Generazione, mantenimento e caratterizzazione di organoidi intestinali e del colon derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Summary

Qui vengono descritti metodi dettagliati per la generazione, il mantenimento e la caratterizzazione di organoidi intestinali e del colon derivati da cellule staminali pluripotenti umane. Questi metodi sono progettati per migliorare la riproducibilità, espandere la scalabilità e ridurre il tempo di lavoro necessario per la placcatura e il passaggio degli organoidi.

Abstract

La specificazione regionale intestinale descrive un processo attraverso il quale la morfologia e la funzione uniche vengono impartite ad aree definite del tratto gastrointestinale (GI) in via di sviluppo. La specificazione regionale nell'intestino è guidata da molteplici vie di sviluppo, tra cui la via della proteina morfogenetica ossea (BMP). Sulla base delle normali specifiche regionali, è stato sviluppato un metodo per generare organoidi del colon umano (HCO) da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), che includono cellule staminali embrionali umane (hES) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Un'induzione di tre giorni della segnalazione BMP modella sufficientemente le colture del tubo medio/posteriore in speciali HCO che esprimono la proteina legante la sequenza 2 (SATB2) ricca di AT contenente tutti i principali tipi di cellule epiteliali presenti nel colon umano e cellule mesenchimali in co-sviluppo. L'omissione del BMP (o l'aggiunta dell'inibitore del BMP NOGGIN) durante questo periodo critico di patterning ha portato alla formazione di organoidi intestinali umani (HIO). Gli HIO e gli HCO assomigliano morfologicamente e molecolarmente rispettivamente all'intestino tenue e al colon in via di sviluppo umano. Nonostante l'utilità di HIO e HCO per lo studio dello sviluppo intestinale umano, la generazione di HIO e HCO è impegnativa. Questo articolo presenta metodi per generare, mantenere e caratterizzare HIO e HCO. Inoltre, vengono forniti i passaggi critici del protocollo e i consigli per la risoluzione dei problemi.

Introduction

Studiare lo sviluppo del colon umano è difficile a causa delle restrizioni sull'uso del tessuto fetale umano. I modelli animali sono stati inestimabili e storicamente utilizzati per approcci genetici nei topi per studiare lo sviluppo intestinale. Tuttavia, le differenze tra lo sviluppo intestinale del topo e quello umano limitano l'applicabilità dei topi come sistema modello. Ad esempio, sebbene la formazione di cripte nell'intestino tenue e nel colon dei topi avvenga dopo la nascita, gli esseri umani nascono con cripte completamente formate¹. Inoltre, l'intestino tenue umano e il colon contengono tipi di cellu....

Protocol

1. Generazione di organoidi intestinali e del colon umani

1. Preparazione di piastre rivestite ECM
   1. Aggiungere 50 mL di terreno DMEM freddo in una provetta conica da 50 mL.
   2. Rimuovere un'aliquota di 4 ECM qualificati hESC (vedere la Tabella dei materiali) dal congelatore a -80 °C e scongelare con ghiaccio.
      NOTA: Fare riferimento al certificato di analisi del prodotto per determinare il volume di ECM qualificato ESC necessario per preparare un stock 4x.
   3. Se l'ECM qualificato hESC non è completamente scongelato, prelevare 750 μL di DMEM dalla provetta conica da 50 mL e mescolarlo....

Results

Il successo della generazione di sferoidi durante la fase di induzione dell'intestino medio/posteriore è indicativo del successo del patterning. Eseguire la colorazione IF per CDX2 su sferoidi flottanti e sul monostrato per confermare che il pattern sia corretto. Sebbene la colorazione allo stadio definitivo dell'endoderma (DE) possa indicare l'efficacia dell'induzione di DE, la generazione di sferoidi non è possibile senza un'efficiente induzione di DE. Per testare l'efficienza dell'induzione DE, eseguire la colorazione.......

Discussion

La differenziazione delle hPSC in HIO e HCO è un processo complesso che richiede controlli di qualità in ogni fase. Le hPSC iniziali devono avere una differenziazione minima prima di iniziare la differenziazione in DE. L'ottimizzazione della densità delle hPSC piastrate per la differenziazione DE è fondamentale per il successo del protocollo. Per garantire la qualità della differenziazione DE, eseguire IF per FOXA2 e SOX17 per determinare l'efficienza della differenziazione DE. La differ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione di albumina sierica bovina (BSA) all'1%	N/A	N/A	N/A
Provetta Corning da 15 mL	Falcone	21008-918	N/A
30% Saccarosio	N/A	N/A	Prodotto in PBS.
5% Siero d'asino normale	Laboratorio di immunoricerca Jackson	017-000-121	N/A
Provetta Corning da 50 mL	Falcone	21008-951	N/A
Accutase	Termo Scientifico	A1110501	Soluzione per il distacco delle cellule; aliquotare 5 mL di Accutase in provette da 10 mL per un totale di 20 provette e conservare a -20 ° C per un massimo di 6 mesi. Posto a 4 gradi C durante la notte prima dell'uso.
Activin A	Sistemi di guida delle celle	GFH6-100x10	Ricostituire la polvere liofilizzata a 100µ g/mL in PBS sterile contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA). Aliquot 38 µ L di Activina A in provette per microcentrifuga prerefrigerate e conservare a -80 gradi C (Le provette scadono 12 mesi dalla data di ricezione).
Activin Day 1 medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Utilizzare aminoacidi non essenziali (NEAA, Corning 11140050) e conservare a 4 °C. Terreno base giorno 1: 500 ml di RPMI 1640 e 500 ml di NEAA. Quando si prepara il terreno Activin Day 1, aggiungere 13 ml di terreno base Day 1, 13 µ l di Activina A (100 µ g/mL), e 2 µ l di BMP4 (100 µ g/mL). Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0,2% FBS vol/vol)	Clone	SH30070.03T	Utilizzare aminoacidi non essenziali (Corning 11140050) e conservare a 4 °C. Terreno base del giorno 2: 500 ml di RPMI 1640, 500 ml di NEAA e 1 ml di siero allo 0,2%. Quando si prepara il terreno Activin Day 2, aggiungere 12,5 ml di terreno base Day 2 e 12,5 µ L di Activina A (100 µ g/mL). Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Clone	SH30070.03T	Utilizzare aminoacidi non essenziali (Corning 11140050) e conservare a 4 °C. Terreno base del giorno 3: 500 ml di RPMI 1640, 500 ml di NEAA e 10 ml di siero al 2%. Quando si prepara il terreno Activin Day 3, aggiungere 12,5 ml di base Day 3 e 12,5 µ L di Activina A (100 µ g/mL). Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.
Alexa Fluor 488 Asino anti-Capra	Termo Scientifico	Codice A11055	Diluizione 1:500 (anticorpo secondario)
Alexa Fluor 488 Asino anti-Coniglio	Termo Scientifico	Codice A21206	Diluizione 1:500 (anticorpo secondario)
Alexa Fluor 546 Asino anti-Topo	Termo Scientifico	Codice A10036	Diluizione 1:500 (anticorpo secondario)
Alexa Fluor 647 Asino anti-Topo	Termo Scientifico	Codice: A31571	Diluizione 1:500 (anticorpo secondario)
Stampo di base	Pescatore	22-363-552	N/A
Terreno intestinale di base (DMEM avanzato)	Gibco	12491015	Quando si prepara il terreno intestinale di base, aggiungere 500 ml di DMEM, 500 ml di N2 (Gibco 17-502-048), 500 ml di B27 (Gibco), 500 ml di L-glutammina per ottenere 2 mM di L-glutammina (Corning A2916801), 5 ml di 100 U/mL di penicillina-streptomicina (Gibco 15-140-122) e 7,5 ml di L. 1 M HEPES per ottenere 15 mM HEPES. Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.
Sistema di rilevamento PCR in tempo reale Biorad CFX96 Touch	Biorad	N/A	È possibile utilizzare altri sistemi qRT-PCR.
Soluzione per il recupero delle cellule	Corning	354253	Soluzione di degradazione ECM
CHIR99021	Reprocell	4000410	Ricostituire aggiungendo 2,15 mL di DMSO a 10 mM. Preparare 50 µ L. aliquote e conservare a -20 °C. Conservare la polvere a 4 gradi C, protetto dalla luce.
CTRL HIO pattern medium	N/A	N/A	Terreno intestinale di base e 100 ng/mL di EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Diluizione 1:100 (anticorpo secondario)
DE monostrato	N/A	N/A	Il monostrato è stato generato nei passaggi precedenti (Sezione 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Risospendere la polvere liofilizzata in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) a una concentrazione finale di 1 mg/mL. Filtrare la soluzione per la sterilizzazione aspirando utilizzando un tubo di sterilizzazione con filtro Millipore. Preparare 10 mL di aliquote (1 mg/mL) e conservare a -20 ° C per un massimo di 6 mesi. Posto a 4 gradi C durante la notte prima dell'uso.
FEG	Termo Scientifico	236-EG-01M	Durante la preparazione di 100 ng/mL di EGF ricostituire 500 µ g/mL in PBS sterile. Quindi aggiungere 2 ml di PBS sterile a 1 mg di EGF e fare 500 µ g/mL di soluzione EGF. Aliquot 100 µ L di EGF in 20 provette.
Fisherbrand Piastre Petri da 6 cm con coperchio trasparente	Pescatore	FB0875713A	N/A
Fisherbrand Sollevatore di celle	Pescatore	08-100-240	N/A
Fisherbrand Fiale filettate in vetro trasparente Classe B con chiusure attaccate	Pescatore	03-338B	N/A
Fisherbrand Pipetta Pasteur monouso in vetro borosilicato	Pescatore	13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Carrello di montaggio medio	VWR	100241-874	N/A
DMEM avanzato Gibco	Gibco	12-491-023	N/A
Capra anti-E-Caderina	R& Sistemi D	AF648	Diluizione 1:400 (anticorpo primario)
Capra anti-SOX17	R& Sistemi D	AF1924	Diluizione 1:500 (anticorpo primario)
Mezzo di patterning HCO	N/A	N/A	Terreno intestinale di base, 100 ng/mL di EGF e 100 ng/mL di BMP2. Durante la preparazione di BMP2, aggiungere 1 mL di HCl 0,1% BSA sterile da 4 mM ai flaconcini di BMP2 (100 µ g). Aliquot 25 µ L di soluzione BMP4 in 4 provette. Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.
Emocitometro	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)	Struttura per cellule staminali pluripotenti	N/A	Cellule seminate in una piastra a 24 pozzetti rivestita Matrigel (Thermo Scientific 73520-906).
Soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% (PFA)	N/A	N/A	N/A
Soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS)	N/A	N/A	Il pH deve essere 7,4.
Penna barriera idrofobica ImmEdge	Laboratori Vector	101098-065	N/A
Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)	Struttura per cellule staminali pluripotenti (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)	N/A	È possibile utilizzare altre linee hESC o iPSC, ma il protocollo deve essere ottimizzato per ciascuna linea cellulare.
Microtomo Leica	N/A	N/A	N/A
LSM 880			microscopio confocale
Matrice della membrana basale Matrigel	Corning	354234	N/A
Matrigel Matrice qualificata hESC	Corning	354277	Preparare 4 aliquote di Matrigel che corrispondono a volumi sufficienti per produrre abbastanza Matrigel diluito per 4 piastre a 6 pozzetti.
Mezzo di induzione dell'intestino medio-posteriore (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Aminoacidi non essenziali (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µ M CHIR99021 e 500 ng/mL FGF4. Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.
Sferoidi medio-posteriori	N/A	N/A	N/A
MilliporeSigma Steriflip Unità filtranti sottovuoto monouso sterili	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Mouse anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	Diluizione 1:300 (anticorpo primario)
Topo anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	Diluizione 1:500
Terreno di coltura completo mTeSR1	Tecnologie delle cellule staminali	85870	Aggiungere 100 ml di integratore mTeSR (85870) in un terreno mTeSR da 400 ml (85870) e aliquotare in provette da 50 ml evitando la contaminazione. Negozio a 4 gradi C fino all'uso.
Soluzione Clear di Murray (nota anche come BABB)	Di Murray	N/A	benzoato benzilico 1:2 e alcool benzilico.
Mezzo di modellizzazione NOG HIO	N/A	N/A	Terreno intestinale di base, 100 ng/mL di EGF e 100 ng/mL di NOGGIN (Dispense 25 & micro; g di NOGGIN in 250 µ l. PBS sterile con 0,1% BSA).
RNA nucleospinato	Takara	740955.25	Possono essere utilizzati altri kit di isolamento dell'RNA.
Piatto per coltura tissutale di superficie Nunclon delta a 24 pozzetti (Nunc)	Termo Scientifico	73521-004	N/A
Piastra per coltura tissutale superficiale Nunclon delta a 24 pozzetti rivestita con Matrigel	Termo Scientifico	73521-004	N/A
Piatto per coltura tissutale di superficie Nunclon delta a 6 pozzetti (Nunc)	Termo Scientifico	73520-906	N/A
Piatto di coltura tissutale superficiale Nunclon delta a 6 pozzetti rivestito con  Matrigel.	Termo Scientifico	73520-906	N/A
Terreno di crescita per HIO, CTRL HIO e HCO	N/A	N/A	Terreno intestinale basico e 100 ng/mL di EGF (concentrazione finale)
Soluzione salina tampone fosfato, 0,5% Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Primer	Tecnologie del DNA integrate, Inc. (IDT)	N/A	I primer sono elencati nella Tabella 2 del protocollo.
Coniglio anti-CDX2	Marchio Cella	EPR22764Y	Diluizione 1:100 (anticorpo primario)
Coniglio anti-SATB2	Marchio Cella	Codice: EP281	Diluizione 1:100 (anticorpo primario)
Proteina BMP-4 umana ricombinante	R& Sistemi D	314-BP-010	Ricostituire la polvere liofilizzata a 100µ g/mL in 4 mM di HCl sterile contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA). Aggiungere 4,17 mL di soluzione di HCl a 45,83 mL di acqua molecolare per un totale di 50 mL di 1 M HCl. Quindi aggiungere 200 µ L di 1 M HCl a 49,8 mL di acqua di grado molecolare per un totale di 50 mL di 4 mM HCl. Quindi aggiungere 0,05 g di BSA a 50 mL di HCl da 4 mM e filtrare per renderlo sterile. Aliquotare sterile 4 mM HCl 0,1% BSA in 33 provette per microcentrifuga e conservare a -20 °C. Aggiungere 100 °C; l di 4 mM HCl 0,1% BSA sterili nei flaconcini BMP4 (10 µ g) realizzare la soluzione BMP4 a 100 µ g/mL.
Proteina umana ricombinante FGF-4	R& Sistemi D	235-F4-01M	Ricostituire a 100 µ g/mL in PBS sterile contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina. Aggiungere 0,05 g di BSA in 50 ml di PBS per ottenere lo 0,1% di BSA. Filtro 0,22 & micro; M BSA per sterilizzare il BSA. Aliquotare 10 mL di BSA allo 0,1% in 5 provette. Aggiungere 1 mg di FGF-4 in 10 mL di BSA sterile allo 0,1%. Aliquot 250 µ L in 40 provette per microcentrifuga prerefrigerate e conservare a -80 °C.
Inibitore ROCK Y-27632	Tocris	1254	La concentrazione finale è di 10 mM (10 mmol/L). Risospendere in DMSO a 10 mM e sterilizzare con filtro. Aggiungere 3 mL di PBS sterile in ogni flaconcino. Aliqout 100 µ L di inibitore ROCK in 30 provette e conservare a -20 °C.
Kit di sintesi cDNA SuperScript VILO	Termo Scientifico	11-754-250	N/A
Vetrini per microscopio SuperFrost Plus
Tessuto Tek O.C.T Compound	VWR	25608-930	N/A