Implementazione AAV di costrutti di espressione basati su enhancer in vivo nel cervello di topo

Tracy L. Warren; Jason T. Lambert; Alex S. Nord

doi:10.3791/62650

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Articolo metodologico

Implementazione AAV di costrutti di espressione basati su enhancer in vivo nel cervello di topo

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DOI:

10.3791/62650

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31 marzo 2022

Tracy L. Warren¹^,² , Jason T. Lambert¹^,² , Alex S. Nord¹^,²

¹Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, ²Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un nuovo test di enhancer-reporter transitorio basato su rAAV. Questo test può essere utilizzato per indurre l'espressione guidata dal potenziatore in vivo nel cervello del topo.

Abstract

Gli enhancer sono piattaforme di legame per una vasta gamma di fattori di trascrizione che guidano specifici modelli di espressione di geni specifici del tipo di tessuto e della cellula. Molteplici mezzi per valutare il DNA non codificante e vari stati della cromatina si sono dimostrati utili nel predire la presenza di sequenze enhancer nel genoma, ma convalidare l'attività di queste sequenze e trovare gli organi e gli stadi di sviluppo in cui sono attivi è un processo ad alta intensità di lavoro. I recenti progressi nei vettori del virus adeno-associato (AAV) hanno permesso la consegna diffusa di transgeni ai tessuti del topo, consentendo test di potenziatori in vivo senza la necessità di un animale transgenico. Questo protocollo mostra come un costrutto reporter che esprime EGFP sotto il controllo di un promotore minimo, che non guida l'espressione significativa da solo, può essere utilizzato per studiare i modelli di attività delle sequenze di potenziatori candidati nel cervello del topo. Un costrutto reporter confezionato AAV viene consegnato al cervello del topo e incubato per 1-4 settimane, dopo di che l'animale viene sacrificato e le sezioni cerebrali vengono osservate al microscopio. EGFP appare nelle cellule in cui il potenziatore testato è sufficiente per avviare l'espressione genica, individuando la posizione e lo stadio di sviluppo in cui il potenziatore è attivo nel cervello. I metodi di clonazione standard, l'imballaggio AAV a basso costo e l'espansione dei sierotipi e dei metodi AAV per la consegna in vivo e la lettura standard dell'imaging rendono questo un approccio accessibile per lo studio di come l'espressione genica è regolata nel cervello.

Introduzione

Gli enhancer sono elementi cis-regolatori genomici che fungono da siti di legame del fattore di trascrizione e possono guidare l'espressione di un gene bersaglio in modo spazio-temporale specifico ^1,2. Sono differenzialmente attivi in diversi tipi cellulari, tessuti e stadi di sviluppo e possono essere substrati della variazione genomica correlata al rischio di malattia ^3,4. Pertanto, la necessità di comprendere le dinamiche della funzione enhancer è fondamentale per il progresso nelle applicazioni sia traslazionali che scientifiche di base all'interno....