjust > Brightness/Contrast.
      NOTA: utilizzare sempre gli stessi valori minimo e massimo per ogni immagine da confrontare.
    9. Contare il numero di celle fluorescenti verdi seguendo i passi 5.4.10-5.4.12. Queste sono le celle in cui la sequenza del potenziatore candidato è stata in grado di guidare l'espressione del reporter.
    10. Inizia nascondendo il canale verde e usa lo strumento di selezione a forma libera per disegnare una forma attorno alla regione del cervello che esprime la fluorescenza rossa. Utilizzando la funzione Misura nelle Figi, misurare l'area, la densità integrata e il valore medio di grigio del canale rosso in questa zona.
    11. Utilizzando lo strumento di selezione multipunto, contare il numero di celle verdi in questa zona.
    12. Normalizzare il numero di celle verdi in base alla densità integrata del canale rosso. La luminosità del canale rosso locale è una misura proxy per l'entità dell'esposizione al virus, consentendo il confronto dell'attività del potenziatore tra diversi animali trasdotti.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizzando questi metodi, una sequenza di 915 bp nel terzo introne associato al rischio psichiatrico del gene CACNA1C19,49,50 è stata testata per l'attività del potenziatore nel cervello del topo postnatale. Questa sequenza è stata scoperta in un MPRA di 345 sequenze di potenziatori candidati centrate sul rischio psichiatrico e neurologico SNPs12 e gli esperimenti di caratterizzazione sono descr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo basato su rAAV per il dispiegamento di transgeni guidati da enhancer nel cervello postnatale del topo. In questo protocollo generalizzato, un potenziatore candidato, un promotore minimo, un gene reporter e una sequenza di codici a barre opzionale vengono clonati in una spina dorsale del plasmide AAV. Questi esperimenti possono essere fatti con una singola sequenza di potenziatore candidato o con molte sequenze in parallelo. Il plasmide viene confezionato in un rAAV e consegnato al cer...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sequenziamento è stato eseguito presso la UC Davis DNA Technologies Core. Ringraziamo il laboratorio di Lin Tian alla UC Davis per la formazione sul packaging rAAV e per averci generosamente regalato plasmidi aiutanti AAV e rep/cap. Questo lavoro è stato supportato da NIH/NIGMS R35GM119831.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Tampone CitratoSigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A: Primer Forward progettato su misuraper la verifica dei cloni dopo la trasformazione. Questi primer sono specifici per il vettore utilizzato e sono stati progettati per il vettore specifico utilizzato nei nostri esperimenti.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A:Primer inverso progettato su misura per la verifica dei cloni dopo la trasformazione. Questi primer sono specifici per il vettore utilizzato e sono stati progettati per il vettore specifico utilizzato nei nostri esperimenti.
AgarosioVWRVWRVN605-500G
Tubi aspiratoriSigma-AldrichA5177-5EAper l'erogazione orale di rAAV
Piastre di Petri batteriologicheThermo Fisher Scientific08-757-100D
CarbenicillinaSigma-AldrichC1389-5G
Pollo IgY anti-GFPThermo Fisher ScientificA10262
Microscopio confocaleZeissLSM900Le immagini sono state scattate sul modello LSM800, ma Zeiss ha lanciato il modello LSM900 negli ultimi anni per sostituire LSM800.
Provette da centrifuga coniche 15 mLThermo Fisher Scientific12-565-269
CryomoldsThermo Fisher ScientificNC9806558Questi stampi sono adatti per il cervello di topo P28. Altre dimensioni possono essere più adatte per tessuti più grandi o più piccoli.
DAPISigma-AldrichD9542-10MG
Forbici da dissezione, 4,5"VWR82027-578
Asino anti-pollo AlexaFlour-488Jackson ImmunoResearch703-545-155
Dulbecco's PBS 1xThermo Fisher ScientificMT21031CV
Eppendorf Provette per microcentrifuga 2,0 mLThermo Fisher Scientific
Falcon provette a fondo tondo 14 mLThermo Fisher Scientific352059
Fast Green coloranteGraingerF0099-1G
Set di pennelli per dettagli finiArtbrush TowerB014GWCLFO
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
Tubi capillari in vetroDrummond Scientific Company5-000-2005
Kit maxi plasmidico HiSpeedQIAGEN12663Kit maxi preparazione plasmidi commerciali
HyClone HyPure Acqua di biologia molecolareVWRSH30538.03
IV set per infusione a farfalla con tubo da 12" e ago da 25GThermo Fisher Scientific26708
KimwipesKimberly Clark34155Salvietta senza lanugine
LB AgarThermo Fisher ScientificBP1425-500LB premiscela di agar per terreni selettivi
McPherson Vannas forbice per irideIntegra LifeSciences360-215
Olio mineraleSigma Life Science69794-500ML
NEB Stabile Competente E. coliNEBC3040I
NucleoSpin Gel e PCR Clean-UpTakara740609.5Kit per reazione enzimatica terreno di pulizia ed estrazione del gel
OCTVWR25608-930
Agitatore orbitaleCole Parmer60-100
ParaformaldeideSigma-Aldrich158127-500G
Provette per strisce PCR 0,2 mLVWR490003-692
Pompa peristalticaGilsonF155005
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10xThermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II DNA polimerasi ad alta fedeltàThermo Fisher ScientificF549L
Latte in polvereSunny Select
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28106
rCutSmart TamponeNEBB6004STampone per digesto di restrizione con PacI, AscI e XmaI
Enzima di restrizione: AscINEBR0558L
Enzima di restrizione: PacINEBR0547L
Enzima di restrizione: XmaINEBR0180L
Terreno di crescita SOCNEBB0920STerreno di recupero dopo la trasformazione
Saccarosio ( Senza RNasi/DNasi)Millipore Sigma033522.5KG
tampone TAEApex20-194
Tubo di trasferimentoGilsonF1179941Per pompa peristaltica
Triton X100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps Sistema di purificazione del DNAThermo Fisher ScientificA1460Mini kit di preparazione del plasmide
22431048

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