Questo protocollo dimostra un nuovo metodo per applicare terapie geniche a sottopopolazioni di cellule in ratti neonatali in età postnatale 5-10 giorni iniettando un modificatore chemiogenetico anterogrado nella corteccia somatomotoria e una Cre ricombinasi retrogradamente trasportabile nel midollo spinale cervicale.
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Articolo metodologico
Targeting del tratto corticospinale nei ratti neonatali con un vettore doppio virale utilizzando la chirurgia combinata del cervello e della colonna vertebrale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Affrontare con successo gli ostacoli che limitano la ricerca sui ratti neonatali è importante per studiare le differenze nei risultati osservati nelle lesioni del midollo spinale pediatrico (SCI) rispetto alle SCI adulte. Inoltre, l'introduzione affidabile di terapie nelle cellule bersaglio del sistema nervoso centrale (SNC) può essere difficile e le imprecisioni possono compromettere l'efficacia dello studio o della terapia. Questo protocollo combina la tecnologia dei vettori virali con una nuova tecnica chirurgica per introdurre accuratamente le terapie geniche nei ratti neonatali al giorno 5 postnatale. Qui, un virus progettato per il trasporto retrogrado (retroAAV2) di Cre viene introdotto ai terminali assoni dei neuroni corticospinali nel midollo spinale, dove viene successivamente trasportato ai corpi cellulari. Un recettore designer a doppio floxed orientamento-invertito (DIO) attivato esclusivamente dal virus dei farmaci designer (DREADD) viene quindi iniettato nella corteccia somatomotoria del cervello. Questa tecnica di doppia infezione promuove l'espressione dei DREADD solo nei neuroni del tratto corticospinale co-infetti (CST). Pertanto, la co-iniezione simultanea della corteccia somatomotoria e dei terminali CST cervicali è un metodo valido per studiare la modulazione chemiogenetica del recupero seguendo modelli di SCI cervicale nei ratti neonatali.
Introduzione
Mentre la SCI è un evento relativamente raro nella popolazione pediatrica, è particolarmente traumatica e causa una disabilità permanente che richiede un'immensa lungimiranza logistica. Inoltre, una percentuale maggiore di SCI pediatrici è classificata come cervicale e completa rispetto alla popolazione adulta 1,2. Un segno distintivo tra le specie di mammiferi è che i neonati guariscono notevolmente meglio dalla SCI rispetto agli adulti, e questo offre l'opportunità di valutare i meccanismi trainanti per il recupero nelle popolazioni più giovani 3,4,5....
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Protocollo
Tutte le seguenti procedure chirurgiche e di cura degli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Temple University. Il protocollo descritto è un intervento chirurgico di sopravvivenza e gli animali sono stati infine eutanasizzati, mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di pentobarbital di sodio al completamento dei loro punti temporali.
1. Preparazione pre-chirurgica
- Preparare almeno due aghi di vetro tirati per l'iniezione virale utilizzando pipette capillari di vetro da 3,5 nL; un ago per il DREADD e un ago per il rCre. Come misura precauzionale, preparare 4-5 aghi nel caso in c....
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Risultati
Il successo dell'iniezione e del trasporto del vettore virale dovrebbe comportare la trasduzione dei neuroni unilaterali nel midollo spinale e nella corteccia motoria. La Figura 4 mostra l'etichettatura dei neuroni CST di strato V nella corteccia motoria di una sezione coronale cerebrale che esprime Cre-dipendente-DREADDs-mCherry co-iniettato con un'iniezione controlaterale della colonna vertebrale di rCre. Le sezioni erano colorate con l'anticorpo dsRed.
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Discussione
La modulazione genetica inducibile dell'attività cerebrale con modificatori chemiogenetici iniettabili è un potente strumento per studiare i vari meccanismi che sono alla base del recupero dalla SCI. L'accuratezza del targeting per i recettori inducibili accoppiati a proteine G (DREADD) è ulteriormente aumentata se si considera che il tracciamento della fluorescenza convalida la precisione anatomica in istologia. Questo articolo discute un metodo affidabile per esplorare se l'inibizione o la stimolazione di percorsi neur.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio di Shriners Hospitals for Children SHC-84706.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lame per bisturi #11 | Roboz | RS-9801-11 | Da utilizzare con il bisturi. |
| #10 Lame per bisturi | Roboz | RS-9801-10 | Da utilizzare con il bisturi. |
| Siringhe da 1 ml Becton | , Dickinson and Company | Per l'iniezione di anestesia SC e il bolo fluido | |
| Sutura in seta 4.0 | Ethicon | 771-683G | Per la chiusura della pelle |
| Sutura cromica in catgut 4.0 | DemeTECH | NN374-16 | Per rilegare il muscolo durante la chiusura. |
| 48000 Smussatrice per micropipette | World Precision Instruments | 32416 | Utilizzato per smussare le punte dei tubi capillari di vetro tirati per formare aghi di vetro funzionali. |
| Soluzione di iodio al 5% | Purdue Products L.P. | L01020-08 | Per l'uso nella sterilizzazione del sito chirurgico. |
| 70% Etanolo | N/A | N/A | Per la sterilizzazione di aghi di vetro appena preparati, modelli animali durante la preparazione chirurgica |
| Ketamina (Ketaset) | Zoetis | 240048 | Per mantenere l'animale nel corretto piano di coscienza durante l'intervento chirurgico. |
| Sterilizzatore di perline | CellPoint | 5-1450 | Per sterilizzare a caldo gli strumenti chirurgici. |
| Bilancia digitale | Okaus | REV.005 | Per pesare l'animale durante la preparazione chirurgica. |
| Attacco flessibile dell'ago | World Precision Instruments | MF34G-5 | Per la pulizia degli aghi di vetro e il caricamento di olio rosso negli aghi di vetro. |
| Tubi capillari in vetro | World Precision Instruments | 4878 | Per aghi in vetro tirati - dovrebbe essere progettato per iniettori di nanolitri. |
| Emostatici | Roboz | RS-7231 | Per uso generale in chirurgia. |
| Pinze curve a punta media | Roboz | RS-5136 | Per uso generale in chirurgia. |
| Micromanipolatore con scala a corsoio | Kanetec | N/A | Per un puntamento preciso durante l'intervento chirurgico. |
| Microforbici | Roboz | RS-5621 | Per tagliare i fili di vetro dai tubi capillari di vetro appena tirati. |
| Strumento stereotassico standard da laboratorio | Stoelting | 51600 | Per tenere in posizione il supporto sterotassico neonatale |
| da laboratorio con mouse e Adattatore per neonati | 51615 | Per la fissazione del cranio neonatale durante la chirurgia cranica e le | |
| Microscopio con luce e scala a corsoio Oculare | Leitz Wetzlar | N/A | Utilizzato per visualizzare e misurare la smussatura dei tubi capillari di vetro tirati in aghi di vetro funzionali. |
| Controller per pompe a microsiringa | World Precision Instruments | 62403 | Per controllare la velocità di iniezione. |
| Iniettore della testa della pompa Nanoliter 2000 | World Precision Instruments | 500150 | Per caricare e iniettare virus in modo controllato. |
| Estrattore per aghi | Narishige | PC-100 | Per riscaldare e separare i tubi capillari di vetro per formare aghi di vetro. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu lab | Cre | |
| plasmide pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmide #44361) | Bryan Roth' s laboratorio attraverso Addgene | DREADD plasmide | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Per assistere con il caricamento del virus nel nanoiniettore. |
| Aghi PrecisionGlide (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Da utilizzare con le siringhe da 1 ml e 10 ml per consentire l'iniezione del modello animale. |
| Pinze per denti di ratto | Roboz | RS-5152 | Per la presa di processi spinosi. |
| Red Oil | N/A | N/A | Per fornire un fronte per la visualizzazione del virus che entra nel tessuto durante l'iniezione. |
| Divaricatori | Roboz | RS-6510 | Per tenere aperta la ferita chirurgica. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Per rimuovere il muscolo dalla colonna vertebrale durante l'intervento chirurgico. |
| Manico a lama di bisturi | Roboz | RS-9843 | Per affettare la pelle aperta e il cuscinetto adiposo di un modello animale durante l'intervento chirurgico. |
| Forbici | Roboz | RS-5980 | Per uso generale in chirurgia. |
| Pinze per la rimozione delle graffette | Kent Scientific | INS750347 | Per rimuovere le graffette, se applicate in modo errato. |
| Panno sterile | Phenix Research Products | BP-989 | Per fornire una superficie sterile per l'operazione. |
| Applicatori sterili con punta in cotone | Puritan | 806-WC | Per assorbire il sangue nella ferita chirurgica mantenendo la sterilità. |
| Garza Sterile | Covidien | 2146 | Per pulire l'area chirurgica e gli strumenti chirurgici mantenendo la sterilità. |
| Soluzione salina sterile | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | Per l'uso nella pulizia del sangue e per la sostituzione dei liquidi dopo l'intervento chirurgico. |
| Guanti chirurgici | N/A | N/A | Per l'uso da parte del chirurgo per mantenere il campo sterile durante l'intervento chirurgico. |
| Cuscinetto riscaldante chirurgico | N/A | N/A | Per mantenere la temperatura corporea del modello animale durante l'intervento chirurgico. |
| Microscopio operatorio | N/A | N/A | Per una migliore visualizzazione della ferita chirurgica. |
| Suturatrice chirurgica | Kent Scientific | INS750546 | Per applicare le graffette. |
| Cuscinetto riscaldante a convezione d'acqua | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | Per l'uso nell'area di recupero post-operatoria per mantenere la temperatura corporea dell'animale incosciente. |
| Ganci ponderati | N/A | N/A | Per tenere aperta la ferita chirurgica. |
| Bendaggio liquido | NewSkin | 985838 | Da applicare lungo le suture dopo l'intervento chirurgico e favorire la guarigione delle ferite |
| Lampada a gabbia metallica | ZooMed | LF10EC | Per aiutare gli animali a riprendersi dall'anestesia e a mantenere la temperatura corporea calda in modo naturale |
Riferimenti
- Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature. Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
- Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P.
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Ristampe e permessi
