Method Article

Risonanza magnetica quantitativa della permeabilità endoteliale e della (dis)funzione nell'aterosclerosi

DOI:

10.3791/62724

⸱

December 17th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering and Imaging Sciences, King’s College London, 2BHF Centre of Excellence, Cardiovascular Division, King’s College London, 3Biochemistry and Molecular Biology Department, School of Chemistry, Complutense University, 4Radiology Department, School of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 5ANID - Millennium Science Initiative Program - Millennium Nucleus for Cardiovascular Magnetic Resonance, 6Academic Department of Vascular Surgery, Cardiovascular Division, King’s College London, 7Wellcome Trust and EPSRC Medical Engineering Center, King’s College London, 8Escuela de Ingeniería, Universidad Católica de Chile

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo sviluppato un metodo accurato, non invasivo e facile da usare per quantificare la permeabilità e la disfunzione endoteliale nelle arterie utilizzando la risonanza magnetica (MRI), chiamato qMETRIC. Questa tecnica consente di valutare il danno vascolare e il rischio cardiovascolare associato all'aterosclerosi in modelli preclinici e nell'uomo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie cardiovascolari sono le principali cause di morte in tutto il mondo. Un endotelio permeabile/permeabile e disfunzionale è considerato il primo marcatore di danno vascolare e si ritiene che guidi l'aterosclerosi. Un metodo per identificare questi cambiamenti in vivo sarebbe auspicabile in clinica. Gli strumenti basati sulla risonanza magnetica (MRI) e altre tecnologie hanno permesso una profonda comprensione del ruolo dell'endotelio nelle malattie cardiovascolari e del rischio in vivo. C'è, tuttavia, la necessità di approcci riproducibili e semplici per estrarre dati quantificabili che riflettono il danno endoteliale da un singolo studio di imaging. È stato sviluppato un flusso di lavoro MRI non invasivo, facile da implementare e quantitativo per acquisire e analizzare immagini che consentono la quantificazione di due biomarcatori di imaging del danno endoteliale arterioso (permeabilità/permeabilità e disfunzione). Qui, il protocollo descrive l'applicazione di questo metodo nell'arteria brachiocefalica di topi aterosclerotici ApoE-/- utilizzando uno scanner MRI clinico. In primo luogo, vengono descritti i protocolli di mappatura T1 per il miglioramento tardivo del gadolinio (LGE) e il recupero dell'inversione MOLLI (Modified Look-Locker Inversion Recovery) per quantificare la perdita endoteliale utilizzando una sonda legante l'albumina. In secondo luogo, vengono descritte le sequenze anatomiche e quantitative del flusso sanguigno per misurare la disfunzione endoteliale, in risposta all'acetilcolina. È importante sottolineare che il metodo qui descritto consente l'acquisizione di immagini 3D ad alta risoluzione spaziale con un'ampia copertura volumetrica, consentendo una segmentazione accurata delle strutture delle pareti dei vasi per migliorare la variabilità inter- e intra-osservatore e per aumentare l'affidabilità e la riproducibilità. Inoltre, fornisce dati quantitativi senza la necessità di un'elevata risoluzione temporale per la modellazione cinetica complessa, rendendolo indipendente dal modello e consentendo persino l'imaging di vasi altamente mobili (arterie coronarie). Pertanto, l'approccio semplifica e accelera l'analisi dei dati. Infine, questo metodo può essere implementato su diversi scanner, può essere esteso all'imaging di diversi letti arteriosi ed è clinicamente applicabile per l'uso nell'uomo. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per diagnosticare e trattare i pazienti con aterosclerosi adottando un approccio di medicina di precisione.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie cardiovascolari (CVD) rimangono la principale causa di mortalità e morbilità in tutto il mondo, rappresentando quasi un terzo dei decessi1 e la causa di disabilità permanenti che esercitano un elevato costo finanziario sui sistemi sanitari1. Tra le CVD, la cardiopatia ischemica e l'ictus sono causati principalmente da placche aterosclerotiche. L'aterosclerosi è una malattia multifattoriale; Tuttavia, un segno distintivo comune è il danno precoce delle cellule endoteliali vascolari che porta alla formazione, alla progressione e alle eventuali complicanze dell'aterosclerosi. Un endotelio vascolare intatto ha proprietà vasculo-protettive fondamentali2. L'endotelio regola la permeabilità vascolare controllando la traslocazione di cellule e molecole tra la circolazione sistemica e la parete del vaso; controlla il tono vascolare bilanciando la produzione di vasodilatatori (ad esempio, ossido nitrico, prostaciclina) e vasocostrittori (ad esempio, endotelina-1, angiotensina II); e ha anche proprietà anticoagulanti. Tuttavia, sia la funzione che la permeabilità delle cellule endoteliali possono deteriorarsi in presenza di fattori di rischio cardiovascolare (ad esempio, fumo, colesterolo alto, diabete, infiammazione sistemica, stress ossidativo) e da modelli emodinamici del flusso sanguigno. Un endotelio disfunzionale ha ridotto la vasodilatazione in risposta ai fattori di stress, aumentando di conseguenza la rigidità arteriosa. Inoltre, un endotelio permeabile/permeabile ha allargato le giunzioni strette tra le cellule adiacenti 3,4,5,6,7. Tale cambiamento si verifica sia sull'endotelio luminale che sui microvasi della placca di nuova formazione che appaiono fragili, permeabili e dismorfici8. Le cellule endoteliali permeabili fungono da punti di ingresso per le molecole e le cellule trasportate dal plasma, esacerbando il rischio di malattie cardiovascolari.

Sulla base di queste conoscenze, negli ultimi 15 anni, la permeabilità e la funzione endoteliale sono emerse come un promettente obiettivo terapeutico e di imaging per diagnosticare meglio i soggetti a rischio di malattie cardiovascolari e per valutare gli effetti di farmaci noti o nuovi. Tuttavia, l'imaging diretto e quantitativo della funzione dell'endotelio è limitato 9,10,11,12. Attualmente, gran parte dell'interpretazione della funzione endoteliale in vivo si basa su studi di dilatazione endoteliale-dipendente (FMD) in vasi periferici la cui funzione è modestamente correlata con il carico di aterosclerosi nei letti vascolari che causano eventi clinici 13,14,15. Solo un numero limitato di studi di imaging ha dimostrato un legame diretto tra disfunzione endoteliale e carico di aterosclerosi in vivo 9,10,11,12. Al contrario, approcci più accessibili basati sulla risonanza magnetica hanno consentito di ottenere una permeabilità endoteliale più ampia. L'utilizzo del miglioramento percentuale del segnale della parete del vaso dopo la somministrazione di agenti di gadolinio per risonanza magnetica ha fornito una misurazione semiquantitativa della permeabilità endoteliale16,17. Successivamente, lo sviluppo di protocolli dinamici con mezzo di contrasto (DCE) ha permesso una misurazione migliore e più quantitativa della permeabilità endoteliale vascolare. Parametri quantitativi come il tasso di stravaso del contrasto (Ktrans) e il volume microvascolare (Vρ) derivati dalla modellazione cinetica o dall'area sotto la curva (AUC), la pendenza, il tempo al picco e la concentrazione di picco estratti da metodi non modellati erano correlati non solo con la permeabilità endoteliale ma anche con la vascolarizzazione della placca 18,19,20. Tuttavia, l'applicazione del DCE vascolare rimane impegnativa nonostante i significativi progressi tecnici perché: (i) richiede sia un'elevata risoluzione spaziale (0,5-0,7 mm2) che temporale21 per una delineazione accurata della parete del vaso. Il campionamento della concentrazione di mezzo di contrasto nel sangue per calcolare la funzione di input arterioso richiede anche la modellazione cinetica, che porta a un compromesso tra la limitazione della copertura anatomica22,23 per ottenere una risoluzione temporale o viceversa24,25; (ii) l'analisi dei dati può richiedere una complessa modellazione farmacocinetica (ad esempio, Patlak vs. Tofts); (iii) fornisce una qualità dell'immagine limitata, una scarsa riproducibilità della scansione e una variabilità media tra e tra osservatori26,27. Pertanto, c'è ancora bisogno di approcci riproducibili e semplici per estrarre dati diretti e quantificabili di permeabilità e (dis)funzione endoteliale da singoli studi di imaging che potrebbero avere una migliore utilità clinica.

Qui, abbiamo sviluppato una risonanza magnetica non invasiva, facile da implementare e quantitativa per acquisire e analizzare immagini che consente la quantificazione diretta di due marcatori di danno endoteliale arterioso (permeabilità/permeabilità e disfunzione) utilizzando modelli preclinici di aterosclerosi in un'unica scansione. Il metodo è denominato Quantitativo MRI di EndoThelial peRmeabIlity and dysfunCtion (qMETRIC). Prevede l'acquisizione di protocolli di mappatura T1 di enhancement tardivo del gadolinio (LGE) e MOLLI (Modified Look-Locker Inversion Recovery) per quantificare la perdita endoteliale, dopo la somministrazione di una sonda intravascolare legante l'albumina; e acquisizione di sequenze di flusso sanguigno anatomiche e quantitative per misurare la disfunzione endoteliale, in risposta a un bolo di acetilcolina. Abbiamo dimostrato che qMETRIC rileva con precisione: la gravità dell'aterosclerosi e il rischio di complicanze; risposte al trattamento; e può essere adattato per l'uso nei pazienti 5,6,7. È importante sottolineare che il metodo qui descritto consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione spaziale per consentire una segmentazione accurata della parete del vaso per ridurre al minimo la distorsione inter/intra-osservatore e per aumentare l'affidabilità e la riproducibilità con un'ampia copertura anatomica. Infine, questo metodo può essere adattato per l'uso su diversi scanner e può essere esteso per visualizzare diversi letti arteriosi (anche arterie coronarie28). Il flusso di lavoro semplice rende questo approccio più accessibile alla comunità dell'imaging cardiovascolare.

Protocol

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Tutti i componenti di questo studio sono stati condotti in conformità con l'UK Animals (Scientific Procedures) Act, 1986, e con l'approvazione del King's College London Ethical Review Panel.

Il flusso di lavoro sperimentale è riassunto nella Figura 1.

1. Preparazione degli animali

  1. Indurre l'aterosclerosi somministrando ai topi ApoE-/- una dieta ricca di grassi contenente il 21% di grassi dallo strutto e lo 0,15% di colesterolo (wt/wt) in media per un massimo di 12 settimane.
  2. Caricare una siringa da insulina con ago da 29 G con il giusto volume di mezzo di contrasto (gadofosveset trisordium) per ottenere una dose di 0,03 mmol/kg. Mantenere il volume di iniezione tra 50 e 150 μl.
  3. Posizionare la gabbia su un termoforo impostato a 37 °C per preriscaldare l'animale e mantenere la temperatura corporea.
  4. Indurre l'anestesia posizionando il topo in una scatola di induzione rivestita con tessuti assorbenti. Regolare il flussometro al 3%-5% di isoflurano a 1 L/min di O2 per circa 3-5 minuti.
    NOTA: Garantire la corretta profondità dell'anestesia identificando il rallentamento della frequenza respiratoria, che dovrebbe diminuire a meno di 70 respiri al minuto (bpm).
  5. Confermare l'anestesia utilizzando il metodo del pizzicamento delle dita dei piedi (cioè la perdita del riflesso di ritiro al pizzicamento delle dita). Trasferisci l'animale in un supporto e inserisci il naso in un cono. Posiziona il supporto su un termoforo per mantenere la temperatura corporea degli animali.
  6. Mantenere l'anestesia, erogata attraverso il naso, impostando il flusso d'aria dell'anestesia nel supporto all'1%-2% di isoflurano a 1 L/min di O2.
  7. Applicare un unguento veterinario sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
  8. Posiziona l'animale prono o su un fianco e pulisci la coda con un tampone imbevuto di alcol. Individua una delle due vene della coda. Se necessario, riscalda la coda con una lampada UV per rendere più visibili le vene della coda.
  9. Inserire l'ago da insulina da 29 G parallelamente alla vena con lo smusso dell'ago rivolto verso l'alto. Iniettare delicatamente il volume della siringa preriempita contenente gadofosveset trisodico. Assicurarsi che non vi siano sanguinamenti nel sito di iniezione dopo aver estratto l'ago.
  10. Attendere 30 secondi per la circolazione di gadofosveset, quindi trasferire il mouse sul letto di risonanza magnetica.

2. Preparazione dello scanner per la risonanza magnetica (vedi Figura 1)

  1. Coprire il tavolo della risonanza magnetica con dei fazzoletti assorbenti.
  2. Posizionare la bobina del ricevitore ad anello singolo per risonanza magnetica sul letto per risonanza magnetica. Utilizzare una piattaforma per sollevare la bobina del ricevitore ed evitare il contatto diretto tra la bobina del ricevitore e il tavolo MRI.
  3. Fissare la bobina alla piattaforma utilizzando del nastro chirurgico.
  4. Posizionare e fissare il tubo collegato a una pompa di calore a circolazione attorno alla bobina e impostarlo a 37 °C per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante l'imaging.
  5. Posizionare il tubo di erogazione dell'anestesia nel foro dello scanner MRI e fissarlo con nastro adesivo in modo che il cono del naso raggiunga la punta della bobina del ricevitore dove verrà posizionata la testa dell'animale.
  6. Accendi la telecamera per monitorare l'animale dalla sala console.
  7. Nella sala console della risonanza magnetica, utilizzare l'interfaccia software per avviare un nuovo studio per l'animale (paziente).

3. Posizionamento degli animali nello scanner MRI e monitoraggio (vedi Figura 2)

  1. Trasferire l'animale anestetizzato nella sala scanner. Posizionare il mouse in posizione prona sulla bobina del ricevitore e assicurarsi che il suo muso si adatti al cono del naso per mantenere l'anestesia. Ruotare il flusso d'aria dell'anestesia all'1%-1,5% di isoflurano a 1 L/min di O2.
  2. Assicurarsi di posizionare l'animale sulla bobina della risonanza magnetica con le regioni del cuore e del collo situate al centro della bobina del ricevitore.
  3. Fissare il naso del topo nel cono del naso, nell'addome e nella coda del topo sulla piattaforma con del nastro adesivo.
  4. Posizionare quattro elettrodi sulle zampe anteriori e posteriori, assicurandosi che il palmo delle dita dei piedi sia completamente aperto per registrare l'elettrocardiogramma (ECG). Utilizzare il gel conduttivo ECG sulle zampe del mouse prima di collegare gli elettrodi ECG per migliorare la conduttività.
  5. Assicurarsi di utilizzare del nastro adesivo per fissare saldamente gli elettrodi alla piattaforma.
  6. Allineare il laser del letto dello scanner con la base (estremità prossimale) del cuore; Usa la clavicola e la linea della zampa anteriore come punto di riferimento. Posiziona l'animale nell'isocentro del magnete utilizzando una tabella RM automatica.

4. Pianificazione e acquisizione delle immagini MRI

  1. Avviare una scansione scout per eseguire le calibrazioni standard per il sistema MRI.
  2. Impostare l'apparecchiatura di monitoraggio in modo che rilevi l'onda R dell'ECG. Regolare le soglie per ciascun mouse e all'interno delle sessioni di imaging in modo da garantire un'attivazione affidabile.
    NOTA: La frequenza cardiaca del topo in anestesia profonda di solito varia tra 400 e 600 battiti al minuto (bpm).
  3. Acquisire una scansione 3D con eco gradiente (GRE) per ottenere immagini pilota multiplanari (immagini scout) per pianificare il resto delle scansioni (vedere la Tabella 1 per i parametri di acquisizione della risonanza magnetica e la Figura 3 per la pianificazione).
  4. Identifica il cuore sulle immagini scout, in particolare sulla vista coronale, più facilmente dai suoi artefatti di flusso.
    NOTA: Se le immagini mostrano che il mouse non è ben centrato sulla bobina o sull'isocentro, ritrarre il piano e ripetere il posizionamento.
  5. Pianificare un'angiografia RM 3D con mezzo di contrasto (MRA) (vedere la Tabella 1 per la scansione per i parametri di acquisizione della risonanza magnetica e la Figura 3 per la pianificazione) su un piano trasversale che si estende dalla base del cuore verso il collo e le arterie carotidi con un campo visivo (FOV) di 8 mm.
  6. Utilizzare le immagini di proiezione a massima intensità (MIP) per visualizzare l'arco aortico, le arterie brachiocefalica e carotide e pianificare il successivo aumento tardivo del gadolinio (LGE), la mappatura T1 e le scansioni cine (vedere la Figura 3 per le immagini rappresentative).
    NOTA: Se il livello del volume di imaging non è corretto, ripetere l'acquisizione spostando le fette prossimalmente o distalmente.
  7. Acquisizione di immagini MRI per misurare la permeabilità endoteliale.
    1. Utilizzare le immagini MIP e MRA trasversale acquisite in precedenza per pianificare l'acquisizione di una singola sezione 2D-Look-Locker (LL) perpendicolare all'aorta ascendente o alle arterie carotidi (vedere la Tabella 1 per la scansione per i parametri di acquisizione della risonanza magnetica e la Figura 3 per le immagini rappresentative).
    2. Impostare la frequenza cardiaca su 60 bpm quando si utilizza un segnale ECG simulato o impostare un periodo di blanking per garantire che l'impulso di recupero dell'inversione tra gli impulsi di recupero dell'inversione successivi sia di 1000 ms quando si utilizza il segnale ECG registrato.
    3. Utilizzare le immagini Look-Locker per determinare il tempo di inversione ottimale (TI) per l'annullamento del segnale ematico richiesto per la scansione LGE.
    4. Imaging LGE: dopo 20-30 minuti di iniezione di gadofosveset e subito dopo la scansione LL (descritta nei passaggi 4.7.1-4.7.3) acquisire una scansione LGE utilizzando una sequenza di eco a gradiente rapido 3D con recupero di inversione (vedere la Tabella 1 per i parametri di acquisizione della risonanza magnetica e la Figura 3 per le immagini rappresentative).
    5. Pianificare una scansione LGE con eco trasversale a gradiente rapido 3D per coprire la base del cuore (per includere parte della radice aortica), l'arteria brachiocefalica (tra la radice aortica e la biforcazione succlavia) e parte delle arterie carotidi con un campo visivo (FOV) di 8 mm nella direzione piede-testa utilizzando la stessa geometria della risonanza magnetica di cui sopra (vedere la Figura 3 per le immagini rappresentative).
    6. Impostare la frequenza cardiaca a 60 bpm, quando si utilizza un segnale ECG simulato, oppure impostare un periodo di blanking per garantire che gli impulsi di recupero dall'inversione successivi si verifichino ogni 1000 ms per la scansione LGE quando si utilizza il segnale ECG registrato (come per il passaggio 4.7.2 sopra).
      NOTA: Questo è importante per un recupero costante e indipendente dalla frequenza cardiaca della magnetizzazione tra impulsi di recupero di inversione successivi.
    7. Inserire il T1 ottenuto dal Look-Locker nella sequenza LGE in Contrasto > Ritardo di inversione.
    8. Imaging di mappatura T1: utilizzare un'acquisizione 3D di eco a gradiente rapido per acquisire immagini di mappatura T1 trasversali 45 minuti dopo l'iniezione di gadofosveset. Pianificare la sequenza con lo stesso orientamento e la stessa geometria della scansione LGE di cui sopra (vedere la Tabella 1 per i parametri di acquisizione della risonanza magnetica e la Figura 3 per le immagini rappresentative).
    9. Impostare la frequenza cardiaca su 120 bpm, quando si utilizza un ECG simulato, oppure impostare un periodo di blanking per garantire che l'impulso di recupero dell'inversione tra i due treni di imaging si verifichi ogni 500 ms quando si utilizza il tracciato ECG registrato.
      NOTA: La sequenza di mappatura T1 utilizza due impulsi di inversione non selettivi con tempi di inversione compresi tra 20 e 2000 ms, seguiti da otto letture segmentate per otto immagini singole. La combinazione delle due tracce di imaging si traduce in un totale di sedici immagini per fetta con tempi di inversione variabili. Le immagini vengono ricostruite automaticamente sullo scanner utilizzando un modello di adattamento a tre parametri. Le equazioni utilizzate per generare le mappe parametriche T1 sono:
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
  8. Acquisizione di immagini MRI per misurare la funzione endoteliale
    1. Preparare una soluzione di acetilcolina diluita in soluzione salina. Caricare una siringa da insulina con ago da 29 G con il giusto volume di soluzione per raggiungere (16,6 mg/kg). Mantenere il volume di iniezione tra 50 e 150 μl.
    2. Utilizzando l'MRA trasversale e le corrispondenti immagini MIP, posizionare una fetta trasversale attraverso l'arteria brachiocefalica, tra la radice aortica e la biforcazione succlavia (Figura 3 per le immagini rappresentative).
    3. Utilizzare un eco a gradiente trasversale 2D (GRE) con gating ECG retrospettivo per acquisire immagini cine temporalmente risolte dell'arteria brachiocefalica (vedere la Tabella 1 per i parametri di acquisizione della risonanza magnetica, la Figura 3 per le immagini rappresentative).
    4. Regola il numero massimo di fasi cardiache in base alla frequenza cardiaca di ciascun animale.
      NOTA: Tipicamente, 14 fasi cardiache forniscono una risoluzione temporale sufficiente.
    5. Dopo aver acquisito le immagini di base, entrare nella sala scanner MRI. Mentre il topo è anestetizzato nello scanner, iniettare delicatamente acetilcolina per via intraperitoneale (IP). Evitare di muovere il mouse sulla bobina.
    6. Attendere 6-10 minuti affinché la frequenza cardiaca si stabilizzi e ripetere l'acquisizione.
    7. Al termine della procedura di imaging, rimettere il mouse nella sua gabbia e posizionare la gabbia su un termoforo per il recupero.
      NOTA: I topi si riprendono quando riacquistano una coscienza sufficiente per mantenere la decubito sternale.
    8. Esporta le immagini acquisite in formato DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) e utilizza un software di analisi delle immagini a piattaforma aperta.

5. Segmentazione della risonanza magnetica e analisi dei dati (vedi Figura 4)

  1. Trascina e rilascia i file Dicom nel database di un software a piattaforma aperta per caricare tutte le immagini.
  2. Utilizza le immagini LGE per visualizzare l'assorbimento del contrasto nella parete del vaso e calcolare l'area di enhancement come marcatore surrogato della perdita di cellule endoteliali.
  3. Selezionare entrambe le scansioni MRA e di ripristino dell'inversione. Premere Invio per caricare queste immagini una accanto all'altra. Fare clic sulla piccola icona accanto al nome della scansione e trascinare e rilasciare le immagini MRA sulle immagini LGE.
  4. Selezionare l'opzione Ricampiona per ritagliare le immagini MRA utilizzando le immagini LGE come riferimento per tenere conto delle differenze nello spessore della sezione.
  5. Fare clic sulla piccola icona accanto al nome della scansione. Trascinare e rilasciare le immagini LGE sulle immagini MRA (come nel passaggio 5.4 precedente). Dal menu, scegliere Image Fusion per sovrapporre le immagini LGE e MRA.
  6. Dalla barra degli strumenti, fai clic su Visualizzatore 2D, quindi scegli Pannello di posizione 3D. Utilizzare i pulsanti per correggere manualmente gli spostamenti in piano per tenere conto di potenziali piccoli spostamenti dovuti alla respirazione degli animali.
  7. Usa lo strumento Poligono chiuso situato nella barra degli strumenti per segmentare manualmente il segmento visivamente migliorato della parete del vaso. Utilizza le immagini MRA e LGE co-registrate per guidare la segmentazione.
  8. Segmenta tutte le immagini LGE che racchiudono l'arteria brachiocefalica.
    NOTA: Se l'arricchimento della parete del vaso ha un aspetto diffuso o irregolare, segmentarli singolarmente in ciascuna fetta.
  9. Fai clic sul pulsante Plugin nella barra degli strumenti e scegli Strumenti ROI, quindi Esporta ROI per esportare l'area segmentata (mm2) per ogni regione di interesse (ROI) in un foglio di calcolo.
  10. Somma l'area di ciascuna fetta per calcolare l'area totale di enhancement nell'arteria brachiocefalica nel foglio di calcolo.
    NOTA: L'area totale di enhancement può essere utilizzata come marcatore quantitativo della permeabilità endoteliale.
  11. Utilizzare le mappe T1 generate automaticamente sul computer dello scanner MRI per calcolare il valore medio di T1 della parete del vaso che riflette la quantità di assorbimento di gadofosveset nella parete del vaso: questo è un altro marcatore quantitativo della permeabilità endoteliale.
  12. Caricare le immagini della mappa MRA e T1 e seguire un approccio simile a quello descritto sopra (passaggi 5.3-5.9) per segmentare la parete del vaso ed estrarre i valori T1 (ms).
  13. In un foglio di calcolo, invertire i valori T1 e moltiplicarli per 1000 per calcolare il tempo di rilassamento R1 = 1/T1 in secondi. Calcolare la media R1 per tutte le fette che coprono l'arteria brachiocefalica in ciascun animale.
  14. Caricare le immagini dell'angiografia a contrasto di fase e le mappe di velocità per calcolare le variazioni nell'area del vaso e la velocità del flusso sanguigno, rispettivamente, durante il ciclo cardiaco.
  15. Segmentare entrambe le immagini acquisite prima e dopo l'iniezione di acetilcolina per calcolare la vasoreattività endoteliale-dipendente, un marcatore surrogato della (dis)funzione endoteliale.
  16. Utilizzare lo strumento semi-automatico Regione di crescita disponibile nella scheda ROI o utilizzare l'opzione Poligono chiuso disponibile nella barra degli strumenti (come descritto nel passaggio 5.7) per segmentare l'area del lume (mm2) dell'arteria brachiocefalica nelle immagini angiografiche.
    NOTA: Lo strumento semi-automatico utilizza la soglia dei pixel per raggruppare i pixel che comprendono il pool sanguigno in base all'intensità del segnale.
  17. Utilizzare lo strumento Chiudi poligono per segmentare le mappe codificate della velocità del flusso sanguigno corrispondenti per calcolare la velocità del flusso sanguigno (cm/s).
  18. Esporta l'area del lume (mm2) e la velocità del flusso sanguigno (cm/s) in un foglio di calcolo (come descritto al passaggio 5.9) e identifica quelle che corrispondono alle fasi cardiache telediastolica (area massima) e telesistolica (area minima).
  19. Utilizzare il foglio di calcolo tabulato per calcolare la vasodilatazione endotelio-dipendente (calcolare la variazione percentuale dell'area del lume telediastolico (DE) e della velocità del flusso sanguigno prima e dopo l'iniezione di acetilcolina). Utilizzare le seguenti formule:
    cambio area= figure-protocol-3
    Variazione del flusso= figure-protocol-4
  20. Per ogni animale, tabulare i dati corrispondenti derivati dalle immagini LGE, dalle mappe T1 e dal test dell'acetilcolina nel software statistico per l'analisi.

Results

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In questo rapporto, viene dimostrata l'applicazione di un metodo MRI Quantitativo per misurare lapatogenicità ela (dis)funzione (qMETRIC) nell'arteria brachiocefalica di topi aterosclerotici ApoE-/-. Questo metodo fornisce dati diretti e quantificabili di due marcatori di danno endoteliale: permeabilità e (dis)funzione, che possono essere estratti da scansioni della parete dei vasi in vivo acquisite all'interno di una singola sessione di imaging. In primo luogo, le LGE vengono utilizzate per misurare l'area di miglioramento della parete del vaso (mm3) e le mappe T1 (o R1) vengono utilizzate per quantificare il tasso di rilassamento della parete del vaso (s-1) dopo la somministrazione di gadofosveset, entrambi marcatori surrogati di permeabilità (vedere la Figura 5 per risultati rappresentativi). Il tasso di rilassamento della parete del vaso R1 variava da 2,42 s-1 ± 0,35 s-1 a 3,45 s-1 ± 0,54 s-1 a 3,83 s-1 ± 0,52 s-1 rispettivamente a 4 settimane, 8 settimane e 12 settimane di una dieta ricca di grassi. Al contrario, i topi wild-type (R1 = 2,15 ± 0,34 s-1) e i topi ApoE-/- trattati con statine (R1 = 3,0 ± 0,65 s-1) hanno mostrato un miglioramento minore. Nei topi ApoE-/- alimentati con una dieta ricca di grassi per un massimo di 12 mesi, lo studio mostra con l'analisi istologica, il colorante blu di Evans e la microscopia elettronica che la permeabilità endoteliale aumenta durante la progressione dell'aterosclerosi, il che era in accordo con l'aumento del volume della parete del vaso LGE, l'aumento del cambiamento nella riversività della parete del vaso R1 e la vasocostrizione paradossale dopo l'iniezione di acetilcolina5. Al contrario, le statine e altri trattamenti mirati all'endotelio hanno ridotto la permeabilità endoteliale e le dimensioni della placca, che si sono riflesse in un volume LGE più piccolo, valori R1 più bassidi 5,7 e una migliore vasodilatazione. Meccanicisticamente, gadofosveset si lega in modo reversibile all'albumina sierica. Ciò si traduce in un aumento di 5-6 volte della rilassività T1 della sonda29, rendendola rilevabile dalla risonanza magnetica con elevata sensibilità. Qui, lo studio mostra che, legato all'albumina, l'assorbimento della sonda riflette la permeabilità endoteliale perché è correlato con l'assorbimento del colorante blu di Evan - un metodo gold standard ex vivo per quantificare la perdita endoteliale (Figura 5) - e giunzioni più larghe a fessura stretta5. In secondo luogo, è stato dimostrato un semplice test per misurare la (dis)funzione endoteliale, in risposta all'acetilcolina. Nei vasi di controllo, l'acetilcolina provoca un rilassamento vascolare endotelio-dipendente che porta ad un aumento dell'area/volume arterioso e del flusso sanguigno. Per misurare la (dis)funzione endoteliale, sono state utilizzate immagini angiografiche attivate dall'ECG acquisite prima e dopo la somministrazione di acetilcolina. Lo studio calcola la variazione dell'area telediastolica (o volume) del lume del vaso prima e dopo la somministrazione di acetilcolina. È stato riscontrato che, a differenza dei vasi normali che vasodilatano in risposta all'acetilcolina, i vasi aterosclerotici dimostrano una ridotta funzione vasodilatatoria endoteliale-dipendente che si manifesta con una ridotta variazione dell'area (o del volume) del vaso o addirittura con una vasocostrizione paradossale del vaso (Figura 5). È interessante notare che il trattamento con statine ha migliorato le proprietà vasodilatatorie dell'endotelio13.

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Figura 1: Flusso di lavoro per l'imaging della permeabilità endoteliale e della (dis)funzione nei topi aterosclerotici. (A-B) I topi vengono prima anestetizzati e poi iniettati con l'agente di contrasto albumina. (C) I topi vengono quindi trasferiti su una bobina di risonanza magnetica, dove vengono utilizzati i cuscinetti ECG per monitorare l'attività cardiaca. (D-E) Le immagini MRI vengono acquisite per quantificare la permeabilità endoteliale e la (dis)funzione che vengono successivamente analizzate utilizzando un software a piattaforma aperta (creato con BioRender.com). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Posizionamento degli animali e monitoraggio ECG per l'imaging della permeabilità e della (dis)funzione endoteliale utilizzando uno scanner MRI clinico da 3 Tesla. (A-B) L'animale viene posizionato prono su una bobina superficiale e mantenuto anestetizzato utilizzando isoflurano inalabile. I sacchi di sabbia vengono utilizzati per stabilizzare la piattaforma di imaging. (C-D) Gli elettrodi ECG vengono posizionati sulle zampe e collegati a un modulo ECG clinico per registrare l'attività cardiaca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Pianificazione della risonanza magnetica e acquisizione di immagini per quantificare la permeabilità endoteliale e la (dis)funzione nell'arteria brachiocefalica di topi aterosclerotici. (A) Le immagini scout vengono acquisite per identificare la regione anatomica tra la radice aortica e le arterie carotidi. (B) L'angiogramma RM viene utilizzato per visualizzare la vascolarizzazione e pianificare le scansioni successive. (C) Le immagini Look-Locker vengono acquisite a livello dell'arteria brachiocefalica per determinare il ritardo di tempo adatto ad annullare il segnale dal sangue nelle successive immagini di potenziamento del gadolinio (LGE). (D) Le immagini LGE forniscono una valutazione visiva del miglioramento della parete del vaso. (E) La mappatura T1 viene utilizzata per calcolare il tasso di rilassamento della parete del vaso che è indicativo della concentrazione di gadolinio. (F) Le proprietà vasodilatatrici endotelio-dipendenti della parete del vaso sono quantificate dopo la somministrazione di acetilcolina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Segmentazione e analisi delle immagini per quantificare la permeabilità endoteliale e la (dis)funzione nell'arteria brachiocefalica di topi aterosclerotici. (A) La parete del vaso viene segmentata manualmente sulle immagini LGE per quantificare l'area/volume di assorbimento del contrasto. (B) La parete del vaso viene segmentata sulla mappatura T1 per calcolare il tasso di rilassamento T1 della parete del vaso. (C) La parete del vaso segmentata sugli angiogrammi RM e sulle immagini codificate del flusso sanguigno viene utilizzata per studiare le proprietà vasodilatatrici della parete del vaso calcolando le variazioni delle variazioni nell'end-
area del lume diastolico (o volume) e flusso sanguigno dopo somministrazione di acetilcolina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Imaging quantitativo della permeabilità e della (dis)funzione endoteliale (qMETRIC) nei topi aterosclerotici. (A) Le immagini LGE e le mappe di rilassamento R1 mostrano un aumento dell'assorbimento dell'agente di contrasto legante l'albumina all'interno della parete del vaso durante la progressione dell'aterosclerosi e il miglioramento dopo il trattamento con statine. I dati di imaging sono corroborati dall'accumulo del colorante blu di Evan, un colorante legante l'albumina, ex vivo. (B) I cambiamenti nelle proprietà vasodilatatrici della parete del vaso, in risposta alla somministrazione di acetilcolina, consentono la quantificazione della vasodilatazione endoteliale-dipendente. I vasi di controllo vasodilatano, mentre i vasi aterosclerotici vasocostritto in risposta all'acetilcolina, suggestivo di danno endoteliale. Il trattamento con statine migliora il danno endoteliale. I termini "wks" e "HFD" nella figura rappresentano rispettivamente "settimane" e "dieta ricca di grassi". Questa cifra è stata modificata da Phinikaridou, A. et al.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Scansione / SequenzaParametri di acquisizione
Scansione scout / pilota3D, eco sfumato veloce
Trasversale: FOV = 50 mm x 27 mm x 14 mm, matrice = 96 x 52, risoluzione nel piano = 0,5 mm x 0,5 mm, spessore fetta = 0,5 mm, TR/TE = 15/6,1 ms, angolo di ribaltamento = 30°, medie = 1
Coronale: FOV = 200 mm x 102 mm x 14 mm, matrice = 336 x 173, risoluzione nel piano = 0,5 mm x 0,5 mm, spessore fetta = 0,5 mm, TR/TE = 12/6 ms, angolo di inversione = 30°, medie = 1
Scansione MRAEco a gradiente rapido 3D, FOV = 30 mm x 30 mm x 8 mm, matrice = 200 x 200, risoluzione nel piano = 0,15 mm x 0,15 mm, spessore fetta = 0,5 mm, TR/TE = 15/6,1 ms, angolo di ribaltamento = 40°, medie = 1
Scansione di Look-LockerEco a gradiente rapido 2D, FOV = 30 mm x 30 mm, matrice = 80 x 80, risoluzione nel piano = 0,38 mm x 0,38 mm, spessore della fetta = 2 mm, TR/TE = 19/8,6 ms, TR tra impulsi IR successivi = 1000 ms e angolo di inversione = 10°, medie = 1.
Scansione LGEEco a gradiente rapido 3D, FOV = 30 mm x 30 mm x 8 mm, matrice = 304 x 304, risoluzione nel piano = 0,1 mm x 0,1 mm, spessore della fetta misurata = 0,5 mm, fette = 32, TR/TE = 28/8 ms, TR tra impulsi IR successivi = 1000 ms e angolo di inversione = 30°, medie = 1.
Scansione della mappatura T1Eco a gradiente rapido 3D, FOV = 36 mm x 22 mm x 8 mm, matrice = 192 x 102, risoluzione nel piano = 0,18 mm x 0,22 mm, spessore della fetta misurato = 0,5 mm, fette = 16, TR/TE = 9,6/4,9 ms, angolo di capovolgimento = 10°, medie = 1.
Scansione angiografica con contrasto di fase2D, eco a gradiente rapido, FOV = 40 mm x 23 mm, matrice = 132 x 77, risoluzione nel piano = 0,3 mm x 0,3 mm x 1 mm, TR/TE = 9,8/4,9 ms, angolo di ribaltamento = 30°, fasi cardiache = 14, medie = 6, velocità del flusso (direzione piede-testa) = 30 cm/s.

TABELLA 1: Parametri di acquisizione della risonanza magnetica

Discussion

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La determinazione della salute dell'endotelio vascolare è un interessante biomarcatore di imaging che può essere potenzialmente utilizzato per diagnosticare il rischio correlato all'aterosclerotica e per monitorare gli effetti del trattamento. Il protocollo qMETRIC qui descritto può essere utilizzato per quantificare in modo riproducibile la permeabilità/perdita endoteliale e la (dis)funzione in un protocollo di risonanza magnetica completo, veloce e clinicamente applicabile. Tale approccio può fornire un'alternativa più semplice o uno strumento complementare ai protocolli DCE-MRI esistenti per quantificare la permeabilità endoteliale. Può anche fornire uno strumento non invasivo per la valutazione diretta della (dis)funzione endoteliale nei letti vascolari, come le arterie coronarie e carotidi, invece di utilizzare tecniche invasive o misurazioni surrogate nelle arterie periferiche che sono meno gravemente colpite dalla malattia. La misurazione della permeabilità endoteliale utilizzando questo metodo consente la copertura dell'aorta, dell'arco aortico e delle arterie brachiocefalica e carotide ad alta risoluzione spaziale (0,1 mm per le immagini LGE e 0,22 mm per la mappatura T1) che è fondamentale per una segmentazione accurata della parete del vaso nei roditori. L'analisi delle immagini può essere effettuata utilizzando una piattaforma open-source e richiede solo una semplice segmentazione della parete del vaso senza la necessità di complessi modelli farmacocinetici. È importante sottolineare che questo protocollo può essere adattato per essere utilizzato in una serie di diversi scanner disponibili in commercio e può essere esteso per essere utilizzato in diversi modelli animali e anche nell'uomo. Sebbene questo protocollo descriva la metodologia utilizzando una configurazione di scanner clinico, i protocolli MRI possono essere implementati anche quando si utilizzano scanner per piccoli animali ad alto campo. Questi scanner offrono spesso protocolli di recupero dell'inversione, mappatura T1 e angiografia che possono essere utilizzati o programmati in collaborazione con i produttori di scanner.

Per ottenere risultati accurati e riproducibili, è necessario prestare particolare attenzione ad alcuni passaggi critici del protocollo. In primo luogo, quando si esegue l'imaging di piccoli animali in uno scanner clinico, sono necessarie bobine riceventi adatte e personalizzate per massimizzare il rapporto segnale/rumore per un'elevata qualità dell'immagine. Anche il posizionamento dell'animale sulla bobina è fondamentale, evitando la separazione e gli spazi pieni d'aria tra l'animale e la bobina per migliorare il rapporto segnale/rumore. Per questo motivo, l'area anatomica di interesse dovrebbe essere posizionata al centro della bobina, e poi spostata all'isocentro del magnete per esporli al campo magnetico con la massima omogeneità. In secondo luogo, un segnale ECG stabile, forte e accurato è fondamentale per l'attivazione/gating affidabile dell'imaging. Ciò è importante per l'eccitazione costante della magnetizzazione e la temporizzazione della finestra di acquisizione dell'immagine in punti temporali specifici e per l'acquisizione di immagini accurate risolte nel tempo che includono la fase telediastolica per il test funzionale. Gli elettrodi basati su cuscinetti o aghi per piccoli animali sono opzioni più adatte se utilizzati su scanner con intensità di campo più elevata, che sono meglio schermati rispetto agli scanner clinici. Quando queste opzioni vengono utilizzate negli scanner da campo clinico, i cavi ECG devono essere deformati insieme per evitare la formazione di circuiti risonanti alla frequenza del lamour della risonanza magnetica che potrebbero deteriorare il segnale ECG durante la sequenza di impulsi. In alternativa, proponiamo l'uso del modulo ECG e dei pad utilizzati per le scansioni umane con regolazione delle dimensioni del pad a quella della zampa del mouse e stabilizzazione extra dei pad con nastro adesivo per migliorare la conduttività. In terzo luogo, quando si acquisiscono immagini LGE mentre l'agente di contrasto è ancora in circolazione nel flusso sanguigno, è fondamentale scegliere il tempo di annullamento corretto per sopprimere in modo efficiente il pool sanguigno per delineare la parete del vaso. Prima di ogni sequenza LGE è necessario eseguire una sequenza Look-locker e il tempo di ritardo dell'inversione deve essere regolato di conseguenza. In quarto luogo, per una mappatura accurata e precisa del T1 utilizzando una sequenza modificata di recupero dell'inversione look-locker (MOLLI), lo schema di acquisizione dell'immagine proposto dovrebbe essere implementato in modo da coprire una gamma di ritardi di inversione che vanno da almeno 20 ms a 2000 ms per catturare le specie T1 corte e lunghe. Infine, la segmentazione dei dati della risonanza magnetica deve essere rigorosa e devono essere applicati criteri rigorosi per evitare distorsioni intra e/o inter-osservatore nei calcoli dell'area/volume e del valore T1.

A differenza della DCE-MRI, la procedura qui descritta non fornisce dati cinetici del wash-in e del wash-out dell'agente di contrasto nella parete del vaso. Piuttosto, fornisce un'istantanea della permeabilità endoteliale in un momento specifico dopo l'iniezione dell'agente di contrasto legante l'albumina, gadofosveset. Tuttavia, i dati quantitativi estratti da questi punti temporali sono altamente correlati con altri coloranti all'albumina, come il colorante blu di Evan, che è considerato un gold standard per misurare la permeabilità endoteliale e l'aumento della larghezza della giunzione gap endoteliale. Meccanicisticamente, sia la frazione legata all'albumina che quella non legata di gadofosveset sono abbastanza piccole da passare attraverso le rotture nelle giunzioni endoteliali e portare all'aumento del segnale MRI. Inoltre, è possibile che la frazione non legata possa anche legarsi all'albumina intraplacca dopo che è entrata nella parete del vaso e provoca un aumento del segnale. È stato osservato che la ristabilività della parete del vaso è di r1≈17 mmol/L/s, quando gadofosveset viene iniettato a una dose clinica. Questo valore è più vicino a quello riportato per la frazione legata all'albumina (r1≈25 mmol/L/s) rispetto alla frazione libera (r1≈6,6 mmol/L/s)5,29.

Le applicazioni future di questo metodo di imaging includono studi scientifici di base in diversi modelli animali e altri segmenti arteriosi e l'uso di questo metodo per valutare le risposte biologiche ad agenti farmaceutici esistenti o nuovi. Gli studi possono essere eseguiti trasversalmente o longitudinalmente per raccogliere dati meccanicistici e di esito, rispettivamente. Il flusso di lavoro semplice rende questo approccio accessibile e clinicamente applicabile anche per l'uso negli esseri umani. L'adattamento di questo metodo per l'imaging delle arterie carotidi e periferiche umane è più imminente, ma l'applicazione di questo metodo per l'imaging delle arterie coronarie richiede ulteriori progressi nell'acquisizione delle immagini, nella ricostruzione e nella correzione del movimento che sono attualmente in fase di sviluppo30,31.

Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Siamo grati per il finanziamento a: (1) British Heart Foundation (A.P Early Career Development Fellowship, Project grant-PG/2019/34897 e R.M.B. Project and Programme grants PG/10/044/28343, RG/12/1/29262 e RG/20/1/34802); (2) il King's BHF Centre for Research Excellence RE/18/2/34213; (3) il Centro Wellcome EPSRC per l'ingegneria medica (NS/A000049/1); (4) il Ministero della Salute, tramite il National Institute for Health Research (NIHR), la Cardiovascular Health Technology Cooperative (HTC) e il Centro di ricerca biomedica completo, assegnato al Guy's & St Thomas' NHS Foundation Trust in collaborazione con il King's College di Londra e il King's College Hospital NHS Foundation Trust; (5) Agenzia cilena per la ricerca e lo sviluppo (ANID) - Programma di iniziativa scientifica del millennio - NCN17_129 e FONDECYT 1180525.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetilcolinaSigma AldrichA6625- 100G, 16,6 mg/kg
Apparecchiatura per anestesiaServizi di anestesiagenerale Servizi di anestesia generale Pompa
di circolazionedel riscaldamento ThermoFisher Scientific, USABOM: 152510101
ECG gel conduttivo (Nuprep)Waever and Company, USA10-30-T
Invivo, USAREF 0700-1002
Gadofosveset trisordium (Vasovist/ Ablavar)Lantheus Medical Imaging Inc, North Billerica, MA, USA0,03 mmol/kg
Dieta ricca di grassiSpecial Diets Services, Witham, Regno Unito21% di grassi da strutto, 0,15% (peso/peso) colesterolo
Scatola di induzioneVet Tech Solutions LTD
Siringhe per insulinaBD Biosciences0,5 mL, 29 G
Software OsirixXFondazione OsiriX, Ginevra, SvizzeraPiattaforma open source
Philips Achieva MRI Scanner (3 Tesla)Philips Healthcare, Best, Paesi BassiDotato di un sistema di gradiente clinico (30 mT m-1, 200 mT m-1 ms-1)
Singolo– bobina ricevente per microscopia con superficie ad anelloPhillips HamburgDiametro = 23 mmCostruito su misura
Modulo di monitoraggio ECG

References

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