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Articolo metodologico

Risonanza magnetica nucleare Pure Shift: un nuovo strumento per la metabolomica delle piante

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DOI:

10.3791/62719

⸱

31 luglio 2021

 ,  , 
1Departamento de Ciencias - Química, CERMN, Pontificia Universidad Católica del Perú

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta l'uso di PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE nella profilazione metabolica delle piante e include procedure dettagliate per la preparazione del campione e la registrazione ottimale degli spettri NMR Pure Shift. Vengono discussi esempi attraverso i quali il guadagno in risoluzione ottenuto dal disaccoppiamento omonucleare consente una comprensione più completa del sistema.

Abstract

La Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è uno degli strumenti più potenti utilizzati in metabolomica. Si pone come un metodo altamente accurato e riproducibile che non solo fornisce dati quantitativi, ma consente anche l'identificazione strutturale dei metaboliti presenti in miscele complesse.

La profilazione metabolica mediante NMR 1H si è dimostrata utile nello studio di vari tipi di scenari vegetali, che includono la valutazione delle condizioni delle colture, i trattamenti del raccolto e post-raccolto, la fenotipizzazione metabolica, le vie metaboliche, la regolazione genica, l'identificazione di biomarcatori, la chemiotassonomia, il controllo di qualità, la denominazione di origine, tra gli altri. Tuttavia, la sovrapposizione del segnale del gran numero di risonanze con molteplicità di accoppiamento J espanse complica l'analisi degli spettri e la sua interpretazione e rappresenta una limitazione per il classico profilo NMR 1H.

Nell'ultimo decennio, sono state sviluppate nuove tecniche di disaccoppiamento omonucleare a banda larga NMR attraverso le quali i segnali multipli collassano in singole linee di risonanza - comunemente chiamate metodi Pure Shift - per superare il problema della risoluzione degli spettri inerente aglispettri classici NMR 1 H.

Qui viene presentato un protocollo passo-passo della preparazione dell'estratto vegetale e la procedura per registrare gli spettri ottimali di Pure Shift PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE in tre diverse matrici vegetali: foglie di pianta di vaniglia , tuberi di patata (S. tuberosum) e uva spina del Capo (P. peruviana). Viene discusso l'effetto dell'aumento della risoluzione nell'identificazione metabolica, nell'analisi di correlazione e nelle analisi multivariate, rispetto agli spettri classici.

Introduzione

L'insieme completo dei metaboliti che compongono un organismo - substrati, intermedi e prodotti finali dei processi biologici - è stato coniato nel 1998 con il termine metaboloma. E' noto che il metaboloma è strettamente correlato al fenotipo, ed è di particolare interesse nelle piante in quanto riflette l'interazione diretta tra il genotipo e l'ambiente 1,2. Pertanto, la caratterizzazione del profilo metabolomico è diventata di fondamentale importanza nelle piante. Attraverso l'identificazione e la quantificazione di biomarcatori (metaboliti chiave) e modelli metabolici, è stato possibile discriminare tra specie, cultivar, stadi di sviluppo, malattie patogene o condizioni ambientali (cambiamenti giornalieri e stagionali, suoli, stress idrico, stress meccanico, raccolti e trattamenti post-raccolta), tra gli altri, 3,4,5.

La spettrometria di massa (MS) e la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) sono le piattaforme analitiche più utilizzate per questo scopo. Contrariamente alle metodologie MS, la risonanza magnetica nucleare è una tecnica altamente riproducibile, non distorta, quantitativa, accurata e non distruttiva che richiede una preparazione minima del campione, il che la rende adatta per gli studi di metabolomica. Tuttavia, rispetto ai metodi MS, la bassa sensibilità intrinseca è un limite. Negli ultimi anni e attraverso l'uso di magneti ad alto campo, sonde criogeniche, dispositivi a micro-bobina e metodi di polarizzazione nucleare dinamica (DNP), la sensibilità della risonanza magnetica nucleare è stata notevolmente migliorata. Nel caso di quest'ultimo approccio, ad esempio, il guadagno di sensibilità era di due o tre ordini di grandezza 6,7. Ad oggi, quasi il 20% degli studi di metabolomica pubblicati sono basati sulla risonanza magnetica nucleare e il numero è in aumento,7.

Anche se la risonanza magnetica namica protonica è l'esperimento più popolare e sensibile per l'impronta digitale metabolomica NMR, presenta alcuni inconvenienti. In primo luogo, tutti i segnali NMR di 1ora rilevati nel campione sono distribuiti in una piccola finestra corrispondente alla finestra di spostamento chimico del protone, il che si traduce in spettri affollati. In secondo luogo, l'accoppiamento scalare omonucleare divide i segnali in più componenti (molteplicità del segnale), diffondendo il segnale del protone su una gamma di frequenze più ampia, complicando ulteriormente la lettura degli spettri aumentando l'affollamento e la sovrapposizione del segnale. Inoltre, la metabolomica NMR viene impiegata nell'analisi di miscele solitamente contenenti da 50 a 300 molecole a una concentrazione osservabile NMR, generando spettri complessi composti da 200 a 2000 picchi.

La NMR del protone di disaccoppiamento omonucleare, nota anche come Pure Shift, è un metodo che induce il collasso di un segnale multipletto in un singolo picco. Si pone come uno strumento eccellente per aumentare la risoluzione del segnale negli spettri affollati 8,9,10 e quindi rappresenta uno strumento conveniente per la metabolomica delle piante11.

Nell'ultimo decennio sono emerse nuove sequenze di impulsi Pure Shift, che aumentano sia la sensibilità che le prestazioni di disaccoppiamento. Anche la loro gamma di applicazioni si è ampliata, dalla delucidazione della struttura molecolare12,13, alla fluxomica14, all'assegnazione di miscele 15,16,17, alle misure di diffusione traslazionale 18, alla discriminazione enantiomerica19, alla distribuzione unitaria in copolimeri20, tra le altre.

Storicamente, gli esperimenti Broadband Pure Shift soffrono di bassa sensibilità e metodi di lavorazione complicati, limitando il loro campo di applicazione nella valutazione degli estratti biologici8. Nel 2014, Foroozandeh et al. hanno pubblicato un nuovo esperimento Pure Shift, PSYCHE (Pure Shift Yielded by Chirp Excitation), basato sulla sequenza di impulsi anti-z-COSY che ha prodotto un eccellente disaccoppiamento omonucleare e un miglioramento dei valori di sensibilità21. Tuttavia, poiché PSYCHE è un esperimento di interferogramma 2D in cui vengono acquisiti blocchi di dati nel dominio del tempo, soffre di artefatti periodici della banda laterale che derivano da distorsioni di modulazione dell'accoppiamento J ai bordi del pezzo. Nelle miscele complesse, questi artefatti producono segnali più grandi di quelli associati ai metaboliti presenti a concentrazioni molto basse, ostacolando l'analisi11. Esistono due metodi per rimuovere questi artefatti: TSE-PHYCHE22 e una modifica più recente dell'esperimento PSYCHE chiamata SAPPHIRE-PSYCHE (Sideband Averaging by Periodic PHase Incrementation of Residual J Evolution)23.

Nel 2019, abbiamo dimostrato per la prima volta11 che il metodo SAPPHIRE-PSYCHE Pure Shift, che rimuove gli artefatti quasi senza penalità di sensibilità23, potrebbe essere impiegato per l'analisi di miscele biologiche complesse, come gli estratti dei frutti di Physalis peruviana, comunemente noti come uva spina del Capo11. Abbiamo dimostrato che questi metodi aumentano le prestazioni delle analisi dei dati metabolomici come l'assegnazione metabolica, l'analisi di correlazione e l'analisi dei coefficienti multivariati11. Da allora, sono stati affrontati diversi studi di metabolomica Pure Shift su diverse matrici biologiche, come i coralli molli24, le piante di iperico25, il miele26,27, il tè27, l'olio di menta piperita26 e le noci28, dimostrando la sua importanza come nuovo strumento per l'analisi metabolomica. Paradossalmente, la stragrande maggioranza di questi studi ha utilizzato la sequenza di impulsi PSYCHE standard e facile da implementare, disponibile in qualsiasi libreria di spettrometri, invece della sequenza di impulsi SAPPHIRE-PSYCHE, che ha dimostrato di funzionare meglio. Tuttavia, richiede una migliore comprensione della sequenza di impulsi per una corretta configurazione.

Questo articolo ha lo scopo di aiutare i nuovi utenti ad applicare i metodi Pure Shift nello studio delle piante, in particolare, foglie di Vanilla sp (V. planifolia e V. pompona)29, tuberi di patata (S. tuberosum)30 e uva spina del Capo (P. peruviana)31. La preparazione del campione, l'impostazione sperimentale NMR, l'acquisizione e l'analisi dei dati sono descritti in dettaglio. Inoltre, il protocollo include note chiave per aiutare i ricercatori, nuovi nel campo, a impostare correttamente gli esperimenti PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE nella profilazione metabolomica delle piante.

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Protocollo

1. Preparazione del campione

  1. Uva spina del Capo
    1. Mettere 100-200 g di frutta fresca in un vaso frullatore. Mantenere a 4 °C per 30 minuti, quindi omogeneizzare in un frullatore da laboratorio.
    2. Trasferisci immediatamente il succo in provette di plastica da 50 ml, congelale in azoto liquido e liofilizzale a secco per 4 o 5 giorni.
    3. Macinare il materiale liofilizzato in una polvere fine utilizzando un macinino elettrico.
      NOTA: La manipolazione del materiale secco deve essere eseguita rapidamente perché la polvere è altamente igroscopica.
    4. Pesare 1 g di materiale macinato e aggiungere 10 ml di acqua ultrapura. Vortice per 1 min.
    5. Sonicare per 20 minuti a 10 °C, quindi centrifugare a 23.000 × g per 20 minuti a 10 °C.
    6. Recuperare il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro per siringa da 13 mm in politetrafluoroetilene (PTFE) da 0,45 μm.
    7. Liofilizzare 1 mL dell'estratto filtrato fino a secchezza e quindi risospendere il solido ottenuto in 0,9 mL di tampone ossalato di sodio 200 mM pH 4. Vortice.
    8. Liofilizzare il campione risultante fino a portarlo a secco e scioglierlo in 0,9 mL di ossido di deuterio contenente 5 mM di sale sodico acido 3-(trimetilsilil)propionico-2,2,3,3-d4 (TMSP-d4).
    9. Riempire la provetta NMR con 0,6 mL di campione utilizzando una micropipetta.
  2. Foglie di vaniglia
    1. Raccogli le foglie, puliscile con carta velina umida e congelale intere in azoto liquido.
    2. Rompere le foglie in piccoli pezzi e liofilizzare per 4 giorni fino a quando non si asciugano.
    3. Macinare la sostanza secca fino a ridurla in polvere fine utilizzando un macinino elettrico.
    4. Pesare 50 mg di materiale macinato e aggiungere 0,75 mL di tampone fosfato pH 6,0 in ossido di deuterio contenente lo 0,1% di TMSP (p/p) e 0,75 mL di metanolo-d4. Vortice per 1 min.
    5. Sonicare per 20 minuti a 25 °C.
    6. Centrifugare a 13.000 × g per 10 min a 25 °C.
    7. Recuperare il surnatante (~1,3-1,4 mL) e filtrarlo attraverso un filtro per siringa da 13 mm in PTFE da 0,45 μm.
    8. Riempire la provetta NMR con 0,6 mL del campione filtrato utilizzando una micropipetta.
  3. Tuberi di patata
    1. Sbucciare e affettare da 4 a 8 tuberi. Immediatamente, mettere circa 125 g di materiale in sacchetti stand-up e congelarli in azoto liquido.
      NOTA: Per evitare l'ossidazione durante la manipolazione, mantenere la patata umida.
    2. Liofilizzare per 4-6 giorni fino a completa secchezza.
    3. Macinare la sostanza secca fino a ridurla in polvere fine utilizzando un macinino elettrico.
    4. Pesare 160 mg di tubero macinato e aggiungere 1,6 ml di acqua deionizzata. Vortice per 1 min.
    5. Sonicare per 45 minuti a 10 °C.
    6. Centrifugare a 23.000 x g per 20 min a 10 °C.
    7. Recuperare il surnatante (~1,5 -1,6 mL) e farlo evaporare a secco in un concentratore centrifugo sottovuoto refrigerato per 16 ore, a 10 °C.
    8. Aggiungere al solido ottenuto (20-25 mg) 0,9 mL di tampone ossalato di sodio 100 mM pH 4, vorticare ed evaporare per 16 ore a 10 °C.
    9. Sciogliere il solido ottenuto in 0,9 mL di ossido di deuterio contenente 3 mM di TMSP.
    10. Centrifugare a 23.000 x g per 5 minuti a 10 °C e filtrare il surnatante direttamente nella provetta NMR attraverso un filtro per siringa da 13 mm in PTFE da 0,45 μm.
      NOTA: In questo caso, è stata eseguita una filtrazione diretta nella provetta NMR per ridurre le fasi di preparazione di oltre 1000 campioni.

2. Acquisizione ed elaborazione dei dati NMR

  1. Configurazione iniziale NMR
    1. Trasferire i campioni allo spettrometro NMR.
    2. Sintonizza e abbina la testa della sonda.
    3. Bloccare e spessorare il campione.
    4. Calibrare l'impulso duro a 90°. Calibrare l'impulso a 90° utilizzando una qualsiasi delle procedure standard.
    5. Esegui uno spettro NMR protonico 1D standard.
  2. Esperimento PSYCHE
    1. Selezionare la sequenza di impulsi reset_psyche_1d dalla libreria Bruker Topspin (Figura S1). Utilizzare i seguenti parametri standard: larghezza spettrale di 5 kHz (SW2), almeno 1 o 2 secondi di ritardo di recupero del rilassamento (D1), 16 scansioni fittizie (DS), 64 o 128 punti dati complessi per blocco (L31) e 64 o 128 scansioni (NS) (Figura S1).
      NOTA: L31 è il numero di punti digitali complessi acquisiti in ogni blocco Pure Shift, che è meglio impostare su una potenza di 2. 21
    2. Impostare l'eccitazione dell'angolo di inversione dell'impulso CHIRP desiderata (CNST61) e 10 kHz per la larghezza di banda dell'impulso CHIRP (CNST60) (Figura S2).
      NOTA: L'esperimento PSYCHE si basa su uno schema anti-z-COY; di conseguenza, l'angolo di inversione dell'impulso CHIRP deve essere piccolo per evitare artefatti di riaccoppiamento (Figura 1). L'intensità assoluta aumenta con l'angolo di inversione dell'eccitazione. Anche gli artefatti periodici vengono migliorati, diffondendosi nello spettro e aumentando il "rumore" (Figura 1). Il "rumore" diventa una combinazione di rumore standard e artefatti di chuncking. Un buon compromesso tra sensibilità e bassi artefatti di riaccoppiamento è impostare CNST61 = 20°. Ore 19,22
    3. Impostare la lunghezza dell'impulso forte (P1) sul valore precedentemente calibrato e la lunghezza dell'impulso della forma PSYCHE su 30 ms (P49) (Figura S2).
      NOTA: È molto importante calibrare il valore dell'impulso duro poiché la potenza dell'impulso di forma verrà calcolata automaticamente da questo valore.
    4. Scegliere l'impulso di forma Crp_psyche,20 (SPNAM 37) per l'elemento PSYCHE (Figura S2).
    5. Impostare l'intensità del gradiente del campo impulsivo applicato durante l'elemento PSYCHE (GPZ0). Scegliere RECT.1 per l'impulso di forma a gradiente (GPNAM 0) (Figura S2).
      NOTA: Un debole gradiente di campo magnetico viene applicato durante l'elemento PSYCHE, normalmente, tra l'1% e il 4% della forza massima del gradiente, a seconda della sonda.
    6. Impostare il numero di blocchi da acquisire per ricostruire il Pure Shift FID (TD1) (Figura S3).
      NOTA: PSYCHE viene acquisito come un esperimento pseudo-2D dove TD1 è il numero di blocchi di interferogramma Pure Shift. La risoluzione dello spettro dipende dalla dimensione della finestra spettrale (SW1) e dal numero totale di punti acquisiti, che è TD1*2*L31. In genere, 16 o 32 blocchi con 64 o 128 punti complessi per blocco forniranno una risoluzione digitale sufficiente. Poiché PSYCHE viene registrato in modo interferogramma, un numero maggiore di blocchi aumenta la risoluzione digitale, ma anche il tempo totale di acquisizione19. Gli accoppiamenti J omonucleari si evolvono durante ogni blocco, risultando in un modello di modulazione J oscillante21,23. Dopo la trasformata di Fourier, questo genera artefatti periodici della banda laterale che dipendono dalla lunghezza del blocco (Figura 2). Per ridurre gli artefatti, la durata del blocco deve essere breve, in genere inferiore a 16 ms (durata del blocco = 2*in0: Figura S1). Se la durata del blocco è elevata, ridurre L31.
    7. Elabora i dati con il programma AU Proc_reset di Bruker e la trasformata di Fourier.
      NOTA: Si consiglia di trasformare lo spettro utilizzando il riempimento zero e un'apodizzazione a campana sinusoidale (Figura S4).
  3. Esperimento SAPPHIRE-PSYCHE
    1. Selezionare la sequenza di impulsi SAPPHIRE-PSYCHE e impostare i parametri della sequenza di impulsi. I parametri standard sarebbero i seguenti: 5 kHz di larghezza spettrale (SW3), almeno 1 o 2 secondi di ritardo di rilassamento (D1), 16 scansioni fittizie (DS), 8 o 16 scansioni per incremento (NS) e da D2 a 14 ms (Figura S5).
      NOTA: Questa sequenza non è nel repertorio di Bruker, tuttavia, la sequenza e i programmi di elaborazione possono essere ottenuti dal sito web del Manchester NMR Methodology Group, (https://www.nmr.chemistry.manchester.ac.uk/?q=node/426)23. Il ritardo D2 assicura che il rilassamento T2 rimanga costante ad ogni incremento di modulazione J. D2 deve essere maggiore di 1/4*SW1+p16+2*d16. 23
    2. Impostare l'eccitazione dell'angolo di inversione dell'impulso CHIRP desiderata (CNST20) e 10 kHz per la larghezza di banda dell'impulso CHIRP (CNST21) (Figura S6).
      NOTA: Come nel normale esperimento PSYCHE, l'angolo di inversione dell'impulso CHIRP deve essere corto per evitare artefatti di riaccoppiamento. CNST20 = 20° è un buon compromesso tra sensibilità e bassi artefatti di riaccoppiamento 21,23,25.
    3. Impostare la lunghezza dell'impulso forte (P1) sul valore precedentemente calibrato e la lunghezza dell'impulso della forma PSYCHE su 30 ms (P40) (Figura S6).
      NOTA: È importante calibrare il valore dell'impulso duro poiché la potenza dell'impulso di forma verrà calcolata automaticamente da esso.
    4. Scegliere l'impulso di forma PSYCHE_Saltire_10kHz_30m per l'elemento PSYCHE (Figura S6).
    5. Impostare l'intensità del gradiente del campo impulsivo applicato durante l'elemento PSYCHE (GPZ10). Scegliere RECT.1 per l'impulso di forma del gradiente (GPNAM 10) (Figura S7).
      NOTA: Durante l'elemento PSYCHE viene applicato un debole gradiente di campo magnetico, normalmente compreso tra l'1% e il 4% dell'intensità massima del gradiente, valore che dipende dalla sonda.
    6. Impostare il numero di incrementi di modulazione SAPPHIRE J in F2 (TD2) (Figura S7).
      NOTA: normalmente 8 incrementi assicurano un'ottima soppressione degli artefatti della banda laterale (Figure 2 e 3). Il numero totale di scansioni del FID finale di Pure Shift è NS*TD2. 23
    7. Impostare le finestre spettrali F1 e F2 (SW1 e SW2) (Figura S5).
      NOTA: SW2=SW3/(2*TD2) e SW3/SW1 = TD2*N, dove TD2 e N sono interi pari23. L'esperimento SAPPHIRE-PSYCHE viene acquisito come pseudo 3D dove F2 codifica la modulazione di fase dell'artefatto di accoppiamento J e F1 l'acquisizione dell'interferogramma Pure Shift20. Poiché SAPPHIRE-PSYCHE rimuove le bande laterali di modulazione J , la durata del blocco Pure Shift dell'interferogramma potrebbe essere più lunga del normale PSYCHE (durata del blocco Pure Shift = 1/SW1), tipicamente compresa tra 20 e 40 ms (Figura 2). Tuttavia, l'acquisizione di dati a blocchi più lunghi porta a evoluzioni più elevate dell'accoppiamento J, che richiederebbero più incrementi di modulazione di fase dell'accoppiamento J per rimuovere le bande laterali più forti raggiunte23.
    8. Impostare il numero di blocchi Pure Shift (TD1) (Figura S7).
      NOTA: Poiché SAPPHIRE-PSYCHE deve compensare la modulazione di fase dell'accoppiamento J del primo blocco, è necessario acquisire un blocco aggiuntivo. Tipicamente, 17 (16+1) o 33 (32+1) blocchi forniscono una risoluzione digitale sufficiente23.
    9. Elabora i dati eseguendo i programmi pm_pshift e pm_fidadd AU seguiti dalla trasformata di Fourier23.
      NOTA: Si consiglia di trasformare lo spettro utilizzando il riempimento zero e un'apodizzazione a campana sinusoidale (Figura S4).

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Risultati

Analisi dello spettro NMR
Gli esperimenti PSYCHE aumentano la risoluzione degli spettri facendo collassare le risonanze accoppiate in singoletti21, che a loro volta riducono la sovrapposizione e facilitano l'assegnazione e l'analisi dei dati. Pure Shift NMR può essere applicato agli estratti vegetali. Qui dimostriamo il suo utilizzo in tre diverse matrici: foglie di vaniglia, tuberi di patata e frutti di Physalis peruviana . L'aumento della risoluzione ottenuto negli s...

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Discussione

L'identificazione strutturale e la quantificazione dei metaboliti sono questioni chiave nella caratterizzazione del metaboloma, dati che, sottoposti ad analisi multivariate, permettono di comprendere meglio il sistema biologico oggetto di studio. La preparazione dei campioni e l'acquisizione dei dati sono aspetti critici che devono essere ottimizzati per fornire risultati affidabili.

In questo articolo, descriviamo e illustriamo la preparazione del campione pe...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato dal Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC) - Programa Atracción de Investigadores Cienciactiva - Contract # 008-2017-FONDECYT.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Serie 77500 Freezone 4,5 Litri da bancoLabconco77500
Bruker Avance III 500 MHz dotato di una sonda criogenica TCI Z-gradient da 5 mmBruker Corporation
Concentratori centrifughi refrigerati Centrivap Labconco Serie 7310000Labconco7310000
Ossido di deuterioSigma-Aldrich151882
Macinatrice MKM6003BoschMKM6003
Licuadora Blender 8011S modello Hgb2wts3WaringHgb2wts3
Metanolo-d4Sigma-Aldrich151947

Riferimenti

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