Misurazione del pH, delle sostanze chimiche redox e della capacità degradativa dei macropinosomi utilizzando la microscopia a doppio fluoroforo

Sommario

Descriviamo i protocolli per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la digestione delle proteine in singoli macropinosomi in cellule vive. L'accento è posto sulla microscopia a doppio fluoroforo ratiometrico e sui vantaggi che offre rispetto alle tecniche basate sulla popolazione.

Abstract

Negli ultimi anni, il campo della macropinocitosi è cresciuto rapidamente. La macropinocitosi è emersa come un meccanismo centrale attraverso il quale le cellule immunitarie innate mantengono l'omeostasi e l'immunità dell'organismo. Allo stesso tempo, e in contrasto con il suo ruolo omeostatico, può anche guidare varie patologie, tra cui il cancro e le infezioni virali. A differenza di altre modalità di endocitosi, gli strumenti sviluppati per studiare la maturazione dei macropinosomi rimangono sottosviluppati. Qui il protocollo descrive gli strumenti di nuova concezione per studiare l'ambiente redox all'interno del lume dei macropinosomi precoci e in maturazione. Vengono descritte le metodologie per l'utilizzo della microscopia a fluorescenza ratiometrica nella valutazione del pH, della produzione di specie reattive dell'ossigeno e della capacità degradativa all'interno del lume dei singoli macropinosomi nelle cellule vive. Le misurazioni di singoli organelli offrono il vantaggio di rivelare l'eterogeneità spaziotemporale, che spesso viene persa con approcci basati sulla popolazione. L'accento è posto sui principi di base della microscopia a doppio fluoroforo, tra cui la selezione della sonda, la strumentazione, la calibrazione e i metodi a singola cellula rispetto a quelli basati sulla popolazione.

Introduzione

La macropinocitosi si riferisce all'assorbimento di grandi quantità di fluido extracellulare in organelli citoplasmatici legati alla membrana chiamati macropinosomi^1,2. È un processo altamente conservato eseguito da organismi unicellulari viventi liberi, come l'ameba Dictyostelium spp. ³, così come antozoi⁴ e metazoi². Nella maggior parte delle cellule, la macropinocitosi è un evento indotto. La legatura dei recettori della superficie cellulare induce la protrusione delle estensioni della membrana plasmatica guidate dall'actina de....

Protocollo

1. Preparazione delle cellule

1. Coltiva cellule Raw264.7 a 37 °C e dal 5% di CO₂ al 70% di confluenza in RPMI integrato con il 10% di siero inattivato dal calore.
2. Un giorno prima del test, seminare raw264,7 cellule ad una densità di 5 x 10⁴ cellule per pozzetti in una piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che ogni pozzo contenga 100 μL di terreno di coltura. Assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti abbia lati neri e un fondo di vetro per l'imaging.
   NOTA: Qui, le piastre a 96 pozzi sono state utilizzate per l'imaging. Le piastre a 96 pozzetti consentono l'uso di piccole quantità di cellule e reagenti rispetto alle camere di imagi....

Risultati

Quando si misura il pH dei macropinosomi, c'è un periodo di tempo per il quale la dinamica dell'acidificazione non può essere misurata. Questo periodo corrisponde alla fase di carico destro (riquadro grigio in Figura 2C e Figura 3C,D)e varierà a seconda del tipo di cella utilizzata. La durata della fase di carico varierà con (i) l'attività macropinocitica delle cellule e (ii) la sensibilità dello strumento utilizzato. Si raccomanda di regolare q.......

Discussione

Sebbene esistano numerosi protocolli per misurazioni sia a basso che ad alto rendimento dell'assorbimento macropinocitico in macrofagi, fibroblasti e persino Dictyostelium spp. ^{3,7,31,32,33,}pochissimi tentativi sono stati fatti per misurare la biochimica luminale di questi compartimenti dinamici. Ciò è probabilmente dovuto a una scarsità di sonde che .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra a 96 pozzetti a parete nera	PerkinElmer	6005430
CypHer5e, estere NHS	Cytiva	PA15401
Dextran-amino 70 kDa	Invitrogen	D1862
DQ-ovalbumina	Invitrogen	D12053
FITC-destrano 70 kDa	Invitrogen	D1823
HBSS	Gibco	14287
Nigericin	Sigma Aldrich	N7143
OxyBurst Green-SE	Invitrogen	D2935
pHrodo Red, SE	Invitrogen	P36600
Raw264.7 celle	ATCC	TIB-71
RPMI medium	Gibco	11875093
SP5 Microscopio confocale	Leica	-
TRITC-destrano 70 kDa	Invitrogen	D1819
u-Dish	Ibidi	81156