Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Summary

La microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) viene applicata per l'immagine e l'analisi delle spine dendritiche nell'ippocampo murino.

Abstract

La microscopia elettronica tridimensionale (3D EM) offre la possibilità di analizzare i parametri morfologici delle spine dendritiche con risoluzione su scala nanometrica. Inoltre, alcune caratteristiche delle spine dendritiche, come il volume della colonna vertebrale e la densità post-sinaptica (PSD) (che rappresenta la parte post-sinaptica della sinapsi), la presenza di terminale presinaptico e il reticolo endoplasmatico liscio o la forma atipica di PSD (ad esempio, spine multi-innervate), possono essere osservate solo con EM 3D. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) è possibile ottenere dati EM 3D in modo più semplice e riproducibile rispetto a quando si esegue il sezionamento seriale tradizionale. Qui mostriamo come preparare campioni di ippocampo di topo per l'analisi SBEM e come questo protocollo può essere combinato con lo studio di immunofluorescenza delle spine dendritiche. La lieve perfusione di fissazione ci consente di eseguire studi di immunofluorescenza con microscopia ottica su una metà del cervello, mentre l'altra metà è stata preparata per SBEM. Questo approccio riduce il numero di animali da utilizzare per lo studio.

Introduction

La maggior parte delle sinapsi eccitatorie nel sistema nervoso centrale si trovano su spine dendritiche - piccole sporgenze di una membrana neuronale. Queste sporgenze formano compartimenti biochimici confinati che controllano la trasduzione del segnale intracellulare. La plasticità strutturale delle spine dendritiche e delle sinapsi è strettamente correlata ai cambiamenti funzionali nell'efficacia sinaptica che sono alla base di processi importanti come l'apprendimento e la memoria^1,2. È importante notare che la microscopia elettronica (EM) è l'unica tecnica che consente di determinare se una colonna vertebra....

Protocol

La ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida dell'Istituto Nencki e il permesso del Comitato Etico Locale. Gli studi sono stati effettuati conformemente alla direttiva del Consiglio delle Comunità europee del 24 novembre 1986 (86/609/CEE), alla legge polacca sulla protezione degli animali e approvati dal primo comitato etico locale di Varsavia. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza.

ATTENZIONE: Tutte le procedure descritte di seguito devono essere eseguite in una cappa aspirante da laboratorio. A causa della natura pericolosa dei reagenti utilizzati. Sono....

Results

Utilizzando il metodo sopra descritto ad alto contrasto, è possibile ottenere immagini a buona risoluzione del tessuto cerebrale del topo. Un ampio campo visivo fornito dalla tecnica SBEM facilita la selezione precisa della regione di interesse. La grande immagine della regione CA1 dell'ippocampo è stata presa per misurare la lunghezza dello strato radiato (SR) (Figura 2A) e per impostare l'imaging precisamente al centro (Figura 2B). Successivamente, è .......

Discussion

Ci sono molte varianti del metodo NCMIR primario descritto da Deerinck nel 2010¹⁰. I principi di base rimangono gli stessi ma, a seconda del tipo di materiale studiato, vengono implementate lievi modifiche. È stato descritto in precedenza che diverse resine possono essere utilizzate per incorporare campioni per SBEM e ad esempio nel caso di piante, Spurr's è la resina di scelta grazie alla sua bassa viscosità che consente una migliore infiltrazione attraverso le pareti cellulari^2.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anestetico:
Miscela di ketamina/xilazina (Ketamina/Sedazina)	Biowet Pulawy, Pulawy, Polonia
Pentobarbital di sodio (Morbital)	Biowet Pulawy, Pulawy, Polonia
Fissativi:
Glutaraldeide (GA)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	G5882	Grado I, 25% in H2O, appositamente purificato per l'uso come fissativo per microscopia elettronica
Acido cloridrico (HCl)	POCH, Gliwice, Polonia	575283115	p.a. puro.
Paraformaldeide (PFA)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	441244	prilled, 95%
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	P4417-50TAB	compresse
Idrossido di sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S5881	, 98%, pellets (
Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S3264
Fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S3139
Perfusione:
Large blunt/blunt curvo forbici (~14,5 cm)	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	14519-14
Micro-spatola (doppie punte piatte da 2", una arrotondata, una affusolata a 1/8")	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	10091-12
Punta dell'ago, 15 GA, smussato (ago da perfusione)	KD Medical GmbH Hospital Products, Berlino, Germania	KD-FINE 900413	1,80 x 40 mm
Coppia di pinzette	sottili (Graefe)Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	11050-10
Pompa di perfusione	Piombo Fluido	BQ80S
Fiale di plastica	Profilab, Varsavia, Polonia	534.02	Fiale di plastica con tappo blu per la conservazione dei tessuti, 20 ml, 31 x 48 mm
Forbici per iride diritte (~9 cm)	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	14058-11
Preparazione di fette di cervello per EM: piastra strong>
12 pozzetti	NEST, Rahway, NJ, USA	712001
Colla cianoacrilica	Fenedur, Montevideo, Uruguay
Fiale di vetro	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72632	Fiala a scintillazione da 20 ml, confezione da 100
pipette Pasteur	VWR, Radnor, PA, USA	612-4545	LDPE, monouso, 7,5 ml
Lama di rasoio	Wilkinson Sword, Londra, Regno Unito		Lame di rasoio di sicurezza classiche a doppio taglio
Lama di bisturi	Swann-Morton, Sheffield, Regno Unito	No. 20
Vibratome	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica VT1000 S
Brain slices preparation for IF:
96-well	plate NEST, Rahway, NJ, USA	701101
Criostat	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica CM 1950
Glicole etilenico	Bioshop, Burlington, Canada	ETH001
Lama monouso a basso profilo 819	Leica Biosystems Inc., USA	14035838925
Lama per bisturi	Swann-Morton, Sheffield, Regno Unito	n. 20
Azoturo di sodio (NaN3)	POCH, Gliwice, Polonia	792770426
Saccarosio	POCH, Gliwice, Polonia	772090110
Terreno di congelamento tissutale per criosezione, OCT-Compound	Leica Biosystems, Svizzera	14020108926
Immunocolorazione:
piastra a 24 pozzetti	NEST, Rahway, NJ, USA	702001
Anticorpo anti-post densità sinaptica 95 anticorpo	Merck-Millipore, Burlington, MA, USA	MAB1598
Microscopio confocale	Zeiss, Gö ttingen, Germania		Microscopio a disco rotante Zeiss (63 volte; obiettivo a olio, NA 1,4, dimensione pixel 0,13 &; m &volte; 0,13 µ m)
Vetrino di copertura	Menzel Glaser, Braunschweig, Germania	B-1231	24 x 60 mm
Asino anti-topo IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito in croce, Alexa Fluor 555	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	A31570
Fluoromount-G Mounting Medium, con DAPI	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	00-4959-52
Vetrino per microscopio	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	AGAA00008	SuperFrost
Normal siero d'asino (NDS)	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA	017-000-121
Shaker	JWElectronic, Varsavia, Polonia	KL-942
TritonT X-100 Reagent Grade Bioshop	, Burlington, Canada	TRX506
Electron microsocpy preparazione del campione
Esacianoferrato di potassio (II) triidrato	POCH, Gliwice, Polonia	746980113
Aclar 33C Film	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	50425	Foglio di inclusione in film fluoropolimero
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimetilamminometil)fenolo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	T58203	Acceleratore di mezzo per inclusione epossidico
Durcupan ACM monocomponente A, M	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44611	Durcupan ACM monocomponente A, M resina epossidica
Durcupan ACM monocomponente B	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44612	Durcupan ACM monocomponente B, indurente 964
Durcupan ACM monocomponente D	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44614	Durcupan ACM monocomponente D, plastificante
Alcool etilico assoluto	POCH, Gliwice, Polonia	64-17-5	Alcol etilico assoluto 99,8% puro P.A.-BASIC
Genlab forno da laboratorio	Wolflabs, York, Regno Unito	Mino/18/SS	Forno Genlab MINO/18/SS 18l volume, nessuna circolazione della ventola, nessun display digitale, gradiente di temperatura standard, tasso di recupero standard, nessun timer, 250° C temperatura massima, alimentazione elettrica 240V
Acido L-Aspartico	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	A-9256	grado reagente, 98% (HPLC)
Nitrato di piombo (II)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	467790	99.95% tracce di metalli base
Tetrossido di osmio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	75632	per microscopia elettronica, 4% in H2O
pHmetro	Elmetron, Zabrze, Polonia	CP-5-5
Rotator	BioSan, Jó zefó w, Polonia	Rotatore Multi Bio RS-24	Multi Bio RS-24
Idrossido di sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	Grado reagente S5881	, 98%, pellet (anidro)
Mini shaker girasole	Grant bio, Shepreth, Regno Unito	PD-3D
	Millipore, Burlington, MA, USA	SLGP033NB	0,22 µ m dimensione dei pori
Tiocarbobiidrazide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	88535	purum p.a., per microscopia elettronica, 99.0% (N)
Uranyl acetate	Serva, Heidelberg, Germany	77870	Uranyl acetate· 2H2O, livello di ricerca
Bagno d'acqua	WSL, Swietochlowice, Polonia	LWT
Montaggio del campione per piastra di coltura SBEM
96 pozzetti	VWR, Radnor, PA, USA	734-2782	Piastre a 96 pozzetti, fondo rotondo, non trattato
AM Gatan 3View Pinzette per la manipolazione di tronchetti	Micro to Nano, Haarlem, Paesi Bassi Paesi Bassi	50-001521
Binocolo	OPTA-TECH, Varsavia, Polonia	X2000
Colla conduttiva	Chemtronics, Georgia, USA	CW2400	eopxy conduttivo
Gatan 3Visualizza campione pin stubs	Micro to Nano, Haarlem, Paesi Bassi Paesi Bassi	10-006003
Parafilm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	P7793	dimensione del rotolo 20  in. &volte; 50  ft
Pelco vernice conduttiva argento	Ted Pella, Redding, CA, USA	16062-15	PELCO®   Vernice conduttiva all'argento,
lame di rasoio da 15 g a doppio bordo	Microscopia elettronica Sciences, Hatfield, PA, USA	72000	Acciaio inossidabile "PTFE" rivestito. PERSONNA marca .004" di spessore, avvolto singolarmente, 250 lame in una scatola.
Microscopio elettronico a scansione	Zeiss, Oberkochen, Germania		Sigma VP con camera Gatan 3View2, tensione di accelerazione 2,5 kV, pressione variabile 5 Pa, apertura 20 & micro; m, tempo di permanenza 6 & micro; s, spessore fetta 60 nm, ingrandimento 15 000 x, risoluzione dell'immagine 2048 x 2048 pixel, dimensione pixel 7,3 nm
trim 90° coltello diamantato	Diatome Ltd., Nidau, Svizzera	DTB90
Ultramicrotomo	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica ultracutR
Software	tutorial
FijiJ	https://fiji.sc/
Browser di immagini per microscopia	http://mib.helsinki.fi/		http://mib.helsinki.fi/tutorials.html
Ricostruisci	https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0		https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)
Animali
Topi	Adulto di 3 mesi e  20± 1  mese   femmina  Topi Thy1-GFP(M) (Thy1-GFP +/-) (Feng et al., 2000) che esprimono GFP in una popolazione scarsamente distribuita di neuroni glutammatergici. Gli animali sono stati allevati come eterozigoti con il background C57BL/6J nella Casa degli Animali dell'Istituto di Biologia Sperimentale di Nencki.