La trasformazione germinale di successo nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda,è stata ottenuta utilizzando l'mRNA della trasposasi iperattiva piggyBac.
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Articolo metodologico
Piggy iperattivoTrasponsi-mediata dalla trasposizione della linea germinale nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'inserimento stabile di carichi genetici nei genomi degli insetti utilizzando elementi trasponibili è un potente strumento per studi genomici funzionali e lo sviluppo di strategie genetiche di gestione dei parassiti. L'elemento trasponibile più utilizzato nella trasformazione degli insetti è piggyBace la trasformazione germinale a base di piggyBacè stata condotta con successo negli insetti modello. Tuttavia, è ancora difficile impiegare questa tecnologia in insetti non modello che includono parassiti agricoli. Questo documento riporta la trasformazione germinale di un parassita agricolo globale, il verme dell'esercito autunnale (FAW), Spodoptera frugiperda, utilizzando la trasposasi iperattiva piggyBac (hyPBase).
In questo lavoro, l'mRNA hyPBase è stato prodotto e utilizzato al posto del plasmide helper nelle microiniezioni embrionali. Questo cambiamento ha portato alla generazione di successo di FAW transgenico. Inoltre, vengono descritti anche i metodi di screening degli animali transgenici, il rilevamento rapido basato sulla PCR dell'inserimento transgenico e la determinazione termica asimmetrica interlacciata della PCR (TAIL-PCR) del sito di integrazione. Pertanto, questo documento presenta un protocollo per produrre FAW transgenico, che faciliterà la transgenesi basata su piggyBacin FAW e altri insetti lepidotteri.
Introduzione
Il verme dell'esercito autunnale (FAW), Spodoptera frugiperda, è originario delle regioni tropicali e subtropicali dell'America. Attualmente, questo è un erbivoro insetto devastante in più di 100 paesi in tutto il mondo1. Le larve faw si nutrono di oltre 350 piante ospiti, tra cui alcune importanti colture alimentari di base2. La forte capacità migratoria degli adulti FAW contribuisce alla sua recente rapida diffusione dalle Americhe ad altri luoghi1,2. Di conseguenza, questo insetto sta ora minacciando la sicurezza alimentare a livello internazionale. L....
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Protocollo
1. Sintesi in vitro di mRNA hyPBase
NOTA: La sequenza di codifica completa della sequenza hyPBase è stata sintetizzata e inserita in un vettore pTD1-Cas9 (vedi la Tabella dei materiali)per produrre il costrutto pTD1-hyPBase, che contiene una cassetta che esprime hyPBase, promotore T7: poliedrino-5' UTR: hyPBase: poliedrina-3' UTR: poly (A). La sequenza completa del costrutto pTD1-hyPBase è fornita nel Materiale supplementare.
- Preparazione del modello per la sintesi in vitro
- Eseguire una reazione PCR per amplificare la cassetta che esprime hyPBase utilizzando un primer in ....
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Risultati
Un costrutto per l'espressione del promotore T7 contenente hyPBase: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal è stato generato (Figura 1A) e amplificato come un frammento PCR ~ 2.2 kb per sintetizzare l'mRNA hyPBase in vitro (Figura 1B). Quindi, l'mRNA hyPBase è stato prodotto e sottoposto a elettroforesi su gel di agarosio. L'mRNA della dimensione prevista (banda ~1,1 kb) è stato rilevato su un gel di agarosio all'1% (
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Discussione
Il basso tasso di trasposizione e la difficoltà di fornire componenti transgenici in embrioni freschi limitano il successo della trasformazione germinale in molti insetti non modello, specialmente quelli di ordine, Lepidotteri. Per aumentare il tasso di trasformazione della linea germinale, è stata sviluppata una versione iperattiva della trasposasi piggyBac più utilizzata (hyPBase)7,10. Ad oggi, la trasformazione germinale di successo negli insetti lepi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
La ricerca riportata è supportata dalla National Science Foundation I / UCRC, dal Center for Arthropod Management Technologies, sotto Grant No IIP-1821936 e da partner industriali, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 e National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 e 2353057000).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1.5 "Rotoli di cotone dentale | PlastCare USA | 8542025591 | ALLEVAMENTO |
| oz Coperchi per tazze da soufflé | DART | PL1N | |
| Tazze per soufflé da 1 oz | DART | P100N | ALLEVAMENTO |
| 48 oz Contenitori per gastronomia in plastica | Genpack | AD48 | REARING |
| Set di filtri aggiuntivi (verde) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Vetro borosilicato | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INIEZIONE |
| Vetro borosilicato | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Cannocchiale da dissezione | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Pinze peso piuma | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Invertita Microscopio | Olympus | IX71 | INIEZIONE |
| Microiniettore | Narishige | IM-300 | INIEZIONE |
| Estrattore per micropipette | Sutter Instruments | P-1000 | INIEZIONE |
| Vetrini per microscopio | VWR | 16004-22 | INIEZIONE |
| NightSea Sistema completo | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Azoto gassoso | AWG/ Scott-Gross | NI 225 | INIEZIONE |
| Asciugamani di carta | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Richiesta Specie/Quantità] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Richiesta Specie/Quantità] | BREEDING |
| Taq MasterMix | miscela polimerasi |
Riferimenti
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al.
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Ristampe e permessi
