Utilizzo del miglioramento della fluorescenza indotta da proteine risolte nel tempo per identificare le conformazioni locali stabili un monomero α-sinucleina alla volta

Sofia Zaer; Eitan Lerner

doi:10.3791/62655

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Articolo metodologico

Utilizzo del miglioramento della fluorescenza indotta da proteine risolte nel tempo per identificare le conformazioni locali stabili un monomero α-sinucleina alla volta

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DOI:

10.3791/62655

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30 maggio 2021

Sofia Zaer¹ , Eitan Lerner¹^,²

¹Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, ²The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

In questo articolo

Sommario

Il potenziamento della fluorescenza indotto da proteine a singola molecola risolto nel tempo è un utile sensore di prossimità spettroscopico a fluorescenza sensibile ai cambiamenti strutturali locali nelle proteine. Qui mostriamo che può essere usato per scoprire conformazioni locali stabili in α-sinucleina, che è altrimenti nota come globulare non strutturata e instabile quando misurata usando il righello FRET a lungo raggio.

Abstract

L'uso di righelli spettroscopici per tracciare più conformazioni di singole biomolecole e le loro dinamiche hanno rivoluzionato la comprensione delle dinamiche strutturali e dei suoi contributi alla biologia. Mentre il righello basato su FRET riporta le distanze inter-coloranti nell'intervallo 3-10 nm, altre tecniche spettroscopiche, come il potenziamento della fluorescenza indotto da proteine (PIFE), riportano la vicinanza tra un colorante e una superficie proteica nell'intervallo più breve di 0-3 nm. Indipendentemente dal metodo di scelta, il suo uso nella misurazione di biomolecole a diffusione libera una alla volta recupera gli istogrammi del parametro sperimentale producendo sotto-popolazioni separate distribuite centralmente di biomolecole, dove ogni sotto-popolazione rappresenta una singola conformazione che è rimasta invariata entro millisecondi, o più conformazioni che si interconvertono molto più velocemente dei millisecondi, e quindi una sotto-popolazione mediata. Nel FRET a singola molecola, dove il parametro riportato negli istogrammi è l'efficienza FRET inter-colorante, una proteina intrinsecamente disordinata, come il monomero α-sinucleina in tampone, è stata precedentemente segnalata come esibiva una singola sotto-popolazione mediata di conformazioni multiple che si interconvertono rapidamente. Mentre questi risultati passati dipendono dall'intervallo di 3-10 nm del righello basato su FRET, abbiamo cercato di mettere alla prova questa proteina usando PIFE a singola molecola, dove tracciamo la durata di fluorescenza delle proteine α-sinucleina labelte sCy3 sito-specifiche una alla volta. È interessante notare che, utilizzando questo sensore di prossimità spettroscopico a corto raggio, la α-sinucleina etichettata sCy3 presenta diverse sotto-popolazioni di vita con una vita media nettamente diversa che si interconverte in 10-100 ms. Questi risultati mostrano che mentre α-sinucleina potrebbe essere disordinata a livello globale, raggiunge comunque strutture locali stabili. In sintesi, in questo lavoro evidenziamo il vantaggio di utilizzare diversi sensori di prossimità spettroscopici che tracciano i cambiamenti strutturali locali o globali una biomolecola alla volta.

Introduzione

Negli ultimi due decenni, i metodi basati sulla fluorescenza a singola molecola sono diventati un potente strumento per misurare le biomolecole^1,^2,sondando come si distribuiscono i diversi parametri biomolecolari e come si interconvertono dinamicamente tra diverse sotto-popolazioni di questi parametri a risoluzione inferiore al millisecondo^3,^4,^5. I parametri in queste tecniche includono l'efficienza di trasferimento di energia nelle misure FRET ^6,^7,l'anisotropia di fluor....