Articolo metodologico

Studio di trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola della sintesi proteica del ribosoma

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DOI:

10.3791/62664

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6 luglio 2021

1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

In questo articolo

Sommario

Il trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola è un metodo che traccia la dinamica del tRNA durante la sintesi proteica ribosomiale. Tracciando i singoli ribosomi, vengono identificate popolazioni disomogenee, che fanno luce sui meccanismi. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare i cambiamenti conformazionali biologici in generale per rivelare relazioni dinamico-funzionali in molti altri biosistemi complessi. I metodi a singola molecola possono osservare passaggi non limitanti la velocità e intermedi chiave poco popolati, che non sono accessibili con i metodi convenzionali di ensemble a causa dell'effetto medio.

Abstract

Il ribosoma è un grande complesso ribonucleoproteico che assembla le proteine in modo processivo lungo i modelli di mRNA. Il diametro del ribosoma è di circa 20 nm per ospitare grandi substrati di tRNA nei siti A-, P- ed E. Di conseguenza, la dinamica dei ribosomi viene naturalmente de-sfasata rapidamente. Il metodo a singola molecola può rilevare ogni ribosoma separatamente e distinguere popolazioni disomogenee, il che è essenziale per rivelare i complicati meccanismi dei sistemi multicomponenti. Riportiamo i dettagli di un metodo smFRET basato sul microscopio invertito Nikon Ti2 per sondare la dinamica dei ribosomi tra la proteina ribosomiale L27 e i tRNA. L'L27 è etichettato nella sua posizione unica Cys 53 e ricostituito in un ribosoma progettato per mancare di L27. Il tRNA è etichettato nella sua regione del gomito. Mentre il tRNA si sposta in diverse posizioni all'interno del ribosoma durante il ciclo di allungamento, come la pre e post traslocazione, le efficienze e le dinamiche FRET mostrano differenze, che hanno suggerito più sottopopolazioni. Queste sottopopolazioni non sono rilevabili con metodi di insieme. Il microscopio smFRET basato su TIRF è costruito su un microscopio invertito manuale o motorizzato, con illuminazione laser costruita in casa. I campioni di ribosomi vengono purificati mediante ultracentrifugazione, caricati in una cella campione multicanale costruita in casa e quindi illuminati tramite un campo laser evanescente. Lo spot laser a riflessione può essere utilizzato per ottenere il controllo del feedback della messa a fuoco perfetta. I segnali di fluorescenza sono separati da una torretta-filtro motorizzata e raccolti da due telecamere CMOS digitali. Le intensità vengono recuperate tramite il software NIS-Elements.

Introduzione

Il ribosoma è un complesso ribonucleoproteico grande ø 20 nm di una grande (50S) e una piccola (30S) subunità. Assembla peptidi lunghi lungo il modello di mRNA in modo processivo e cooperativo. Il ribosoma 30S si lega al fMet-tRNAfMet e all'mRNA per avviare la sintesi proteica, e il 50S si unisce quindi per formare il complesso di iniziazione degli anni '70. I tRNA portano gli amminoacidi al ribosoma nel sito A (sito di legame aminoacil-tRNA), mentre la catena peptidil allungata è tenuta nel sito P (sito di legame peptidil-tRNA). Nel complesso di pre-traslocazione, la catena peptidil viene trasferita al tRNA nel sito A con l'aggiunta di un amminoacido. Nel frattempo, il tRNA del sito P è deacilato. Quindi, i TRNA A-, P-tRNA si spostano nei siti P-, E- per formare il complesso post-traslocazione, in cui il sito E rappresenta il sito di uscita del tRNA. In questo stato, il peptidil-tRNA ritorna al sito P. Il ciclo di allungamento continua tra le pre- e post-conformazioni mentre il ribosoma trasloca sull'mRNA, un codone alla volta1. Il ribosoma è altamente coordinativo di diversi siti funzionali per rendere questo processo efficiente e preciso, come il ratcheting inter-subunità2,le fluttuazioni di ibridazione del tRNA3,le attivazioni della GTPasi4,l'apertura-chiusura del gambo L15,ecc. Di conseguenza, i ribosomi de-fase rapidamente perché ogni molecola si muove al proprio ritmo. I metodi convenzionali possono dedurre solo parametri medi apparenti, ma le specie poco popolate o di breve durata saranno mascherate nell'effetto medio6. Il metodo a singola molecola può rompere questa limitazione rilevando ogni ribosoma individualmente, quindi identificare diverse specie tramite la ricostruzione statistica7. Sono stati implementati diversi siti di etichettatura per sondare la dinamica dei ribosomi, come le interazioni tra tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10, ecc. Inoltre, etichettando le subunità grandi e piccole, rispettivamente, si osserva la cinetica a cricchetto inter-subunità e la coordinazione con i fattori11,12. Nel frattempo, il metodo smFRET ha ampie applicazioni in altri processi biologici centrali e i metodi FRET multicolore stanno emergendo13.

In precedenza è stata sviluppata una nuova coppia di ribosomi FRET14,15. La proteina ribosomiale ricombinante L27 è stata espressa, purificata ed etichettata e incorporata nel ribosoma. Questa proteina ha interagito con i tRNA a distanza ravvicinata e ha contribuito a stabilizzare il tRNA del sito P nel complesso post-traslocazione. Quando il tRNA si sposta dal sito A- al sito P, la distanza tra questa proteina e il tRNA si accorcia, che può essere distinta dal segnale smFRET. Sono state identificate sottopopolazioni multiple di ribosomi utilizzando metodi statistici e mutagenesi, e lo scambio spontaneo di queste popolazioni nel complesso pre- ma non post- traslocazione suggerisce che il ribosoma è più flessibile prima di muoversi sull'mRNA e più rigido durante la decodifica16,17,18. Queste variazioni sono essenziali per la funzione del ribosoma. Qui, il protocollo descrive i dettagli dell'etichettatura dei ribosomi / tRNA, la loro incorporazione nel ribosoma, la preparazione del campione smFRET e l'acquisizione / analisi dei dati19.

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Protocollo

1. Preparazione di ribosomi e tRNA etichettati per il rilevamento di FRET

  1. Isolare il ribosoma senza L27 dal ceppo di E. coli IW312 secondo i protocolli standard20,21. Estrarre il ribosoma regolare dal ceppo di E. coli MRE600.
  2. Clonare il gene rpmA di L27 con C-terminal His-tag in plasmide pET-21b (+), che viene trasformato ed espresso in cellule BL21(DE3)pLysS15. Purificare la proteina tramite una colonna di sefarosio preconfezionata.
  3. Etichettatura di L27
    1. Incubare 20-100 μM di L27 purificato in 100 μL con 2-10 volte l'eccesso di TCEP (Tris-2-carbossietil-fosfina) a temperatura ambiente (RT) per 30 min. Il buffer scambia la soluzione nel buffer PBS (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl), utilizzando una colonna nap-5. Aggiungere in soluzione un colorante mono-reattivo Cy5-maleimide in eccesso di 10 volte in DMSO e incubare a RT al buio per 2 ore.
    2. Caricare la soluzione proteica etichettata (500 μL) sopra menzionata su una colonna Nap-5 per rimuovere il colorante in eccesso. Assicurarsi che la proteina eluisci nella prima banda colorata, seguita dall'eluito colorante libero nella seconda banda, rispettivamente. Raccogliere la proteina eluita in 1 mL di tampone TAM10 (20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 0,5 mM EDTA e 7 mM BME (2-mercaptoetanolo)).
  4. Ricostituire il ribosoma con L27. Mescolare la proteina L27 etichettata con una quantità uguale di ribosoma IW312 in tampone TAM10 e incubare a 37 °C per 1 ora. Rimuovere la proteina libera mediante ultracentrifugazione del cuscino di saccarosio (100.000 x g,durante la notte) per consentire al ribosoma di formare un pellet di colore blu sul fondo del tubo.
  5. Etichettare il tRNAPhe secondo il rapporto precedentemente pubblicato22. In primo luogo, incubare il tRNA (10 A260 in 1 mL di acqua) con 100 μL di NaBH4 (100 mM di stock, aggiungendo goccia) a 0 °C per 1 ora. Liberare i tRNA da NaBH4 non reazionato tramite precipitazione di etanolo tre volte aggiungendo 1/10 di volume di 3 M KAc (pH 5,0) e 2,5x volume di etanolo. Incubare il tRNA ridotto con 1 μL di soluzione colorante Cy3-NHS (1 mg in 10 μL di DMSO) in un volume minimo (~20 μL) di formiato di sodio 0,1 M (pH 3,7). Dopo 2 ore di incubazione a 37 °C, separare il tRNA dal colorante non reattato tramite una piccola colonna G25 Sephadex, quindi rimuovere il colorante libero mediante precipitazione di etanolo due volte.

2. Preparazione dei complessi di ribosomi

  1. Esprimere e purificare le proteine His-tagged di IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts e tRNA sintetasi utilizzando i metodi standard15.
  2. Preparare la miscela di inizio aggiungendo i seguenti ingredienti nel tampone TAM10 a 37 °C per 15 minuti: 1 μM del ribosoma etichettato; 1,5 μM ciascuno di IF1, IF2 e IF3; 2 μM di mRNA biotinilato (codifica mf per i primi due amminoacidi); 4 μM di fMet-tRNAfMetcarico; e 1 mM GTP.
  3. Preparare la miscela EF-Tu_G mescolando i seguenti ingredienti in tampone TAM10 a 37 °C per 15 minuti: 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP e 0,02 mg/mL di piruvato chinasi.
  4. Preparare la miscela EF-Tu_NoG simile al passaggio 2.3 senza EF-G.
  5. Preparare la miscela di Phe mescolando i seguenti ingredienti in acqua priva di nucleasi a 37 °C per 15 minuti: 100 mM Tris (pH 7,5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM fenilalanina sintetasi specifica, 2 A260/mL di tRNAPheetichettato e 50 μM fenilalanina.
  6. Preparare il complesso di pre-traslocazione (PRE) mescolando le miscele di inizio, EF-Tu_NoG e Phe nel rapporto di 1:2:2, a 37 °C per 2 min. Dopo l'incubazione, purificare il PRE mediante ultracentrifugazione del cuscino di saccarosio da 1,1 M durante la notte a 100.000 x g.
  7. Preparare il complesso post-traslocazione (POST) mescolando le miscele di inizio, EF-Tu_WG e Phe nel rapporto di 1:2:2, a 37 °C per 10 minuti. Dopo l'incubazione, purificare il POST mediante ultracentrifugazione del cuscino di saccarosio 1,1 M durante la notte a 100.000 x g.

3. Preparazione di diapositive campione

  1. Pulire i vetrini del microscopio (75 mm x 25 mm) contenenti sei coppie di fori (1 mm di diametro). Ogni coppia forma un ingresso-uscita della camera del campione. Assicurarsi che la distanza tra ciascun foro di ingresso-uscita sia di 13 mm e che la distanza centro-centro tra due canali sia di 6 mm. Metti sei diapositive in un crogiolo di vetro.
  2. Riempire il crogiolo con acetone e sonicarli per 5 minuti. Decantare l'acetone e risciacquare i vetrini tre volte con acqua ultrapura. Riempire nuovamente il crogiolo con acqua e 1 mL di 10 M KOH. Sonicate per 20 min.
  3. Risciacquare i vetrini tre volte con acqua ultrapura. Riempire nuovamente il crogiolo con etanolo e sonicate per 5 minuti. Decantare completamente il solvente. Lasciare asciugare le diapositive nella cappa aspirante.
  4. Pulire le coperture in vetro del microscopio (spessore n. 1,5, 24 x 40 mm). Eseguire i passaggi di pulizia come descritto nei passaggi 3.1-3.3.
  5. Cuocere i vetrini puliti e i coperchi a 300 °C per 3 ore. Tenerli in forno per una notte per raffreddarli.
  6. Rivestire il coverslip con aminosilane. Nel crogiolo contenente coverslips, versare una miscela di metanolo (100 ml di metanolo, 5 ml di acqua, 0,5 ml di HAc e 1 mL di aminosilano). Riscaldare il crogiolo a bagnomaria per 10 minuti, sonicarlo per 10 minuti, quindi riscaldare il crogiolo a bagnomaria per altri 10 minuti. Decantare la miscela di metanolo, sciacquare bene il coperchio in tre crogioli di acqua pulita. Eliminare le superfici con un flusso di azoto secco attraverso un ago.
  7. Rivestire le coperture con biotina-PEG in un cappuccio laminare pulito.
    1. Per produrre la soluzione PEG, utilizzare 98 mg di PEG e 2-3 mg di biotina-PEG in 200 μL di soluzione naHCO3 da 100 mM.
    2. Posare un coverslip piatto su una superficie. Far cadere con attenzione 60 μL di soluzione PEG sul bordo superiore. Quindi, adagere un altro coverslip sopra di esso, lasciando che l'effetto capillare diffonda la soluzione tra i due coverslip. Assicurarsi che non si formino bolle.
    3. Ripetere il passaggio 3.7.2 per altre due coppie di coverslip. Rivestire sei pezzi di coverslips con biotina. Se sono necessari più coverslip, regolare la quantità di PEG e Biotina PEG di conseguenza per creare più soluzione PEG.
    4. Conservare queste coperture in una scatola vuota piena d'acqua e incubare per 3 ore al buio.
    5. Dopo 3 ore, separare i coperchi, risciacquare con acqua in tre crogioli consecutivi e spurgare con un flusso di azoto secco. Posizionare le coperture rivestite su un rack di ceramica. Contrassegnare la superficie con il rivestimento.
  8. Assemblare le camere campione19.
    1. Tirare le punte affilate delle pipette attraverso i fori sulle diapositive di vetro fino a quando non si adattano strettamente. Raschiare le estremità affilate fino a quando non è completamente piatto sulla superficie del vetro. Tagliare l'altra estremità della punta a circa 5 mm per il caricamento del campione.
    2. Tagliare un nastro biadesivo con il motivo del canale su di esso (25 x 40 mm).
    3. Attaccare il nastro biadesivo sulle diapositive di vetro sul lato piatto.
    4. Attaccare la copertina rivestita sul nastro biadesivo. Premere su di esso per creare una tenuta ermetica della camera del campione. Assicurarsi che il lato rivestito sia rivolto verso l'interno.

4. Imaging FRET a singola molecola

  1. Accendere il computer.
  2. Accendere l'interruttore del microscopio.
  3. Avviare l'interfaccia di controllo laser e accendere il laser. Premere il pulsante di attivazione sulla scatola di controllo laser per riscaldare il laser.
  4. Accendi le telecamere.
  5. Avviare il programma software associato al microscopio. Fare clic sull'otturatore superiore disattivato e fare clic sulla spia accesa.
  6. Preparare il tampone tam10_WT aggiungendo 10 μL di Tween-20 al 5% in 1 mL di tampone TAM10.
  7. Preparare la soluzione deossidica pesando 3 mg di glucosio ossidasi in un piccolo tubo di microcentrifuga. Aggiungere 45 μL di catalasi. Vortice delicatamente per sciogliere il solido. Ruotare a 20.000 x g in una microcentrifuga per 1 minuto. Prendi il surnatante.
  8. Preparare la soluzione di glucosio al 30% in acqua e la soluzione di Trolox da 200 mM in DMSO.
  9. Preparare 0,5 mg/mL di soluzione di streptavitina in acqua priva di nucleasi.
  10. Aggiungere una goccia di olio per immagini all'obiettivo TIRF.
  11. Metti le camere campione sull'obiettivo.
  12. Riempire la camera con 10 μL di soluzione di streptavitina. Attendere 1 min.
  13. Lavare la camera con 30 ml di tampone TAM10_WT e raccogliere la soluzione run-through con una carta da filtro piegata. Attendere 1 min.
  14. Diluire i complessi di ribosomi (PRE o POST) a una concentrazione di 10-50 nM con tampone tam10_WT.
  15. Caricare 20 μL del campione di ribosoma nel canale. Attendere 2 min.
  16. Creare il tampone di imaging (50 μL di tampone TAM10 più 0,5 μL ciascuno di soluzioni deossidiche, glucosio e Trolox). Mescolare bene il buffer.
  17. Lavare la camera con 30 μL del buffer di imaging.
  18. Impostare la fotocamera per acquisire 100 ms / frame, 16 bit, 4 x 4 binning.
  19. Fare clic sull'otturatore superiore acceso e sulla spia spenta.
  20. Avviare l'acquisizione della fotocamera. Distribuisci le immagini in tre finestre che rappresentano due singole telecamere e la sovrapposizione.
  21. Fare clic su Messa a fuoco automatica. Ottimizza per trovare la messa a fuoco migliore.
  22. Fare clic su un metodo. Impostare i punti di campo, l'archiviazione dei file e il numero di ciclo.
  23. Fare clic su Esegui.
    NOTA: viene visualizzata una nuova finestra con imaging in tempo reale. L'avanzamento della serie temporale e la serie del campo visivo sono mostrati nella parte superiore della finestra.
  24. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, chiudi la finestra popup.
  25. Aprire il file ND (file acquisito).
  26. Clicca su ROI / editor ROI semplice. Scegliete l'opzione Cerchio.
  27. Seleziona il ROI sull'immagine. Fare clic su Fine quando è completo.
  28. Fare clic su Misurazione / Misurazione del tempo per visualizzare i dati come grafico o come foglio di calcolo.
  29. Aprire la scheda Esporta. Impostare i parametri di esportazione.
  30. Fare clic su Esporta per salvare le intensità.

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Risultati

Lo smFRET aveva il ribosoma etichettato nella posizione centrale del traffico di tRNA, per distinguere la traslocazione del tRNA dal sito A- al sito P (Figura 1)15. La distanza dal residuo di etichettatura L27 al tRNA del sito A o P è rispettivamente di 52 o 61 Å, corrispondente all'efficienza FRET di 0,47 e 0,65. Dopo la raccolta delle immagini, le intensità di fluorescenza dai canali donatore e accettore sono state recuperate e tracciate come time lapse (

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Discussione

SmFRET è sensibile ai segnali di fondo. In primo luogo, è necessario rivestire la camera del campione con un'interpolazione dello 0,05% e quindi essere aggiunta contemporaneamente alla soluzione di ribosoma per bloccare il legame non specifico del ribosoma alla superficie. Per vedere la fluorescenza dall'emissione dell'accettore Cy5, il cocktail di scavenger di ossigeno (soluzioni deossidiche, glucosio e Trolox) è essenziale. Senza questa soluzione, lo sbiancamento è troppo veloce nel canale accettore per ottenere inform...

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Dichiarazioni

Y. Wang non dichiara alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è sostenuto dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (R01GM111452) e dalla Welch Foundation (E-1721).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AminosilanoLaysanbioMPEG-SIL-5000
Biotina-PEGLaysanbioBiotina-PEG-SVA-5000
Cellule BL21 (DE3)pLysSNovagen71403
Catalasimilliporo sigmaC3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuganuaire
Cy3 / C5-maleimmideApexBioA8138/A8140
Microscopio invertito ECLIPSE Ti2Nikon
EdgeGARD Cappa a flusso laminareBaker
Glucosio ossidasimillipore sigmaG2133
Colonna Histrap HP (colonna di sefaroso preconfezionata)Cytiva17524701
Vetrino coprioggetto per microscopioVWR48393-230
Vetrini per microscopioVWR470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 fotocameraHamamatsu
PEG (5.000)LaysanbioMPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmideNovagen69741
SonicatoreVWRCPX-952-518R
TCEPApexbioB6055
TroloxMillipore Sigma238813

Riferimenti

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