Differenziazione e polarizzazione dei macrofagi in un fenotipo M2-like utilizzando una linea cellulare di leucemia THP-1 simile a un monocita umano

Sommario

I macrofagi associati al tumore M2-like (TAM) sono associati alla progressione del tumore e alla prognosi sfavorevole nel cancro. Questo protocollo serve come guida dettagliata per differenziare e polarizzare in modo riproducibile le cellule simili ai monociti THP-1 in macrofagi simili a M2 entro 14 giorni. Questo modello è la base per studiare gli effetti antinfiammatori della TAM all'interno del microambiente tumorale.

Abstract

I macrofagi associati al tumore (TAM) possono cambiare la loro espressione e il profilo delle citochine in base a stimoli esterni. Questa notevole plasticità consente a TAM di adattarsi ai cambiamenti in corso all'interno del microambiente tumorale. I macrofagi possono avere principalmente attributi pro-infiammatori (M1-like) o anti-infiammatori (M2-like) e possono passare continuamente tra questi due stati principali. I macrofagi simili a M2 all'interno dell'ambiente tumorale sono associati alla progressione del cancro e alla prognosi sfavorevole in diversi tipi di cancro. Molti metodi diversi per indurre la differenziazione e la polarizzazione delle cellule THP-1 sono utilizzati per studiare i meccanismi cellulari e intercellulari e gli effetti del TAM all'interno del microambiente dei tumori. Attualmente, non esiste un modello stabilito per la polarizzazione dei macrofagi M2-like utilizzando la linea cellulare THP-1 e i risultati dell'espressione e i profili delle citochine dei macrofagi a causa di determinati stimoli in vitro variano tra gli studi. Questo protocollo serve come guida dettagliata per differenziare le cellule simili ai monociti THP-1 in macrofagi M0 e per polarizzare ulteriormente le cellule in un fenotipo simile a M2 entro 14 giorni. Dimostriamo i cambiamenti morfologici delle cellule simili ai monociti THP-1, dei macrofagi differenziati e dei macrofagi polarizzati simili a M2 utilizzando la microscopia ottica. Questo modello è la base per modelli di linee cellulari che studiano gli effetti antinfiammatori della TAM e le loro interazioni con altre popolazioni cellulari del microambiente tumorale.

Introduzione

I macrofagi associati al tumore (TAM) e il loro ruolo nell'infiammazione cronica, nell'insorgenza del cancro e nello sviluppo del tumore sono obiettivi importanti nella recente ricerca^1,2. I monociti del sangue periferico che vengono reclutati nel microambiente tissutale del tumore in via di sviluppo si differenziano in macrofagi e possono essere polarizzati in due sottotipi principali di macrofagi³. Il macrofago attivato classicamente rappresenta il fenotipo M1-like principalmente pro-infiammatorio e il sottotipo M2-like attivato alternativamente mostra caratteristiche prevalentemente antinfiammatorie⁴. I macrofagi possono passare dinamicamente tra questi due fenotipi principali a seconda del loro metabolismo cellulare, con sottotipi intermedi con attributi sia infiammatori che antinfiammatori⁵. TAM rappresenta una popolazione eterogenea di entrambi i fenotipi. Una funzione di promozione del tumore e una prognosi sfavorevole in diversi tipi di tumori è, tuttavia, particolarmente associata ai macrofagi M2-like^6,7,8.

I profili funzionali dei macrofagi e la loro interazione con altre cellule all'interno del microambiente tumorale sono complessi e difficili da catturare in un ambiente in continua evoluzione durante lo sviluppo tumorale in corso. Le linee cellulari possono fornire una popolazione cellulare omogenea con vitalità stabile in coltura, che può facilitare il processo di dimostrazione di meccanismi cellulari e intercellulari definiti. La linea cellulare THP-1 simile ai monociti è un sistema modello legittimo per i monociti umani primari⁹. Questa linea cellulare spontaneamente immortalata è stata ottenuta dal sangue periferico di un bambino di un anno con leucemia monocitica acuta^9,10. La differenziazione e la polarizzazione delle cellule THP-1 sono state riportate da diversi studi e sono state eseguite in più modi diversi^11,12,13,14. L'attivazione e, quindi, la polarizzazione dei macrofagi in un fenotipo M1-like è seguita da un meccanismo di rimbalzo antinfiammatorio compensatorio, promuovendo un fenotipo M2-like attraverso citochine prodotte da macrofagi infiammatori, come l'interleuchina 6 (IL-6) o l'itaconato^15,16. Questo potrebbe servire come meccanismo di rottura per attenuare una risposta infiammatoria eccessiva dopo l'attivazione cellulare¹⁷. Il processo di differenziazione e polarizzazione dei monociti e delle cellule simili ai monociti THP-1 in un fenotipo antinfiammatorio simile a M2 è a sua volta accompagnato da stimoli pro-infiammatori che devono essere superati. Una risposta infiammatoria delle citochine può essere causata da stress meccanico¹⁸, come la modifica dei mezzi per rialimentare le cellule o l'aggiunta di composti chimici per differenziare le cellule THP-1, come il forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA), e indurre la produzione di fattore di necrosi tumorale α (TNFα), interleuchina 1β (IL-1β) o IL-6¹⁹. Questo profilo alterato di espressione delle citochine come risposta alla PMA può influenzare e prevenire la successiva polarizzazione dei macrofagi²⁰. Adeguati periodi di riposo, come riportato in precedenza dopo il trattamento con PMA, consentono a queste risposte infiammatorie di diminuire e facilitare la polarizzazione cellulare in un fenotipo 21 distinto simile a^M2.

Questo protocollo dimostra un metodo per differenziare e polarizzare le cellule simili ai monociti THP-1 in un fenotipo M2-like di macrofagi entro 14 giorni.

Protocollo

NOTA: una panoramica dei passaggi descritti in questo protocollo è illustrata nella Figura 1. È stata acquistata la linea cellulare di leucemia simile a monociti umani THP-1. È stata eseguita una breve analisi di ripetizione in tandem per autenticare la linea cellulare THP-1. Eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili. La linea cellulare monocitica THP-1 cresce in sospensione e non si attacca alle superfici di coltura cellulare. L'aderenza può essere indotta differenziando i monociti in cellule simili a macrofagi attraverso, ad esempio, stress meccanico o trattamento specifico conPMA.

1. Coltivazione e mantenimento di cellule simili a monociti THP-1

1. Impostare un timer per 150 s. Rimuovere il flaconcino congelato contenente la linea cellulare THP-1 (Tabella dei materiali) dall'azoto liquido e scongelarlo immediatamente in un bagno d'acqua pulita (37 °C). Avviare il timer non appena il flaconcino viene messo a bagnomaria. Allentare il tappo per rilasciare la pressione che si sta accumulando a causa del processo di scongelamento ma assicurarsi che l'apertura del tubo non contatti l'acqua, per evitare la contaminazione. Il periodo di tempo ottimale per scongelare le cellule è compreso tra 120-150 s. Continuare a scongelare la sospensione cellulare fino a quando non viene lasciato un chip di ghiaccio delle dimensioni di circa 4 mm all'interno del flaconcino; quindi, procedere immediatamente al passaggio successivo.
2. Trasferire la fase liquida della sospensione cellulare in un tubo da 15 mL contenente 9 mL di mezzi di crescita caldi (37 °C) (Tabella dei materiali). Quindi, trasferire 1 mL della sospensione a cellule medie calde nel flaconcino THP-1 e di nuovo nel tubo da 15 ml per sciogliere il chip di ghiaccio rimanente e lavare il flaconcino per assicurarsi che non vengano lasciate indietro le cellule.
3. Mescolare delicatamente la sospensione tubando su e giù con una pipetta da 1000 μL. Rimuovere un piccolo campione (circa 10 μL) per contare le cellule per la vitalità (usando il tripano blu per l'esclusione) mentre sono filate. Abbassare la sospensione a celle calde a 200 x g per 7 minuti a 37 °C.
4. Rimuovere completamente il surnatante e risospendare con un certo volume di terreno di crescita caldo per ottenere una densità cellulare di 5 x 10⁵/mL. Mescolare delicatamente la sospensione e trasferire 22 mL di volume in palloni di coltura cellulare T-75 (Tabella dei materiali). Conservare i palloni in posizione verticale in un incubatore a 37 °C con una concentrazione di anidride carbonica (CO₂₎del 5%. Scambia i mezzi di crescita ogni 3-4 giorni.

2. Semina di cellule THP-1 e differenziazione in macrofagi M0

1. Preparare la cellula contenente il mezzo di crescita con la rispettiva densità cellulare per seminare le cellule ad una densità di 3 x^{10 5}/ mL / pozzetti in piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti (Tabella dei materiali). Mescolare delicatamente il mezzo e preparare aliquote di 26 ml, ciascuna messa in un tubo da 50 ml. Utilizzare ogni aliquota da 26 ml per seminare le cellule in una rispettiva piastra.
2. Trasferire 1 mL del mezzo contenente cellule in ciascun pozzettino di una piastra a 24 pozzetti. Mescolare delicatamente il supporto pipettando su e giù tra i trasferimenti.
3. Preparare una soluzione madre di PMA (sciogliere 1 mg di PMA in 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO) = ~16 mM soluzione di PMA in DMSO) e diluirla con soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) fino a una concentrazione finale di lavoro di 10 ng/μL subito prima del trattamento cellulare (Tabella dei materiali). Tenere la soluzione sul ghiaccio e utilizzarla immediatamente. Non ricongelare. Aggiungi 100 ng di PMA per pozze. Lasciare che ogni piastra cellulare rimanga nell'incubatrice senza ulteriori trattamenti per 72 ore.
4. Dopo 72 ore, rimuovere il terreno di coltura e sostituirlo con 1 mL di terreno di crescita fresco. Non toccare il fondo dei pozzette con punte di pipetta. Lascia riposare le cellule per altre 96 ore nell'incubatrice.
5. Dopo 96 ore, ripetere il passaggio 2.4 (cambio del supporto) e lasciare riposare le celle per altre 24 ore.
   NOTA: I macrofagi M0 sono ora pronti per essere utilizzati per esperimenti (Figura 2). Immediatamente prima di trattare le cellule come parte di ulteriori esperimenti, considerare un cambiamento del mezzo solo con RPMI(Tabella dei materiali)poiché gli integratori di mezzi di crescita possono causare interferenze con i reagenti aggiunti per il trattamento cellulare. Nel caso in cui siano necessari macrofagi simili a M2, procedere con la sezione 3.

3. Polarizzazione dei macrofagi M0 in macrofagi simili a M2

1. Preparare una soluzione madre di IL-4 e IL-13 (sciogliere 20 μg di IL-4 o IL-13 in 200 μL di acqua priva di nucleasi) e diluirla ad una concentrazione finale di lavoro di 2 ng/μL con PBS immediatamente prima del trattamento cellulare. Tenere la soluzione sul ghiaccio e utilizzarla immediatamente. Non ricongelare.
2. Rimuovere il mezzo di crescita e sostituirlo con 1 mL di terreno di crescita fresco. Aggiungere 20 ng di interleuchina 4 (IL-4) e 20 ng di interleuchina 13 (IL-13) per pozzo. Lasciare riposare le cellule per 48 ore nell'incubatrice.
3. Dopo 48 ore, ripetere il passaggio 3.2. Lasciare riposare le cellule per altre 48 ore nell'incubatrice.
4. Rimuovere il mezzo di crescita e sostituirlo con 1 mL di terreno di crescita fresco. Lasciare riposare le cellule per 48 ore nell'incubatrice.
   NOTA: i macrofagi simili a M2 sono ora pronti per essere utilizzati per gli esperimenti (Figura 2). Immediatamente prima di trattare le cellule come parte di ulteriori esperimenti, prendere in considerazione un cambiamento del supporto solo con RPMI(Tabella dei materiali)poiché i supplementi dei mezzi di crescita possono causare interferenze.

4. Distacco e raccolta di macrofagi per citometria a flusso

NOTA: utilizzare un metodo meccanico che combini lo shock a freddo e il raschiamento cellulare per staccare e raccogliere i macrofagi polarizzati dalle piastre per la citometria a flusso.

1. Rimuovere il mezzo cellulare caldo e sostituirlo con una miscela di PBS ghiacciato (senza calcio e magnesio) e siero bovino fetale al 5% (FBS), 1 ml per pozzed. Subito dopo, posizionare la piastra cellulare sul ghiaccio per 45 minuti. Non posizionare la piastra cellulare sul ghiaccio prima che il mezzo cellulare caldo venga rimosso, poiché ciò ridurrà significativamente la vitalità cellulare. Mantenere le cellule sul ghiaccio solo dopo aver indotto shock freddo con miscela PBS/5% FBS ghiacciata.
2. Dopo 45 minuti sul ghiaccio, raschiare via le celle usando mini raschietti per celle (Tabella dei materiali). Trasferire delicatamente i macrofagi staccati in PBS freddo/ 5% FBS in un tubo da 15 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio in ogni momento fino a quando le cellule non sono macchiate.
   NOTA: Pool otto pozzetto di cellule per raggiungere un numero adeguato di cellule per la colorazione.

Risultati

Sono stati caratterizzati macrofagi simili a M2 e la polarizzazione M2 è stata convalidata utilizzando la citometria a flusso per i marcatori Cluster of Differentiation (CD) CD14, CD11b, CD80 (marcatore M1-like) e CD206 (marcatore M2-like). La colorazione della citometria a flusso è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore. I macrofagi sono stati lavati con PBS/5% FBS e incubati con blocco del recettore Fcγ per evitare un legame aspecifico. Le cellule sono state quindi colorate con anticorpi CD14 e CD80 anti-u...

Discussione

Questo protocollo sulla differenziazione e polarizzazione delle cellule simili ai monociti THP-1 entro 14 giorni fornisce un metodo per ottenere macrofagi con un fenotipo M2 distinto a causa della lunga incubazione del trattamento delle cellule con adeguati periodi di riposo tra i passaggi.

Alcuni passaggi sono fondamentali per questo protocollo. Il tempo di raddoppio dei monociti THP-1 è di circa 26 ore. Le cellule possono essere divise ad una densità cellulare di 9 x^{10 5}/mL e devo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,4% trypan blue	VWR, Radnor, USA	152-5061
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
Pipetta sierologica da 10 mL	VWR, Radnor, USA&	nbsp; 89130-898
1000 μ L TipOne puntali per pipette	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Provetta da centrifuga	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μ L TipOne puntali per pipette	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μ L TipOne puntali per pipetta	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL pipetta sierologica	VWR, Radnor, USA.	89130-900
pipetta sierologica da 5 mL	VWR, Radnor, USA&	nbsp; 89130-896
Provetta da centrifuga da 50 mL	VWR, Radnor, USA	89039-662
Soluzione accutasi 500 mL	Sigma, St. Louis, USA	A6964
Soluzione antibiotica antimicotica (100x), Sigma stabilizzata	, St. Louis, USA	A5955-100 mL	con 10.000 unità di penicillina, 10 mg di streptomicina e 25 μ g di amfotericina B per mL, filtrato sterile, BioReagent, adatto per colture cellulari
Legante Incubatore di CO2	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
Pallone CytoOne T-75cm con tappo filtrante	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio dovrebbero essere utilizzati, poiché entrambi possono alterare la polarizzazione dei macrofagi
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerato)	Eppendorf, Enfield, USA-Alcool
etilico (70%)	-	-
FACSCalibur flow cytometer	BD Biosciences, San Diego, USA	-	Il citometro a flusso funziona con il software CellQuest (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Citometria a flusso, marcatore di cellule mieloidi (100 test)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Citometria a flusso, marcatore M1 (100 test)
FITC IgG1 di topo κ Controllo isotipico	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Citometria a flusso, controllo isotipo per CD80 (100 test)
FITC Mouse IgG2a, κ Controllo degli isotipi	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Citometria a flusso, controllo degli isotipi per CD14 (100 test)
Blocco Fc BD umano	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	Citometria a flusso, blocco Fc (0,25 mg)
Interleuchina umana 13 (IL-13)	R& D, Minneapolis, Stati Uniti	IL-771-10 μ g
Interleuchina umana 4 (IL-4)	R& D, Minneapolis, Stati Uniti	SRP3093-20 μ g
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City,
Solution, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolisaccaride (LPS) da E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer emocitometro	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Microscopio invertito Nikon Eclipse TS100		Nikon, Melville, USA-Acqua
priva di nucleasi	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Microscopio ottico Olympus RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
Pipetta variabile P10- Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
Pinzatura variabile P1000-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
Pinzatura variabile P200- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Topo Anti-Umano CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Citometria a flusso, marcatore di cellule mieloidi (100 test)
PE Topo IgG1, κ Controllo dell'isotipo	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Citometria a flusso, controllo dell'isotipo per CD11b (100 test)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Citometria a flusso, marcatore M2 (100 test)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Controllo isotipico	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Citometria a flusso, controllo isotipo per CD206 (100 test)
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Pipettatore Powerpette Plus	VWR, Radnor, USA	75856-448
Bagno d'acqua di precisione (modello 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640	Medium ATCC, Manassas, USA	30-2001
Linea cellulare THP-1, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202