La microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) viene applicata per l'immagine e l'analisi delle spine dendritiche nell'ippocampo murino.
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Articolo metodologico
Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia elettronica tridimensionale (3D EM) offre la possibilità di analizzare i parametri morfologici delle spine dendritiche con risoluzione su scala nanometrica. Inoltre, alcune caratteristiche delle spine dendritiche, come il volume della colonna vertebrale e la densità post-sinaptica (PSD) (che rappresenta la parte post-sinaptica della sinapsi), la presenza di terminale presinaptico e il reticolo endoplasmatico liscio o la forma atipica di PSD (ad esempio, spine multi-innervate), possono essere osservate solo con EM 3D. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) è possibile ottenere dati EM 3D in modo più semplice e riproducibile rispetto a quando si esegue il sezionamento seriale tradizionale. Qui mostriamo come preparare campioni di ippocampo di topo per l'analisi SBEM e come questo protocollo può essere combinato con lo studio di immunofluorescenza delle spine dendritiche. La lieve perfusione di fissazione ci consente di eseguire studi di immunofluorescenza con microscopia ottica su una metà del cervello, mentre l'altra metà è stata preparata per SBEM. Questo approccio riduce il numero di animali da utilizzare per lo studio.
Introduzione
La maggior parte delle sinapsi eccitatorie nel sistema nervoso centrale si trovano su spine dendritiche - piccole sporgenze di una membrana neuronale. Queste sporgenze formano compartimenti biochimici confinati che controllano la trasduzione del segnale intracellulare. La plasticità strutturale delle spine dendritiche e delle sinapsi è strettamente correlata ai cambiamenti funzionali nell'efficacia sinaptica che sono alla base di processi importanti come l'apprendimento e la memoria1,2. È importante notare che la microscopia elettronica (EM) è l'unica tecnica che consente di determinare se una colonna vertebra....
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Protocollo
La ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida dell'Istituto Nencki e il permesso del Comitato Etico Locale. Gli studi sono stati effettuati conformemente alla direttiva del Consiglio delle Comunità europee del 24 novembre 1986 (86/609/CEE), alla legge polacca sulla protezione degli animali e approvati dal primo comitato etico locale di Varsavia. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza.
ATTENZIONE: Tutte le procedure descritte di seguito devono essere eseguite in una cappa aspirante da laboratorio. A causa della natura pericolosa dei reagenti utilizzati. Sono....
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Risultati
Utilizzando il metodo sopra descritto ad alto contrasto, è possibile ottenere immagini a buona risoluzione del tessuto cerebrale del topo. Un ampio campo visivo fornito dalla tecnica SBEM facilita la selezione precisa della regione di interesse. La grande immagine della regione CA1 dell'ippocampo è stata presa per misurare la lunghezza dello strato radiato (SR) (Figura 2A) e per impostare l'imaging precisamente al centro (Figura 2B). Successivamente, è .......
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Discussione
Ci sono molte varianti del metodo NCMIR primario descritto da Deerinck nel 201010. I principi di base rimangono gli stessi ma, a seconda del tipo di materiale studiato, vengono implementate lievi modifiche. È stato descritto in precedenza che diverse resine possono essere utilizzate per incorporare campioni per SBEM e ad esempio nel caso di piante, Spurr's è la resina di scelta grazie alla sua bassa viscosità che consente una migliore infiltrazione attraverso le pareti cellulari2.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
L'imaging SBEM, l'imaging al microscopio ottico e la preparazione del campione al microscopio elettronico sono stati eseguiti con l'uso dell'attrezzatura del Laboratorio di imaging tissutale e funzionale che funge da struttura centrale di imaging presso l'Istituto di biologia sperimentale di Nencki.
Per la preparazione della Figura 1 è stata utilizzata l'immagine di un mouse (Souris_02) e di una fiala del https://smart.servier.com/.
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Centre (Polonia) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) assegnato a KR.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anestetico: | |||
| Miscela di ketamina/xilazina (Ketamina/Sedazina) | Biowet Pulawy, Pulawy, Polonia | ||
| Pentobarbital di sodio (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Polonia | ||
| Fissativi: | |||
| Glutaraldeide (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grado I, 25% in H2O, appositamente purificato per l'uso come fissativo per microscopia elettronica |
| Acido cloridrico (HCl) | POCH, Gliwice, Polonia | 575283115 | p.a. puro. |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | compresse |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | ,  98%, pellets ( |
| Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
| Fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
| Perfusione: | |||
| Large blunt/blunt curvo forbici (~14,5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
| Micro-spatola (doppie punte piatte da 2", una arrotondata, una affusolata a 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
| Punta dell'ago, 15 GA, smussato (ago da perfusione) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlino, Germania | KD-FINE 900413 | 1,80 x 40 mm |
| Coppia di pinzette | sottili (Graefe)Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
| Pompa di perfusione | Piombo Fluido | BQ80S | |
| Fiale di plastica | Profilab, Varsavia, Polonia | 534.02 | Fiale di plastica con tappo blu per la conservazione dei tessuti, 20 ml, 31 x 48 mm |
| Forbici per iride diritte (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
| Preparazione di fette di cervello per EM: piastra strong> | |||
| 12 pozzetti | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
| Colla cianoacrilica | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
| Fiale di vetro | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | Fiala a scintillazione da 20 ml, confezione da 100 |
| pipette Pasteur | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, monouso, 7,5 ml |
| Lama di rasoio | Wilkinson Sword, Londra, Regno Unito | Lame di rasoio di sicurezza classiche a doppio taglio | |
| Lama di bisturi | Swann-Morton, Sheffield, Regno Unito | No. 20 | |
| Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
| Brain slices preparation for IF: | |||
| 96-well | plate NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
| Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
| Glicole etilenico | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
| Lama monouso a basso profilo 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
| Lama per bisturi | Swann-Morton, Sheffield, Regno Unito | n. 20 | |
| Azoturo di sodio (NaN3) | POCH, Gliwice, Polonia | 792770426 | |
| Saccarosio | POCH, Gliwice, Polonia | 772090110 | |
| Terreno di congelamento tissutale per criosezione, OCT-Compound | Leica Biosystems, Svizzera | 14020108926 | |
| Immunocolorazione: | |||
| piastra a 24 pozzetti | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
| Anticorpo anti-post densità sinaptica 95 anticorpo | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
| Microscopio confocale | Zeiss, Gö ttingen, Germania | Microscopio a disco rotante Zeiss (63 volte; obiettivo a olio, NA 1,4, dimensione pixel 0,13 &; m &volte; 0,13 µ m) | |
| Vetrino di copertura | Menzel Glaser, Braunschweig, Germania | B-1231 | 24 x 60 mm |
| Asino anti-topo IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito in croce, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
| Fluoromount-G Mounting Medium, con DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
| Vetrino per microscopio | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
| Normal siero d'asino (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| Shaker | JWElectronic, Varsavia, Polonia | KL-942 | |
| TritonT X-100 Reagent Grade Bioshop | , Burlington, Canada | TRX506 | |
| Electron microsocpy preparazione del campione | |||
| Esacianoferrato di potassio (II) triidrato | POCH, Gliwice, Polonia | 746980113 | |
| Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Foglio di inclusione in film fluoropolimero |
| DMP-30, 2,4,6-Tris(dimetilamminometil)fenolo | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | T58203 | Acceleratore di mezzo per inclusione epossidico |
| Durcupan ACM monocomponente A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM monocomponente A, M resina epossidica |
| Durcupan ACM monocomponente B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM monocomponente B, indurente 964 |
| Durcupan ACM monocomponente D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM monocomponente D, plastificante |
| Alcool etilico assoluto | POCH, Gliwice, Polonia | 64-17-5 | Alcol etilico assoluto 99,8% puro P.A.-BASIC |
| Genlab forno da laboratorio | Wolflabs, York, Regno Unito | Mino/18/SS | Forno Genlab MINO/18/SS 18l volume, nessuna circolazione della ventola, nessun display digitale, gradiente di temperatura standard, tasso di recupero standard, nessun timer, 250° C temperatura massima, alimentazione elettrica 240V |
| Acido L-Aspartico | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | grado reagente, 98% (HPLC) |
| Nitrato di piombo (II) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% tracce di metalli base |
| Tetrossido di osmio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | 75632 | per microscopia elettronica, 4% in H2O |
| pHmetro | Elmetron, Zabrze, Polonia | CP-5-5 | |
| Rotator | BioSan, Jó zefó w, Polonia | Rotatore Multi Bio RS-24 | Multi Bio RS-24 |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | Grado reagente S5881 | , 98%, pellet (anidro) |
| Mini shaker girasole | Grant bio, Shepreth, Regno Unito | PD-3D | |
| Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µ m dimensione dei pori | |
| Tiocarbobiidrazide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., per microscopia elettronica, 99.0% (N) |
| Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate· 2H2O, livello di ricerca |
| Bagno d'acqua | WSL, Swietochlowice, Polonia | LWT | |
| Montaggio del campione per piastra di coltura SBEM | |||
| 96 pozzetti | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | Piastre a 96 pozzetti, fondo rotondo, non trattato |
| AM Gatan 3View Pinzette per la manipolazione di tronchetti | Micro to Nano, Haarlem, Paesi Bassi Paesi Bassi | 50-001521 | |
| Binocolo | OPTA-TECH, Varsavia, Polonia | X2000 | |
| Colla conduttiva | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | eopxy conduttivo |
| Gatan 3Visualizza campione pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Paesi Bassi Paesi Bassi | 10-006003 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | P7793 | dimensione del rotolo 20 in. &volte; 50 ft |
| Pelco vernice conduttiva argento | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Vernice conduttiva all'argento, |
| lame di rasoio da 15 g a doppio bordo | Microscopia elettronica Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Acciaio inossidabile "PTFE" rivestito. PERSONNA marca .004" di spessore, avvolto singolarmente, 250 lame in una scatola. |
| Microscopio elettronico a scansione | Zeiss, Oberkochen, Germania | Sigma VP con camera Gatan 3View2, tensione di accelerazione 2,5 kV, pressione variabile 5 Pa, apertura 20 & micro; m, tempo di permanenza 6 & micro; s, spessore fetta 60 nm, ingrandimento 15 000 x, risoluzione dell'immagine 2048 x 2048 pixel, dimensione pixel 7,3 nm | |
| trim 90° coltello diamantato | Diatome Ltd., Nidau, Svizzera | DTB90 | |
| Ultramicrotomo | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
| Software | tutorial | ||
| FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
| Browser di immagini per microscopia | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
| Ricostruisci | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
| Animali | |||
| Topi | Adulto di 3 mesi e 20± 1 mese femmina Topi Thy1-GFP(M) (Thy1-GFP +/-) (Feng et al., 2000) che esprimono GFP in una popolazione scarsamente distribuita di neuroni glutammatergici. Gli animali sono stati allevati come eterozigoti con il background C57BL/6J nella Casa degli Animali dell'Istituto di Biologia Sperimentale di Nencki. |
Riferimenti
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
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Ristampe e permessi
