Articolo metodologico

Analisi NMR quantitativa 31P di Lignine e Tannini

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DOI:

10.3791/62696

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2 agosto 2021

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1Department of Molecular Sciences and Nanosystems, Ca’ Foscari University of Venezia, 2Departments of Chemistry and Forest Biomaterials, North Carolina State University

In questo articolo

Sommario

31 anni P NMR è un potente strumento per la delucidazione strutturale dei polifenoli. Questa procedura analitica veloce, facile, precisa, quantitativa e altamente riproducibile, che consente la quantificazione e la differenziazione dei diversi tipi di gruppi idrossi, fenolici e carbossilici in lignine e tannini, è ora diventata uno strumento analitico di routine.

Abstract

Lo sviluppo di prodotti di bioraffineria sostenibile si confronta, tra l'altro, con la sfida della lignina e della valorizzazione del tannino. Questi abbondanti biopolimeri aromatici rinnovabili non sono stati ampiamente sfruttati a causa della loro intrinseca complessità strutturale e degli alti gradi di variabilità e diversità delle specie. La mancanza di una struttura primaria definita per questi polifenoli è ulteriormente aggravata da complesse alterazioni chimiche indotte durante la lavorazione, alla fine impartendo una grande varietà di caratteristiche strutturali di estrema importanza per qualsiasi ulteriore sforzo di utilizzo.

Di conseguenza, un protocollo per l'identificazione e la quantificazione rapida, semplice e inequivocabile dei vari gruppi funzionali presenti nei polifenoli naturali, è un prerequisito fondamentale per comprenderne e di conseguenza adattarne la reattività e l'eventuale utilità.

Quantitative 31P NMR offre l'opportunità di identificare in modo rapido e affidabile fenoli non sostituiti, o-mono sostituiti e o-disustastituiti, HH alifatici e acidi carbossilici in lignine e tannini con ampio potenziale applicativo.

La metodologia consiste in una procedura quantitativa in situ di etichettatura quantitativa della lignina o del tannino utilizzando un'idonea sonda contenente 31P, seguita dall'acquisizione di uno spettro NMR quantitativo di 31P in presenza di uno standard interno. L'elevata abbondanza naturale del nucleo 31P consente piccole quantità del campione (~ 30 mg) e brevi tempi di acquisizione NMR (~ 30-120 min) con segnali 31P ben risolti che dipendono fortemente dall'ambiente chimico circostante dei gruppi OH marcati.

Introduzione

Questa procedura, che è stata recentemente pubblicata su Nature Protocols1, è stata citata oltre 3.000 volte nella letteratura d'archivio ed è diventata una misura di routine per la caratterizzazione della lignina e del tannino poiché fornisce informazioni strutturali essenziali, rapide e riproducibili.

Lignina e tannini
Quando la chimica verde è stata introdotta da Paul T. Anastas e John C. Werner2,3, ha drasticamente cambiato la concezione generale della chimica. In particolare, l'importanza di utilizzare materiali sostenibili al posto delle materie prime fossili, come petrolio e carbone, come punto di partenza è evidenziata come un aspetto cruciale2,3. Tra i diversi tipi di biomassa, la lignina è il biopolimero aromatico più abbondante e può essere vista come una potenziale fonte di prodotti industriali e prodotti ad alto valore aggiunto4.

La lignina è il secondo costituente del legno più abbondante (con la cellulosa prima e l'emicellulosa terza). Il suo contenuto nelle piante varia a seconda del tipo di pianta: ad esempio legni duri caratterizzati da una minore quantità di lignina rispetto ai legni teneri (20% ± 4% contro 28% ± 4%). Inoltre, la distribuzione della lignina all'interno del tessuto vegetale non è omogenea: il contenuto di lignina più elevato si trova nella parete cellulare5,6. La lignina è un materiale polifenolico ottenuto industrialmente come sottoprodotto dell'industria della carta/cellulosa7. Viene recuperato dal processo di pasta di legno, in cui i trucioli di legno vengono lavorati principalmente in presenza di condizioni ioniche OH- e / o OH - + HS- per separare la cellulosa dall'emicellulosa e dalla lignina (processi Soda e / o Kraft)8,9.

I primi tentativi di studiare la lignina furono fatti da Payen e Schultze, rispettivamente, nel 1838 e nel 186510. Nel 1977, Adler riassunse tutte le conoscenze disponibili rilevanti di quel tempo11. Attualmente è riconosciuto che i mattoni della lignina sono tre unità fenil-propanoidi: p-cumarile, coniferilici e alcoli sinapilici. Questi monomeri, grazie ad un processo di polimerizzazione dei radicali liberi, danno origine a unità di p-idrossifenile, guaiacil e sinapyl che alla fine costituiscono ampiamente la lignina (Figura 1) 12. La mancanza di una struttura primaria nelle lignine implica una difficoltà intrinseca per la sua caratterizzazione strutturale. Di conseguenza, la valutazione della distribuzione del peso molecolare è sempre stata alquanto controversa. La lignina di legno fresata, la lignina isolata in condizioni miti che si avvicinano per lo più alla protolignina10,è composta da oligomeri13 che interagiscono altamente attraverso processi di aggregazione supramolecolare14,15.

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Figura 1: Modello rappresentativo di lignina di legno tenero in cui sono evidenziati i diversi tipi di obbligazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le lignine sono comunemente classificate in base a: a) al tipo di legno da cui derivano (ad esempio, legno duro e legno tenero), (b) al processo utilizzato per isolarlo. I tipi di lignina industriale più cruciali sono Kraft, Lignosulfonates e Organosolv.

La struttura della lignina dipende fortemente dalla sua origine e dalla chimica di lavorazione. Più specificamente, quando la struttura piuttosto complessa e irregolare della lignina è aggravata dalla sua diversità naturale e dalle complesse sostanze chimiche di lavorazione, emerge un materiale di estrema variabilità, diversità ed eterogeneità, limitandone l'uso ad applicazioni di basso valore16. Mentre le lignine di legno tenero contengono principalmente unità guaiaciliche (G) con quantità trascurabili di gruppi p-idrossifenilici (G lignina), le lignine di legno duro sono composte da subunità guaiacil e siringil (GS lignina) in rapporti variabili e le lignine di erba sono costituite da subunità guaiacil, siringil e p-idrossifenile(GSH lignina). L'approccio estrattivo utilizzato per l'isolamento influisce drammaticamente sulla struttura della ligninaemergente 17. La Figura 2 raffigura tre strutture di lignina, che differiscono per l'approccio di isolamento impiegato. Alcune considerazioni riguardanti l'effetto del metodo di estrazione potrebbero essere evidenziate. In primo luogo, la lignina di Kraft è una lignina dealchilata, altamente frammentata e condensata, mentre la lignina Organosolv ha una struttura simile alla lignina di legno fresata (isolata usando l'approccio di Bjorkman)18,19,20. Infine, i lignosolfonati sono caratterizzati da un alto grado di solfonazione, a seconda dell'intensità e delle condizioni del processo di solfonazione estrattiva.

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Figura 2: Strutture rappresentative per le lignine tecniche. In questa figura, si possono vedere le differenze tra i diversi tipi di lignina. (A) La lignina Kraft di legno tenero è altamente condensata, (B) i lignosolfonati sono caratterizzati da gruppi solfonici su carboni saturi e (C) organosolv lignina ha una struttura simile a quella della lignina di legno macinato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Simile alle lignine, i tannini sono composti polifenolici che si trovano nelle piante. Una recente e aggiornata revisione sugli approcci e le applicazioni estrattive dei tannini è stata recentemente rilasciata da Das et al.21. L'importanza dei tannini nella vita di tutti i giorni può essere evidenziata considerando due esempi: conferiscono gusto e colore ai vini22; inoltre la loro struttura polifenolica offre caratteristiche antiossidanti e li rende ideali per l'applicazione nell'industria conciaria23. I tannini sono divisi in due classi: idrolizzabile e non idrolizzabile. I tannini idrolizzabili possono essere considerati un polimero di esteri dell'acido gallico, di-gallico ed ellagico (Figura 3). Questi esteri derivano dall'esterificazione degli acidi fenolici con molecole di zucchero (ad esempio, glucosio, rhamnosio e arabinosio).

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Figura 3: Tannini idrolizzabili tipici: acido tannico, vescalgin. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I tannini non idrolizzabili, noti anche come tannini condensati, sono polimeri e oligomeri derivanti da flavan-3-oli. Tra i flavan-3-ols, catechine e gallocatechina sono i più frequenti. Sono composti cristallini incolori (Figura 4). La polimerizzazione crea un polimero caratterizzato da una struttura elicoidale. I gruppi idrossianici aromatici sono diretti all'esterno dell'elica, mentre gli ossigeni piranici sono all'interno.

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Figura 4: Strutture di proantocianidina: R =H, OH, OCH3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Caratterizzazione di lignine e tannini mediante RMN
Due tipi di informazioni sono cruciali nella caratterizzazione della lignina o del tannino: (a) struttura chimica (ad esempio, contenuto del gruppo idrossi, natura e frequenza dei collegamenti interunitivi) e (b) peso molecolare e polidispersità. Fin dai primi studi sulla lignina, sono state impiegate diverse tecniche per raggiungere questi obiettivi e sono emerse due classi di metodi: metodi chimici e fisici.

Nella chimica della lignina, i metodi chimici, come l'ossidazione del nitrobenzene alcalino, la derivatizzazione seguita da scissione riduttiva, l'ossidazione del permanganato e la tioacidolisi, sono stati storicamente ampiamente utilizzati24,25,26,27,28,29. Tuttavia, anche se i protocolli analitici sono stati implementati e ottimizzati, sono impegnativi in termini di tempo, laboriosi e richiedono ampie capacità sperimentali30. In alternativa, fin dall'inizio dell'analisi strumentale, sono stati utilizzati metodi fisici per eseguire caratterizzazioni di lignina e tannino31. Queste tecniche permettono di superare i problemi dei metodi classici rendendo facile caratterizzare la struttura della lignina.

La Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) permette di ottenere informazioni sulla struttura della lignina e sulla composizione chimica tra le tecniche strumentali. In particolare, i dati provenienti dagli spettri quantitativi monodimensionali 1H NMR e dagli spettri quantitativi 13C NMR possono fornire informazioni su diversi tipi di legami interuniali di lignina32,33,34,35. Sfortunatamente, gli spettri monodimensionali soffrono di sovrapposizione del segnale, che può seriamente minare gli sforzi di integrazione del segnale. Versioni quantitative di HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), Q-HSQC (Quantitative - Heteronuclear Single Quantum Coherence), sono state utilizzate per comprendere meglio la struttura della lignina, fornendo informazioni utili sui collegamenti interni. Tuttavia, non possono essere pienamente utilizzati per determinare quantitativamente le varie unità di edifici13, 36,37.

Per superare i problemi associati alla NMR mono e bidimensionale, è stata presa in considerazione la derivatizzazione del substrato. Tra i vantaggi di questo approccio c'è che etichette specifiche possono essere introdotte all'interno della macromolecola complessa e nessuna interferenza spettrale risulta dal solvente in cui i substrati marcati sono disciolti1. Verkade è stato il pioniere in questo campo, eseguendo analisi NMR 31P di derivati del fosforo, derivati del carbone e composti correlati38. Nella sua pubblicazione, è stato eseguito uno screening di diversi reagenti contenenti fosforo (fosfoloni) ed è stato registrato lo spostamento chimico di altri composti etichettati. Il team di Argyropoulos ha introdotto per la prima volta la derivatizzazione per l'analisi quantitativa e qualitativa dei gruppi idrossi nella lignina nel 1991. Dopo aver studiato la derivatizzazione di composti modello di lignina utilizzando reagenti contenenti fosforo, il suo gruppo ha aperto la strada a una delle tecniche più utilizzate quotidianamente nella chimica della lignina, l'analisi NMR 31P39,40,41,42,43. Tra i diversi fosfoloni esaminati, Argyropoulos è arrivato all'uso del 2-cloro-4,4,5,5-tetrametil-1,3-2-diossafosfolano (TMDP) come il più adatto per eseguire l'analisi della lignina44. TMDP reagisce selettivamente con i gruppi idrossi causando la formazione quantitativa di derivati contenenti fosforo caratterizzati da specifici spostamenti chimici NMR 31P (Figura 5).

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Figura 5: Chimica della lignina e della fosfitilazione del tannino. L'etichettatura dei gruppi H labile di lignina e tannino è realizzata mediante reazione in situ. I polifenoli etichettati sono caratterizzati da specifiche bande NMR 31P corrispondenti al diverso tipo di gruppi idrossi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La derivatizzazione del campione viene eseguita in una miscela piridina/cloroformio (1,6:1); questa scelta risulta da un'accurata valutazione. La piridina ha due vantaggi. In primo luogo, la selezione di un solvente caratterizzato da un parametro di Hildebrand di circa 22,1 MPa1/2 semplifica e amplifica la solubilizzazione della lignina45. Di conseguenza, l'aggiunta di piridina come solvente, il cui parametro di Hildebrand è pari a 21,7, è quindi ottimale. In secondo luogo, la reazione di TMDP con gruppi idrossi è accompagnata dalla formazione di acido cloridrico (HCl) come sottoprodotto con concomitanti implicazioni negative verso la facile formazione di derivati lignina-fosfolano. Per questo motivo, l'HCl risultante deve essere neutralizzato. Quando presente in eccesso significativo, la basicità della piridina, rispetto al TMDP, consente la neutralizzazione dell'HCl (attraverso la formazione di piridina cloridrato).

L'uso del sistema binario di solvente piridina/cloroformio deuterato raccomandato si basa su tre motivi. In primo luogo, favorisce la dissoluzione del campione. In secondo luogo, poiché la piridina cloridrato è solubile in cloroformio, può prevenire la precipitazione e il deterioramento dello spettro finale. In terzo luogo, il cloroformio deuterato viene scelto per il suo unico segnale singoletto, consentendo il blocco dello spettrometro NMR durante il processo di acquisizione. La derivatizzazione del campione viene eseguita in presenza di uno standard interno. In questo modo, quando il campione e lo standard sono derivati, il confronto degli integrali dei picchi del campione e dello standard consente la quantificazione della quantità per ogni tipo di gruppo idrossi presente. Vari composti sono stati considerati come standard interni. Questi composti sono caratterizzati da un singolo gruppo idrossilico per molecola, offrendo un singolo segnale acuto nello spettro NMR 31P dopo la derivatizzazione. La selezione dello standard deve essere effettuata con attenzione. Il suo segnale non deve sovrapporsi a quelli del campione derivato. Il colesterolo era ampiamente usato durante i primi giorni. Tuttavia, una parziale sovrapposizione con i segnali derivanti dal gruppo idrossi alifatico ne limita l'uso. Per l'analisi di routine, sono preferite soluzioni standard interne di N-idrossi-5-norbornene-2,3-dicarbossimide (NHND). Tuttavia, a causa dell'instabilità di NHND, le sue soluzioni standard possono essere conservate solo per pochi giorni46.

Protocollo

Il seguente diagramma di flusso (Figura 6) delinea l'intero protocollo sperimentale per eseguire un'analisi NMR 31P di lignine e tannini.

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Figura 6: Procedura per l'analisi NMR 31P di lignine e tannini. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

1. Pretrattamento del campione

  1. Asciugare un'aliquota (circa 100 mg) dell'analita (campione di lignina o tannino) durante la notte in un forno sottovuoto impostato a 40 °C.
    NOTA: Particolare attenzione è necessaria per la selezione della temperatura poiché temperature superiori a 40 °C possono alterare chimicamente la struttura sensibile dei polifenoli esaminati.
  2. Dopo l'essiccazione, trasferire rapidamente il campione in un essiccatore di solfato di calcio anidro fino a raggiungere la temperatura ambiente. Questo passaggio è obbligatorio per evitare che il campione assorba umidità dall'ambiente.

2. Preparazione della soluzione solvente

  1. Preparare una miscela di piridina/solvente cloroformio deuterato in un flaconcino campione da 20 ml mescolando piridina anidra e cloroformio deuterato in un rapporto di 1,6/1 (v/v).
    ATTENZIONE: Prestare attenzione durante la manipolazione della piridina e del cloroformio deuterato. Questi composti sono infiammabili, nocivi e tossici. Preparare e utilizzare la soluzione in una cappa aspirante ben ventilata utilizzando guanti appropriati.
  2. Aggiungere 5-8 g di setacci molecolari 5A attivati ben lavati e asciugati in pellet da 3,2 mm per rimuovere le tracce d'acqua. Inoltre, l'uso di un cappuccio del setto è altamente raccomandato per prevenire il contatto con l'aria e la contaminazione da umidità del sistema a solvente. Conservare la soluzione preparata al buio.

3. Preparazione della soluzione standard interna (IS)

  1. In un matraccio Erlenmeyer da 2 mL, preparare una soluzione da 0,1 M di cromo (III) acetilacetonato (circa 10 mg) e standard interno (circa 35,8 mg di NHND o 77,3 mg di colesterolo) nella soluzione solvente precedentemente preparata.
    ATTENZIONE: il cromo (III) acetilacetonato è dannoso; durante la sua manipolazione, indossare guanti appropriati.
  2. Registrare il peso esatto dell'IS aggiunto nella soluzione IS.
  3. Trasferire la soluzione di IS in un flaconcino dotato di un cappuccio sigillato contenente setacci molecolari attivati (vedere punto 2.2) e conservarla al buio a 40 °C.

4. Preparazione della soluzione campione NMR

  1. Pesare accuratamente ~ 30 mg di campione in un flaconcino da 2 ml dotato di una barra di agitazione. Sigillare il flaconcino con un tappo del setto.
  2. Aggiungere 0,5 mL della soluzione del sistema solvente al flaconcino del campione.
  3. Trasferire 100 μL della soluzione IS nel flaconcino del campione tramite una micropipetta. Mescolare magneticamente la dispersione risultante (500 giri/min) fino a quando tutta la lignina o il tannino si dissolve, risultando in una soluzione chiara.
    NOTA: poiché la solubilizzazione completa del campione è imperativa, questo passaggio potrebbe richiedere fino a 12 ore.
  4. Trasferire 0,1 mL di TMDP alla soluzione campione. Porre il campione sotto vigorosa agitazione magnetica. Tenere sigillata la soluzione campione. Utilizzare TMDP in un cappuccio dei fumi ben ventilato indossando guanti appropriati.
    ATTENZIONE: TMDP e i suoi vapori sono corrosivi, dannosi e interagiscono rapidamente con l'acqua.
    NOTA: La formazione di un precipitato giallo è dovuta a tracce d'acqua nel campione o nella soluzione di piridina/cloroformio. In tal caso, la procedura deve essere ripetuta assicurando che venga evitata tutta la possibile contaminazione da umidità.
  5. Trasferire la soluzione campione in un tubo NMR utilizzando una pipetta Pasteur.

5. Analisi NMR

  1. Caricare il tubo nello strumento NMR. Lo spettrometro utilizzato per eseguire questa analisi ha bisogno di una sonda a banda larga.
  2. Fissare i parametri sperimentali in base all'impostazione mostrata nella Tabella 11.
PROGRAMMA PULSEImpulso di disaccoppiamento gated inverso (zgig)
NUCLEOSO31P
LARGHEZZA SPETTRALE100 p.p.m.
TEMPO DI ACQUISIZIONE- 0,8 s
RITARDO RILASSAMENTO≥ 10 s
NUMERO DI SCANSIONI64 o più
CENTRO SPETTRO140 p.p.m.

Tabella 1: Parametri sperimentali per registrare spettri NMR 31P di lignine o tannini derivatizzati.

  1. Impostare la frequenza dello spettrometro utilizzando la frequenza di risonanza del cloroformio deuterato, shim il campione e sintonizzare lo spettrometro. Quindi, avviare l'acquisizione.

6. Elaborazione e analisi dello spettro

  1. Elaborare i dati grezzi 31P NMR da un software standard appropriato secondo i seguenti passaggi.
    1. Eseguire la trasformazione di Fourier.
    2. Regolazione della fase mediante correzione di fase manuale (Processing | correzione di fase | Correzione manuale).
    3. Correggere manualmente la linea di base, impostando attentamente i punti zero (Elaborazione | | di riferimento Correzione della linea di base multipunto).
  2. Calibrazione del segnale.
    1. Impostare il segnale per l'acqua fosfolilata al valore di spostamento chimico di 132,2 ppm (Analysis | | di riferimento Riferimento).
      NOTA: La presenza di un segnale 31P nitido a 175 ppm è dovuta all'eccesso di TMDP. La sua presenza garantisce la completa derivatizzazione del campione. Se questo picco è assente, è necessario rivedere l'intera procedura fornendo un campione approfondito e l'essiccazione con solvente e aggiungendo più TMDP. Una volta garantito questo, lo spettro viene ingrandito nell'intervallo spettrale da 132 a circa 150 ppm (Figura 7).

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Figura 7: Controllare la presenza di un eccesso di TMDP: se si può vedere, la derivatizzazione del campione è completa. Gli spettri possono quindi essere analizzati. Per fare ciò ingrandire l'intervallo spettrale tra 155 e 132 ppm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Integrazione
    1. Normalizza l'integrazione impostando lo standard interno su 1.0 (clicca sul Peak | Modifica | integrale Normalizzato: 1,00). Eseguire l'integrazione dello spettro in base ai cambiamenti chimici riportati nelle tabelle seguenti. Utilizzare la Tabella 2 per le lignine e la Tabella 3 per i tannini.
GRUPPO FUNZIONALESPOSTAMENTO CHIMICO (ppm)
OH alifatico149.0-146.0
OH fenolico144.0-137.4
C5 ha sostituito l'OH fenolico143.0-140.2
5-5' OH fenolico141.7-140.2
Siringile OH143.2-142.7
4-O-5' OH142.8-141.7
Guaiacile OH140.2-138.8
p-idrossifenil OH138.8-137.4
COOH ·136.0-133.6
Tricin ·137.0-136.0

Tabella 2: 31P NmR cambiamenti chimici per i gruppi OH fosfolilati di lignina.

GRUPPO FUNZIONALESPOSTAMENTO CHIMICO (ppm)
Anello A
o-fenolico non sostituito137.9–137.4
o-fenolico sostituito138.8–137.9
Anello B
Catecolo OH140.2–138.8
Pirogallolo OH144.0–140.2
Anello C
AliphatiC OH146.0–145.0

Tabella 3: 31P Spostamento chimico NMR per gruppi OH fosfolilati tanninici.

NOTA: Utilizzando un software standard di elaborazione spettrale, è possibile impostare regioni predefinite dello spostamento chimico da integrare. Questa opportunità è vantaggiosa quando devono essere elaborati diversi spettri.

7. Quantificazione dei gruppi funzionali

  1. Calcolare la concentrazione della soluzione IS.
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  2. Calcola la quantità equivalente del segnale specifico:
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    figure-protocol-5

Risultati

Il protocollo descritto può essere applicato sia per l'analisi delle lignine che dei tannini. In chimica della lignina, questo metodo è fondamentale perché consente la rilevazione e la quantificazione dei diversi tipi di gruppi idrossi. La Figura 8A-D mostra esempi di spettri NMR 31P di lignine e tannini acquisiti con spettrometri che lavorano a frequenze diverse. Lo spettro mostrato nella Figura 8A è stato registrato utilizzando uno spettrometro NMR a 300 MHz, mentre la Figura 8D è stata registrata con uno strumento NMR a 700 MHz.

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Figura 8: Spettro NMR quantitativo 31P di (A) lignina kraft di confiero (spettro registrato con uno spettrometro a 300 MHz su 30,8 mg di lignina), (B) acido lignosolfonico di contrimo (spettro registrato con uno spettrometro a 300 MHz su 30,1 mg di lignina dopo conservazione del lignosolfonato in acido lignosolfonico), (C) tannino di acacia (spettro registrato con uno spettrometro a 300 MHz su un campione da 30,3 mg) e (D) lignina kraft di legno tenero (spettro registrato con uno spettrometro a 700 MHz su 7,2 mg di lignina). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questi spettri sono stati accuratamente registrati ed elaborati manualmente. I segnali tipici per i gruppi idrossi alifatici (150-145 ppm), aromatici (145-137 ppm) e carbossilici (136-134 ppm) sono molto ben risolti e come tali facilmente integrati. Se la finestra spettrale viene aperta (da 95 a 190 ppm, Figura 8), sono evidenti tre picchi forti e nitidi (175, 144 e 132 ppm). Questi sono dovuti all'eccesso di TMDP, lo standard interno (colesterolo o NHND) e l'idrossilato-TMDP (causato da tracce d'acqua), rispettivamente.

A differenza di kraft e organosolv lignina, i lignosolfonati sono insolubili nella miscela piridina/cloroformio. Per ottenere uno spettro NMR affidabile di 31P, la solubilità è obbligatoria. Per superare questo problema, i lignosolfonati possono essere convertiti nei corrispondenti acidi lignosolfonici prima della derivatizzazione. Il trattamento di soluzioni di lignosolfonato con acidi forti (cioè acido solforico) o resine a scambio acido (ad esempio, Dowex 1H, un forte scambiatore di cationi acidi) guida la conversione di tutti i gruppi solfonati nelle loro forme acide. I prodotti risultanti possono essere rimossi dalla soluzione acida utilizzando resine adsorbenti selettive (XAD-7, un adsorbente polare utilizzato per isolare composti caratterizzati da pesi molecolari fino a 60.000 u.m.a) analizzati utilizzando questo protocollo. La Figura 8B mostra lo spettro NMR quantitativo di 31P di un acido lignosolfonico derivato da TMDP. Anche in questo caso, i diversi segnali dei gruppi idrossi sono evidenti. La Figura 8C mostra un tipico spettro NMR quantitativo di 31P di un campione di tannino derivato utilizzando TMDP. Un segnale caratteristico proveniente dalle diverse unità alifatiche OH (Anello C), pirogallolo e catecolo nell'anello B e unità nell'anello A sono ben visibili.

Discussione

Il metodo descritto rappresenta l'implementazione e l'ottimizzazione del protocollo analitico finalizzato alla caratterizzazione qualitativa e quantitativa delle lignine come sviluppato da Argyropoulos37,38,39,40,41,42. Rispetto a molte altre tecniche disponibili per la delucidazione strutturale della lignina, il metodo è stato ampiamente accettato come tra i più facili, rapidi e riproducibili. La validità dei metodi chimici umidi (es. nitrobenzene, ossidazioni permanganate, ecc.) si basa sulle buone capacità sperimentali dell'operatore, limitando di fatto il metodo ad operatori limitati. Inoltre, non è raro incontrare fattori di correzione in letteratura per i metodi chimici umidi per spiegare diversi inconvenienti. Il protocollo NMR 31P descritto non richiede competenze sperimentali avanzate che lo rendono facilmente applicabile, facile da usare e ampiamente disponibile. Rispetto ad altri metodi analitici strumentali, 31P NMR è l'unica tecnica in grado di rilevare e quantificare con precisione i diversi gruppi idrossi nelle lignine. Ad esempio, FTIR può essere utilizzato per identificare vari gruppi idrossilici come 1H NMR. Entrambe le tecniche, tuttavia, soffrono poiché non possono offrire dati quantitativi affidabili a causa di ampi problemi di sovrapposizione del segnale. Un'altra tecnica ampiamente utilizzata è la spettroscopia UV-Vis, riportata per la prima volta da Goldschmid. L'approccio, tuttavia, è limitato a una determinazione generale complessiva dei gruppi idrossi poiché non può differenziare efficacemente tra OHs47alifatici, aromatici e carbossilici.

Da un punto di vista economico, l'unico limite della tecnica NMR 31P è il prezzo di TMDP, che è un reagente relativamente costoso. Costa circa 190 USD al grammo; di conseguenza, se il costo dell'analisi fosse approssimato solo al prezzo del TMDP, escludendo quelli derivanti dalla miscela piridina/cloroformio e quelli del tempo dell'operatore, am amerebbe a circa 24 USD per analisi. Per risolvere questo problema, molti laboratori ricorrono alla sintesi di TMDP, riducendo così i costi del reagente. Per fare questo, pinacolo e tricloruro di fosforo vengono reagiti in presenza di trietilammina44. Tecnicamente, questa reazione è relativamente facile; tuttavia, è necessaria attenzione nell'uso del tricloruro di fosforo e nel suo work-up, compresa la distillazione sottovuoto ben controllata. Maggiori dettagli sulla sintesi del TMDP possono essere forniti su richiesta.

Anche se questo protocollo è tra i migliori in termini di facilità, riproducibilità e precisione, alcuni punti critici devono essere evidenziati. In primo luogo, il campione deve essere completamente solubile nella miscela piridina/cloroformio identificata. Questa considerazione è fondamentale perché la reazione quantitativa di fosfolilazione dei gruppi ossidrilici deve avvenire in condizioni completamente omogenee. Se solo una parte del campione viene solubilizzata, l'analisi risultante sarebbe imprecisa. In secondo luogo, il campione da esaminare deve essere privo di umidità e solventi poiché queste variabili influenzeranno negativamente la precisione e il successo complessivo dell'analisi. Tracce di umidità reagiranno con TMDP dando 2-idrossi-4,4'-5,5'-tetrametil-1,3,2-diossafosfolano. Questo composto è un sale flocculante giallo pallido, insolubile nella miscela solvente piridina/cloroformio, che causa un'inadeguata acquisizione del segnale NMR. Poiché è richiesto solo un piccolo peso (~ 30 mg) di un campione, deve essere privo di sostanze volatili affinché il suo peso preciso sia conosciuto con precisione prima dell'analisi.

A volte, i problemi di solvatazione del campione possono essere promossi (specialmente per i campioni altamente ossidati) aggiungendo piccole quantità di un co-solvente (cioè dimetilformammide), aiutando la dissoluzione del campione. In linea di principio, ogni solvente che non interagisce con TMDP può essere utilizzato per aiutare la dissoluzione del campione. L'elezione di un co-solvente non può includere co-solventi contenenti idrossi labile o gruppi amminici poiché reagiscono con il reagente, causando spettri finali fuorvianti. In particolare, il dimetilsolfossido reagisce anche con TMDP precludendone l'uso come co-solvente. I liquidi ionici a base di piridina, come il cloruro di 1-allil-3-butilpiridinio, possono essere utilizzati quando sorgono problemi di solubilità; tuttavia, il liquido ionico dovrebbe essere ancora una volta asciutto48. Per sciogliere i lignosolfonati (un tipo di lignina caratterizzato da un alto grado di solfonazione), si è dimostrato utile un pretrattamento che comporta la conversione di gruppi neutralizzati nella loro forma acida. I lignosolfonati possono essere convenientemente convertiti nelle loro condizioni acide utilizzando resine a scambio acido in mezzi acquosi. Gli acidi lignosolfonici risultanti sono isolati dalla soluzione mediante il loro adsorbimento su resine specifiche (ad esempio, XAD-7) e il desorbimento in etanolo. L'evaporazione delle soluzioni etanoliche a pressione ridotta a 40 °C consente l'isolamento degli acidi lignosolfonici. Queste lignine possono quindi essere caratterizzate da 31P NMR perché sono solubili nella miscela piridina/cloroformio proposta dal protocollo.

L'essiccazione sottovuoto prolungata a temperature miti riduce efficacemente la quantità di umidità e altre sostanze volatili in ciascun campione. In particolare, piccole quantità di acqua non influenzano lo spettro finale perché TMDP viene aggiunto in eccesso. Inoltre, in alcuni casi, una piccola quantità di 2-idrossi-4,4'-5,5'-tetrametil-1,3,2-diossafosfolano può derivare dall'umidità presente nella provetta NMR o nella fiala del campione. In questi casi, l'agitazione è sufficiente per sciogliere completamente la quantità del precipitato formato. Se si forma una quantità elevata di 2-idrossi-4,4'-5,5'-tetrametil-1,3,2-diossafosfolano, si consiglia di ripetere la preparazione del campione, migliorando il trattamento di essiccazione. Ad esempio, prima dell'uso, tutti gli oggetti in vetro possono essere brevemente riscaldati con una pistola termica.

L'intervallo spettrale utilizzato per registrare lo spettro è ampio rispetto alla regione di interesse per il segnale per quanto riguarda i diversi gruppi ossidrilici. Tuttavia, questo è obbligatorio per capire se la derivatizzazione del campione si è verificata correttamente. La conferma della derivatizzazione completa del campione è data dalla presenza di un segnale forte intorno a 174 ppm. Questo picco acuto è dovuto al TMDP non avuto astanza e la sua esistenza assicura che il reagente fosse presente in eccesso e, pertanto, tutti i gruppi ossidrilici sono stati derivatizzati. Se questo picco è assente, le due cause più probabili sono: (1) la quantità di TMDP utilizzata è insufficiente per eseguire la completa derivatizzazione del campione, o (2) un'elevata quantità di acqua è presente nel campione. Nel primo caso, l'utilizzo di una quantità maggiore di TMDP garantirebbe probabilmente la completa derivatizzazione del campione e apparirà il segnale a 174 ppm. Nel secondo caso, il campione deve essere asciugato più ampiamente. Una volta assicurato un eccesso di TMDP, è possibile eseguire un'integrazione di picco. Prima di questa operazione, zoomare su una finestra più stretta (da 150 a 132 ppm) che confina i segnali di interesse.

La quantità di campione (~30 mg) da analizzare, riportata nel protocollo sperimentale di cui sopra, è stata selezionata per raccogliere spettri di buona qualità per uno spettrometro NMR a 300 MHz o più. Tuttavia, abbiamo osservato che è possibile ridurre la quantità del campione se si utilizza un magnete di campo a 500 MHz o superiore. Ad esempio, nella Figura 8D, viene mostrato lo spettro NMR (risultante da uno strumento a 700 MHz) di un campione preparato con 7,2 mg di lignina. L'integrazione del segnale di questo spettro offre gli stessi risultati di quelli ottenuti quando si utilizzano quantità più elevate di lignina. Questo fatto amplifica l'applicabilità di questo protocollo per tutte le ricerche in cui sono disponibili piccole quantità di prodotti.

Nel complesso, questo protocollo sperimentale può essere applicato a molte applicazioni di ricerca e sviluppo quando è richiesta la comprensione dell'origine e del destino dei vari gruppi idrossi presenti nelle lignine e nei tannini. In particolare, se abbinati a dati GPC e HSQC, i dati risultanti offrono l'opportunità di elaborare e speculare ulteriormente sulla struttura della lignina o di un tannino. In molti casi in cui le modifiche chimiche vengono applicate ai gruppi idrossilici della lignina o di un tannino, le analisi quantitative 31P NMR possono essere estremamente preziose per rilevare se queste modifiche si sono verificate e in quale misura. Ad esempio, la Figura 9 mostra due spettri NMR della stessa lignina prima e dopo la sua ossidazione. Una semplice valutazione qualitativa mostra la riduzione dei gruppi idrossi sia alifatici che aromatici dopo l'ossidazione, fornendo così preziose informazioni e indicazioni.

figure-discussion-1
Figura 9: Spettri NMR quantitativi 31Pdella stessa lignina Organosolv derivata utilizzando TMDP (A) Prior e (B) post sua ossidazione. Gli spettri sono stati registrati utilizzando uno spettrometro 300 NMR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In conclusione, questa tecnica ha tutti gli attributi di essere tra gli strumenti più essenziali e potenti quando le indagini che si occupano di polifenoliche, lignine contenenti OH e tannini (e persino polimeri sintetici)49,50,51 devono essere fatte in una varietà di campi, che vanno dalla chimica all'ingegneria, dalla biologia al polimero e alle applicazioni farmaceutiche.

Dichiarazioni

Claudia Crestini e Dimitris S Argyropoulos assicurano che tutti gli autori (C.C., N.P. e D.S.A.) non abbiano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro nel corso degli anni è stato supportato da vari premi finanziari che includevano organizzazioni come il Pulp and Paper Research Institute of Canada, la McGill University Montreal, il Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, la National Science Foundation USA, il Dipartimento dell'agricoltura degli Stati Uniti e la società Solvay.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
100 - 1000 & micro; l. Micropipetta EppendorfVWR613-0866
20 - 200 &; l. Micropipetta EppendorfVWR613-0865
2-cloro-4,4,5,5-tetrametil-1,3-2-diossafosforano, 95%Sigma-Aldrich447536
Bilancia analitica (sensibilità ± 0,1 mg)PrecisaLX220 A
Binder Vacuum OvenBinderVD53
Certified Vial Kit, basso adsorbimento (LA), 2 mL, confezione da 100Sigma-Aldrich29651-U
Cloroformio-dSigma-Aldrich151823
Sigma-AldrichC8667di grado Sigma
, 4ASigma-Aldrich208604
N-idrossi-5-norbornene-2,3-dicarbossimide, 97%Spettrometro NMR Sigma-Aldrich226378
300 MHzBruker
Norell  quarzo naturale 3 mm tubi NMRSigma-AldrichNORS33007
Puntali per pipette, 100-1000 & micro; L UltraFine (blu)VWR613-0342
Puntali per pipette, 20-200 &; L Punto di smusso (giallo)VWR613-0239
Piridina, anidra, 99,8%Sigma-Aldrich270970
Barre di agitazione, micro, lunghezza 3 mmVWR442-0360
Barre di agitazione, micro, lunghezza 6 mmVWR442-0362
Ossido di trifenilfospina, 97%Sigma-AldrichT84603
Fiale per analisi ambientali, WHEATON,  20,00 mLDWK Life SciencesWHEAW224609
Carta per pesare, grado 531VWR516-0318P
colesterolo, Setacci molecolari ,

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