Articolo metodologico

Impianto tridimensionale di scaffold a matrice di collagene come strategia di rigenerazione epatica

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DOI:

10.3791/62697

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29 giugno 2021

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1Liver, Pancreas and Motility Laboratory; Unit of Experimental Medicine; School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM), 2Department of Surgery, School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 3Department of Cells and Tissue Biology, School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 4Department of Pathology, Hospital General de Mexico, 5Materials Research Institute, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

In questo articolo

Sommario

Le malattie del fegato sono indotte da molte cause che promuovono la fibrosi o la cirrosi. Il trapianto è l'unica opzione per recuperare la salute. Tuttavia, data la scarsità di organi trapiantabili, è necessario esplorare alternative. La nostra ricerca propone l'impianto di scaffold di collagene nel tessuto epatico da un modello animale.

Abstract

Le malattie del fegato sono la principale causa di morte in tutto il mondo. Il consumo eccessivo di alcol, una dieta ricca di grassi e l'infezione da virus dell'epatite C promuovono la fibrosi, la cirrosi e / o il carcinoma epatocellulare. Il trapianto di fegato è la procedura clinicamente raccomandata per migliorare e prolungare la durata della vita dei pazienti nelle fasi avanzate della malattia. Tuttavia, solo il 10% dei trapianti ha successo, con disponibilità di organi, procedure prechirurgiche e postchirurgiche e costi elevati direttamente correlati a tale risultato. Gli scaffold a matrice extracellulare (ECM) sono emersi come alternativa per il ripristino dei tessuti. La biocompatibilità e l'accettazione dell'innesto sono le principali caratteristiche benefiche di tali biomateriali. Sebbene la capacità di ripristinare le dimensioni e la corretta funzione del fegato sia stata valutata in modelli di epatectomia epatica, l'uso di scaffold o di qualche tipo di supporto per sostituire il volume della massa epatica estirpata non è stato valutato.

L'epatectomia parziale è stata eseguita in un fegato di ratto con lo xenoimpianto di uno scaffold a matrice di collagene (CMS) da un condilo bovino. Il tessuto del lobo epatico sinistro è stato rimosso (circa il 40%) e una percentuale uguale di CMS è stata impiantata chirurgicamente. I test di funzionalità epatica sono stati valutati prima e dopo la procedura chirurgica. Dopo i giorni 3, 14 e 21, gli animali sono stati sottoposti a eutanasia e sono state eseguite valutazioni macroscopiche e istologiche. Nei giorni 3 e 14, il tessuto adiposo è stato osservato intorno al CMS, senza evidenza clinica di rigetto o infezione, così come la neoformazione dei vasi e il riassorbimento della CMS al giorno 21. C'erano prove istologiche di un processo infiammatorio insignificante e della migrazione delle cellule adiacenti al CMS, osservate con l'ematossilina e l'eosina (H & E) e la colorazione tricroma di Masson. Il CMS ha dimostrato di funzionare bene nel tessuto epatico e potrebbe essere un'alternativa utile per studiare la rigenerazione e la riparazione dei tessuti nelle malattie epatiche croniche.

Introduzione

Il fegato è uno degli organi più importanti coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi e della produzione di proteine1. Sfortunatamente, la malattia del fegato è la principale causa di morte in tutto il mondo. Nelle fasi avanzate del danno epatico, che includono cirrosi e carcinoma epatocellulare, il trapianto di fegato è la procedura clinicamente raccomandata. Tuttavia, a causa della scarsità di donatori e del basso tasso di trapianti di successo, sono state sviluppate nuove tecniche di ingegneria tissutale (TE) e medicina rigenerativa (RM)2,3.

TE prevede l'uso di cellule staminali, scaffold e fattori dicrescita 4 per promuovere il ripristino di organi e tessuti infiammati, fibrotici ed edematosi1,5,6. I biomateriali utilizzati negli scaffold imitano l'ECM nativo, fornendo i segnali fisici, chimici e biologici per il rimodellamento cellulare guidato7. Il collagene è una delle proteine più abbondanti ottenute dal derma, dal tendine, dall'intestino e dal pericardio8,9. Inoltre, il collagene può essere ottenuto come biopolimero per produrre scaffold bi- e tridimensionali attraverso bioprinting o elettrofilatura10,11. Questo gruppo è il primo a segnalare l'uso di collagene da una fonte ossea per la rigenerazione del tessuto epatico. Un altro studio riporta l'uso di scaffold sintetizzati dal collagene bovino, che è stato ottenuto dalla pelle, con pori omogenei e strettamente situati, senza alcuna comunicazione tra loro12.

La decellularizzazione preserva l'ECM nativo, permettendo la successiva incorporazione di cellule con potenziale di cellule staminali13,14. Tuttavia, questa procedura è ancora in fase sperimentale nel fegato, nel cuore, nei reni, nell'intestino tenue e nella vescica urinaria da topi, ratti, conigli, maiali, pecore, bovini e cavalli3,14. Attualmente, il volume di massa epatica resecato non viene sostituito in nessuno dei modelli di epatectomia animale. Tuttavia, l'uso di un supporto o di una rete aggiuntiva (biomateriali) che consente la proliferazione cellulare e l'angiogenesi potrebbe essere essenziale per il rapido ripristino delle funzioni parenchimali epatiche. Pertanto, gli scaffold potrebbero essere impiegati come approcci alternativi per rigenerare o riparare i tessuti nelle malattie epatiche croniche, a loro volta, eliminando le limitazioni dovute alla donazione e le complicanze cliniche del trapianto di fegato.

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Protocollo

La presente ricerca è stata approvata dal comitato etico della Scuola di Medicina (DI/115/2015) presso l'Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e dal comitato etico dell'Hospital General de Mexico (CI/314/15). L'istituzione soddisfa tutte le specifiche tecniche per la produzione, la cura e l'uso di animali da laboratorio ed è legalmente certificata dalla legge nazionale (NOM-062-ZOO-1999). Ratti Wistar maschi del peso di 150-250 g (6-8 settimane) sono stati ottenuti dalla Laboratory Animal Facility della School of Medicine, UNAM, per questo studio.

1. Ottenere scaffold a matrice di collagene dal femore bovino

  1. Ottenere il condiolo dal femore bovino da un macello certificato dalle autorità sanitarie e agricole del Messico.
    1. Sezionare attentamente il grasso del condiolo, il muscolo e la cartilagine con uno strumento chirurgico. Tagliare i frammenti del condilo in frammenti di 3 cm x3 cm usando un taglierino e pulire il grasso e il sangue con un asciugamano. Lavare i frammenti di condiolo con acqua.
    2. Far bollire (92 °C) i frammenti con 1 L di un detergente anionico (10 g/L) per 30 min. Lavare due volte i frammenti del condiolo per rimuovere eventuali residui del detergente anionico.
    3. Asciugare i frammenti di condilo per 3 ore utilizzando carta da filtro (0,5 mm).
  2. Preparare un CMS triangolare (1 cm x1 cm x1 cm) di spessore 0,5 cm dai frammenti menzionati al punto 1.1 (Figura 1A).
    1. Demineralizzare i frammenti in 100 mL di 0,5 M HCl per 10 min con agitazione costante. Rimuovere l'HCl.
      NOTA: Neutralizzare l'HCl con idrossido di sodio (10 M).
    2. Risciacquare i frammenti tre volte con 100 ml di acqua distillata, 15 minuti ogni volta, con agitazione costante. Asciugare il CMS con carta da filtro (0,5 mm) per 1 ora.
    3. Utilizzare uno stereomicroscopio15 per analizzare le proprietà strutturali del CMS (dimensione dei pori, formazione dei pori e interconnessione porosa) (Figura 1B).
    4. Utilizzare un microscopio elettronico a scansione16 per analizzare la superficie ruvida delle trabecole CMS (Figura 1C).
    5. Utilizzare lo strumento di dissezione per la miscelazione e lo stiramento per valutare i cambiamenti meccanici (plasticità e flessibilità) del CMS (Figura 1D).
    6. Imballare il CMS nella custodia di sterilizzazione e sterilizzarlo con plasma di perossido di idrogeno per 38 minuti. Conservare il CMS sterile nella confezione originale in una zona asciutta a 20-25 °C fino all'uso.

2. Preparazione dell'area chirurgica e manipolazione e preparazione del modello animale

  1. Disinfettare l'area chirurgica, il piano di lavoro, il microscopio microchirurgico e il sedile con una soluzione di clorexidina al 2%. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, spugne chirurgiche, tamponi e teli chirurgici monouso attraverso la sterilizzazione a caldo (121 °C/30 min/100 kPa)
  2. Assegnare i ratti (n = 5) in tre gruppi di cinque ratti per gruppo: 1. sham, 2. epatectomia e 3. epatectomia più CMS e seguire tutti i gruppi nei giorni 3, 14 e 21 giorni.
    1. Somministrare ketamina (35 mg/kg) e xilazina (2,5 mg/kg) per via intramuscolare nell'arto posteriore.
      NOTA: Il periodo sedativo dura in genere 30-40 minuti.
    2. Rasare la pelle addominale (5 cm x 2 cm) usando sapone chirurgico e una lama a doppio taglio e disinfettare la pelle con una soluzione topica di povidone-iodio al 10% in tre cicli17.
    3. Posizionare l'animale su una piastra calda in posizione dorsale decubito, con il collo iperesteso per mantenere una via aerea permeabile (Figura 2).
    4. Valutare la profondità dell'anestesia attraverso il pattern respiratorio e la perdita del riflesso di astinenza negli arti.
    5. Posizionare un drappo chirurgico monouso intorno alla pelle rasata e praticare un'incisione (2,5 cm) sulla linea degli albous con un bisturi, utilizzando il processo xifoide come punto di riferimento. Evitare il vaso sanguigno della parete addominale per prevenire il sanguinamento.
    6. Metti il divaricatore addominale in posizione e osserva la cavità addominale. Usando la pinica di dissezione, estrarre il lobo epatico sinistro e posizionarlo sulla piastra metallica (Figura 3A).
      NOTA: Nel gruppo fittizio, estrarre solo il lobo epatico sinistro e quindi restituire il fegato alla cavità addominale. Suturare la parete addominale e la pelle con una sutura di nylon 3-0.
    7. Nei gruppi sperimentali con e senza CMS, utilizzare una lama di bisturi e una lama di bisturi sterile (# 15) per eseguire l'epatectomia (circa il 40%) con due tagli. Utilizzare una smussata metallica triangolare (1 cm x 1 cm x 1 cm) per eseguire l'epatectomia (Figura 3B).
    8. Per prevenire il sanguinamento del fegato, mantenere la compressione chirurgica con un tampone sul bordo del fegato per 5 minuti.
    9. Idratare il CMS in soluzione salina sterile per 20 minuti prima della procedura chirurgica. Impiantare il CMS nel sito di epatectomia con quattro punti di sutura tra il tessuto epatico e il CMS per prevenire lo spostamento del biomateriale. Utilizzare suture di polipropilene non assorbibili 7-0 (Figura 3C).
      NOTA: Non rimuovere le suture in un secondo intervento chirurgico; le suture possono essere utilizzate come riferimento per identificare il sito di impianto del CMS.
    10. Riportare il fegato nella cavità addominale e suturare la parete addominale e la pelle con una sutura di nylon 3-0. Pulire l'incisione chirurgica con una spugna chirurgica imbevuta di iodio in due round. Osservare e monitorare i segni vitali degli animali.

3. Cura postoperatoria

  1. Somministrare meglumina flunixin (2,5 mg/kg) per via intramuscolare nell'arto posteriore. Somministrare analgesici come approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
  2. Per il recupero dell'anestesia, posizionare gli animali in singole scatole di policarbonato con lettiera per animali da laboratorio in un'area priva di rumore con controllo della temperatura (23 ° C).
  3. Osservare il recupero degli animali e monitorare il loro consumo di acqua e cibo per 2 ore. Monitorare gli animali post-operatoriamente come approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

4. Valutazione della funzionalità epatica nel siero

  1. Raccogliere campioni di sangue (500 μL) dalle vene laterali della coda degli animali anestetizzati prima della procedura chirurgica (valori basali) e nei giorni di valutazione 3, 14 e 21.
  2. Centrifugare i campioni di sangue a 850 × g/10 min a temperatura ambiente (23 °C); separare il siero e conservarlo a -80°C fino all'uso.
  3. Eseguire un pannello di test di funzionalità epatica: albumina sierica (ALB), fosfatasi alcalina (ALP), alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi (AST), bilirubina totale (TB) e bilirubina diretta (DB)(Tabella 1).

5. Eutanasia e gestione dei tessuti

  1. Anestetizzare gli animali per ogni valutazione (giorni 3, 14 e 21) seguendo il protocollo sopra descritto.
  2. Eutanasia tramite metodi approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
  3. Eseguire un'incisione (5-6 cm) sulla linea degli albous con un bisturi per osservare gli organi della cavità addominale e scattare fotografie dell'area di epatectomia del sham e dei gruppi sperimentali, con e senza cms.
  4. Prelevare campioni di fegato (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) da tutti gli animali del gruppo di studio e metterli in una soluzione di formaldeide al 4% per 24 ore per la successiva valutazione istologica.

6. Analisi istologica

  1. Preservare i tessuti epatici in formaldeide al 4% e disidratare il tessuto utilizzando una serie di concentrazioni alcoliche (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); metterli in xilene (1h) e incorporarli nella paraffina16.
  2. Tagliare i blocchi di paraffina con un microtomo in sezioni spesse 4 μm per la preparazione di otto diapositive.
  3. Eseguire la colorazione tricromatica di H&E e Masson16.
  4. Osservare le sezioni colorate al microscopio ottico per selezionare le aree rappresentative del fegato, con e senza CMS. Ottenere fotomicrografie con ingrandimento 4x, 10x e 40x ed elaborare le immagini utilizzando l'apposito software18 (vedere la Tabella dei Materiali).

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Risultati

La demineralizzazione ossea influisce sulle proprietà meccaniche del CMS senza alterare la forma originale o l'interconnessione dei suoi pori. CMS può avere qualsiasi forma e, quindi, può essere regolato in base alle dimensioni e alla forma dell'organo o del tessuto selezionato19. Nel presente protocollo, abbiamo utilizzato un CMS triangolare (Figura 1A-D). Un modello di ratto è stato utilizzato per valutare la capac...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Il trapianto di organi è il pilastro del trattamento nei pazienti con fibrosi epatica o cirrosi. Alcuni pazienti beneficiano di questa procedura, rendendo necessario fornire alternative terapeutiche per i pazienti in lista d'attesa. L'ingegneria tissutale è una strategia promettente che impiega scaffold e cellule con potenziale rigenerativo2,4,13. La rimozione di una porzione del fegato è un passo critico in questa procedura a c...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. Benjamín León-Mancilla è uno studente di dottorato del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e ha ricevuto la borsa di studio DGAPA-UNAM.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il personale della Laboratory Animal Facility dell'Unità di Medicina Sperimentale, l'infermiera Carolina Baños G. per il supporto tecnico e chirurgico, Marco E. Gudiño Z. per il supporto in microfotografia e Erick Apo per il supporto nell'istologia epatica. Il Consiglio Nazionale ha sostenuto questa ricerca per la Scienza e la Tecnologia(CONACyT),il numero di sovvenzione SALUD-2016-272579 e il PAPIIT-UNAM TA200515.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Detergente anionicoAlconoxZ273228
Cassette per biopsia Leica3802453
Fotocamera DMXNikonDXM1200F
CentrifugaEppendorf5424
Clorexidina gluconato 4%BD372412
Occhiali di copertura 25 mm x 40 mmCorning2980-224
EosinSigma-Aldrich200-MCAS 17372-87-1
Alcool etilico, puroSigma-Aldrich459836CAS 64-17-5
Flunixina meglumideMSDQ-0273-035
Vetrini 75 mm x 25 mmCorning101081022
EmatossilinaMerckH9627CAS 571-28-2
Acido cloridrico 37%Merck339253CAS 7647-01-0
KetaminaPisa agropecuariaQ-7833-028
Microscopio otticoNikonMicrophoto-FXA
Stereomicroscopio per microchirurgiaZeissOPMI F170
Microtainer mantello gialloBeckton Dickinson365967
MicrotomoLeicaRM2125
Modello animale: ratti WistarUniversidad Nacional Autó noma de Mé xico
Nylon 3-0 (Dermalon)Covidien1750-41
Polipropilene 7-0AtramatSE867/2-60
Povidone-iodio Soluzione cutanea al 10%Diafra SA de CV1.37E+86
Microscopio elettronico a scansioneZeissDSM-950
Idrossido di sodio, pelletJ. T. Baker3722-01CAS 1310-73-2
Software ACT-1NikonVer 2.70
StereomicroscopioLeicaEZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100SJohnson and Johnson99970
Surgipath paraplastLeica39601006
Synringe di 1 mL con ago (27G x 13 mm)SensiMedicalLAN-078-077
Elaboratore di tessuti ( LeicaTP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder)Sakura Finetek USA5229
Kit di colorazione tricromaticaSigma-AldrichHT15
Unicell DxC600 AnalyzerBeckman CoulterBC 200-10
XilazinaPisa agropecuariaQ-7833-099
XileneSigma-Aldrich534056CAS 1330-20-7

Riferimenti

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