Isolamento dell'estratto nucleare attivo di Caenorhabditis elegans e ricostituzione per la trascrizione in vitro

Summary

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare l'estratto nucleare attivo dallo stadio larvale 4 C. elegans e visualizzare l'attività di trascrizione in un sistema in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans è stato un importante sistema modello per la ricerca biologica da quando è stato introdotto nel 1963. Tuttavia, C. elegans non è stato pienamente utilizzato nello studio biochimico delle reazioni biologiche utilizzando i suoi estratti nucleari come la trascrizione in vitro e la replicazione del DNA. Un ostacolo significativo per l'uso di C. elegans negli studi biochimici è interrompere la spessa cuticola esterna del nematode senza sacrificare l'attività dell'estratto nucleare. Mentre diversi metodi sono usati per rompere la cuticola, come l'omogeneizzazione di Dounce o la sonicazione, spesso portano all'instabilità delle proteine. Non esistono protocolli stabiliti per isolare proteine nucleari attive da larve o C. elegans adulti per reazioni in vitro . Qui, il protocollo descrive in dettaglio l'omogeneizzazione dello stadio larvale 4 C. elegans utilizzando un omogeneizzatore Balch. L'omogeneizzatore Balch utilizza la pressione per forzare lentamente gli animali attraverso uno stretto spazio che rompe la cuticola nel processo. Il design uniforme e la lavorazione precisa dell'omogeneizzatore Balch consentono una rettifica costante degli animali tra gli esperimenti. Il frazionamento dell'omogeneizzatore ottenuto dall'omogeneizzatore di Balch produce un estratto nucleare funzionalmente attivo che può essere utilizzato in un metodo in vitro per l'analisi dell'attività di trascrizione di C. elegans.

Introduction

Il piccolo nematode caenorhabditis elegans è un organismo modello semplice ma potente per affrontare una vasta gamma di questioni biologiche. Fin dalla sua introduzione nel 1963, i nematodi sono stati preziosi per rispondere a domande di neurobiologia, metabolismo, invecchiamento, sviluppo, immunità e ^genetica1. Alcune delle molte caratteristiche dell'animale che lo rendono un organismo modello ideale includono il breve tempo di generazione, l'efficacia dell'interferenza dell'RNA, il corpo trasparente e le mappe completate sia del suo lignaggio cellulare che del sistema nervoso.

Mentre i contributi del nemat....

Protocol

1. Preparazioni dei media

1. Preparare piastre di agar sterili in brodo di lisogenesi (LB) e fluidi liquidi seguendo le istruzioni del produttore.
2. Striscia Escherichia coli (E. coli) ceppo OP50 su una piastra di agar LB. Incubare la striscia batterica a 37 °C durante la notte.
3. Conservare la piastra striata di E. coli OP50 a 4 °C dopo l'incubazione. La piastra E. coli OP50 può essere conservata in modo sicuro a 4 °C per 2 settimane se avvolta in parafilm per evitare la perdita di umidità.
4. Preparare 2 L di Nematode Growth Media (NGM) utilizzando la ricetta nella Tabella 1.
   NOTA:....

Results

Seguendo i passaggi delineati dovrebbe produrre estratto nucleare funzionale (Figura 1), la deviazione nelle fasi di macinazione o lavaggio può portare a scarsa attività o bassi rendimenti. Se si ottiene un estratto nucleare funzionale di C. elegans , trascriverà la regione a valle del promotore CMV sul modello di DNA quando aggiunto al test in vitro precedentemente descritto. Il trascritto di RNA risultante può essere purificato dalle prot.......

Discussion

C. elegans è un organismo modello attraente per studiare il sistema di trascrizione eucariotica a causa del suo basso costo di manutenzione e della facilità di manipolazione genetica. Qui viene descritto un protocollo per l'isolamento coerente dell'estratto nucleare funzionalmente attivo da L4 C. elegans . Sebbene questo protocollo si concentrasse sulla visualizzazione dell'attività di trascrizione, il cDNA prodotto post-trascrizionalmente può essere quantificato utilizzando RT-qPCR per ottenere una mis.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiali di consumo e reagenti
0,2 mL Provette a 8 strisce e Tappi a striscia piatta, trasparenti	Genesee Scientific	24-706
Provette PCR singole da 0,2 mL	Genesee Scientific	24-153G
1,7 mL microprovette sterili	Genesee Scientific	24-282S
100% etanolo di grado molecolare assoluto	Fisher Scientific	BP2818
100% etanolo, Koptec	Decon Labs	V1001
pipetta sierologica da 10 mL	VWR international	89130-898
Piastre di Petri da 150 mm	Tritech Research	T3325
Provette da centrifuga coniche da 15 mL	Genesee Scientific	28-103
Siringhe in plastica da 20 mL Fisher	Scientific	14955460
Siringhe Norm-Ject da 2 mL	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
Tazza filtrante sottovuoto da 500 mL 0,22 & micro; m PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
provette da centrifuga coniche da 50 mL	ThermoFisher Scientific	339652
pipetta sierologica da 50 mL	VWR international	89130-902
pipetta sierologica da 5 mL	VWR international	89130-896
Agar, Criterio	VWR International	C7432
Agarosio	Denville Scientific	CA3510-6
Marcatore a prova di alcool	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Dicloruro di calcio	Millipore Sigma	C4901
Colesterolo	Millipore Sigma	C8667
Primer di clonazione delle tempie del DNA di controllo, Forward 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'
Primer di clonazione delle tempie del DNA di controllo, Forward 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'
Acqua
Ditiotreitolo	Invitrogen	15508-013
Colorante in gel di DNA, SYBR sicuro	Invitrogen	S33102
Mix di scale di DNA, O' righello genetico	Fisher Scientific	SM1173
Colorante a caricamento di DNA, 6x TriTrack	Fisher Scientific
DNasi, Baseline-ZERO	Lucigen
Ghiaccio
Escherichia coli OP50 ceppo	CGC	OP50
Acido acetico glaciale	Fisher Scientific	A38
Glicerolo	Millipore Sigma	G6279
Sistema di trascrizione in vitro con estratto nucleare HeLaLa, HeLaScribe	Promega	E3110
Soluzione Hepes, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Acido cloridrico 37%	Millipore Sigma	P0662
Candeggina ipoclorito	Clorox
LB Brodo	Millipore Sigma	L3022
Dicloruro di magnesio	Millipore Sigma	M8266
Solfato di magnesio	Millipore Sigma	M7506
Piatti di peso medio	Fisher Scientific	02-202-101
vetrini per microscopio, Vista vision	VWR International	16004-368
acqua di grado molecolare, Hypure	Hyclone Laboratories
Nistatina	Millipore Sigma	Sistema PCR N1638
, FailSafe con premiscela A	Lucigen
Cloruro di potassio	Millipore Sigma	P39111
Fosfato di potassio bibasico	Millipore Sigma	P3786
Fosfato di potassio monobasico	Millipore Sigma	P0662
Inibitore della proteasi, cocktail monouso Halt 100x	ThermoFisher Scientific	78430
kit per il dosaggio delle proteine, Qubit	ThermoFisher Scientific	. Kit di trascrizione inversa Q33211
, kit	dell'RNA	Sensiscript Qiagen
RNeasy micro kit	Qiagen	74004
Inibitore dell'RNasi	Applied Biosystems
Cloruro di sodio	VWR International	BDH9286-12KG
Idrossido di sodio	Millipore Sigma	1-09137
Filtro per siringa sterile con 0,2 & micro; m Membrana in polietersulfone	VWR international	28145-501
Saccarosio	VWR International	200-334-9
primer di trascrizione, Forward 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'
primer di trascrizione, Reverse 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipaggiamento
-20 incubatore C	ThermoFisher Scientific
20 ° incubatore C	ThermoFisher Scientific
37 ° incubatore C	Forma Scientific
4 C frigorifero	ThermoFisher Scientific-80
° Congelatore C	Autoclave Eppendorf
	Omogeneizzatore Sanyo
Balch, omogeneizzatore cellulare isobiotec	Vortexer da banco Isobiotec
	Scientific	2215365
Centrifuga, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuga, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Microscopio da dissezione, Leica M80	Fluorimetro Leica Microsystems
, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Sistema di imaging su gel, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Sistema gel	ThermoFisher Scientific
Blocco termico	VWR International	12621-048
Microcentrifughe, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipetta L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
pipetta Pipetta per	17014388		Rainin
17014391 pipetta L-20 XLS+, Pipet-Lite		Rainin
Piattaforma oscillante	VWR International
, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010