Method Article

Registrazione di microelettrodi della velocità di attivazione dei nodi senoatriali per identificare i difetti intrinseci del pacemaking cardiaco nei topi

DOI:

10.3791/62735

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July 5th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo mira a descrivere una nuova metodologia per misurare la velocità di sparo cardiaca intrinseca utilizzando la registrazione di array di microelettrodi dell'intero tessuto del nodo senoatriale per identificare i difetti di pacemaking nei topi. Gli agenti farmacologici possono anche essere introdotti in questo metodo per studiare i loro effetti sul pacemaking intrinseco.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il nodo senoatriale (SAN), situato nell'atrio destro, contiene le cellule pacemaker del cuore e la disfunzione di questa regione può causare tachicardia o bradicardia. L'identificazione affidabile dei difetti cardiaci di pacemaking richiede la misurazione della frequenza cardiaca intrinseca prevenendo in gran parte l'influenza del sistema nervoso autonomo, che può mascherare i deficit di frequenza. I metodi tradizionali per analizzare la funzione intrinseca del pacemaker cardiaco includono il blocco autonomo indotto da farmaci per misurare le frequenze cardiache in vivo, le registrazioni cardiache isolate per misurare le frequenze cardiache intrinseche e le registrazioni a striscia sinoatriale o patch-clamp a singola cellula delle cellule pacemaker senoatriali per misurare le velocità di attivazione del potenziale d'azione spontanea. Tuttavia, queste tecniche più tradizionali possono essere tecnicamente impegnative e difficili da eseguire. Qui, presentiamo una nuova metodologia per misurare la velocità di sparo cardiaco intrinseco eseguendo registrazioni MEA (microelectrode array) di preparati di nodi senoatriali a montaggio intero da topi. I MEA sono composti da più microelettrodi disposti in uno schema a griglia per la registrazione in vitro di potenziali di campo extracellulare. Il metodo qui descritto ha il vantaggio combinato di essere relativamente più veloce, più semplice e più preciso rispetto agli approcci precedenti per la registrazione delle frequenze cardiache intrinseche, consentendo al contempo un facile interrogatorio farmacologico.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il cuore è un organo complesso governato da influenze sia cardiache intrinseche che estrinseche come quelle che hanno origine nel cervello. Il nodo senoatriale (SAN) è una regione definita nel cuore che ospita le cellule pacemaker (note anche come cellule senoatriali, o cellule SA) responsabili dell'inizio e della perpetuazione del battito cardiaco dei mammiferi1,2. La frequenza cardiaca intrinseca è la frequenza guidata dalle cellule pacemaker senza influenza da altre influenze cardiache o neuro-umorali, ma le misure tradizionali della frequenza cardiaca negli esseri umani e negli animali vivi, come gli elettrocardiogrammi, riflettono sia il pacemaker che le influenze neurali sul cuore. L'influenza neurale più notevole sulle cellule SA proviene dal sistema nervoso autonomo, che modula costantemente i modelli di attivazione per soddisfare i requisiti fisiologici del corpo3. A sostegno di questa idea, sia le proiezioni simpatiche che parasimpatiche possono essere trovate vicino alla SAN4. Il sistema nervoso cardiaco intrinseco (ICNS) è un'altra importante influenza neurale in cui il plesso ganglionato, in particolare negli atri destri, innerva e regola l'attività della SAN5,6.

Comprendere i deficit di pacemaking è clinicamente importante, poiché la disfunzione può essere alla base di molti disturbi cardiaci e contribuire al rischio di altre complicanze. La sindrome del seno malato (SSS) è una categoria di malattie caratterizzate da disfunzione del nodo senoatriale che impedisce il corretto pacemaking7,8. La SSS può presentarsi con bradicardia sinusale, pause sinusali, arresto sinusale, blocco di uscita senoatriale e bradiarritmie e tachiaritmiealternate 9 e può portare a complicazioni tra cui aumento del rischio di ictus embolico e morte improvvisa8,10. Quelli con sindrome di Brugada, un disturbo cardiaco caratterizzato da fibrillazione ventricolare con un aumentato rischio di morte cardiaca improvvisa, sono a maggior rischio di eventi aritmogeni se hanno anche una disfunzione SAN comorbidità11,12. La disfunzione senoatriale può anche avere conseguenze fisiologiche oltre il cuore. Ad esempio, È stato osservato che la SSS innesca convulsioni in un paziente a causa dell'ipoperfusione cerebrale13.

Per identificare i deficit di pacemaking senoatriale, le frequenze cardiache intrinseche devono essere determinate misurando l'attività della SAN senza l'influenza del sistema nervoso autonomo o di fattori umorali. Clinicamente, questo può essere approssimato dal blocco autonomo farmacologico14, ma questa stessa tecnica può essere applicata anche in modelli di mammiferi per studiare la funzione cardiaca intrinseca15,16. Mentre questo approccio blocca gran parte delle influenze neurali che contribuiscono e consente l'esame cardiaco in vivo, non elimina completamente tutte le influenze estrinseche sul cuore. Un'altra tecnica di ricerca utilizzata per studiare la funzione cardiaca intrinseca in modelli animali è la registrazione cardiaca isolata utilizzando cuori perfusi di Langendorff, che in genere comportano misurazioni utilizzando elettrogrammi, stimolazione o array multielettrodi epicardali17,18,19,20. Mentre questa tecnica è più specifica per la funzione cardiaca poiché comporta la rimozione del cuore dal corpo, le misurazioni possono ancora essere influenzate da meccanismi autoregolatori meccano-elettrici che potrebbero influenzare le misurazioni intrinseche della frequenza cardiaca21. Le registrazioni cardiache isolate possono anche essere ancora influenzate dalla regolazione autonomica attraverso l'ICNS5,6,22,23. Inoltre, il mantenimento di una temperatura fisiologicamente rilevante del cuore, che è fondamentale per le misurazioni della funzione cardiaca, può essere difficile negli approcci cardiaci isolati20. Un metodo più diretto per studiare la funzione SAN è quello di isolare specificamente il tessuto SAN e misurarne l'attività. Questo può essere realizzato attraverso strisce SAN (tessuto SAN isolato) o cellule pacemaker SAN isolate24,25. Entrambi richiedono un alto grado di formazione tecnica, poiché la SAN è una regione molto piccola e altamente definita, e l'isolamento cellulare rappresenta una sfida ancora maggiore in quanto la dissociazione può danneggiare la salute generale della cellula se non eseguita correttamente. Inoltre, queste tecniche richiedono competenze elettrofisiologiche esperte al fine di registrare con successo dal tessuto o dalle cellule utilizzando singoli microelettrodi di registrazione.

In questo protocollo, descriviamo una tecnica per registrare la SAN in vitro utilizzando un array di microelettrodi (MEA) per ottenere misurazioni intrinseche della frequenza cardiaca. Questo approccio ha il vantaggio di rendere le registrazioni elettrofisiologiche altamente specifiche accessibili ai ricercatori privi di competenze elettrofisiologiche intensive. I MEA sono stati precedentemente utilizzati per studiare la funzione dei cardiomiociti in colture primarie di cardiomiociti26,27, 28,29,30,31,32,fogli cardiaci33,34,35,36,37,38,39e supporti interi di tessuto40, 41,42,43,44,45,46,47. Il lavoro precedente è stato fatto anche per esaminare i potenziali di campo nel tessuto SAN41,42. Qui, forniamo una metodologia per utilizzare il MEA per registrare e analizzare i tassi di cottura intrinseci della SAN murina. Descriviamo anche come questa tecnica può essere utilizzata per testare gli effetti farmacologici dei farmaci sulle velocità di cottura intrinseche SAN fornendo un esperimento di esempio che mostra gli effetti della 4-aminopiridina (4-AP), un bloccante del canale K+ voltaggio-moggio. Utilizzando punti di riferimento anatomici definiti, possiamo registrare con precisione la SAN senza dover eseguire le estese dissezioni tissutali o gli isolamenti cellulari richiesti in altri metodi. Mentre il MEA può essere proibitivo in termini di costi, le registrazioni forniscono misure altamente specifiche e affidabili di pacemaking che possono essere utilizzate in una vasta gamma di applicazioni di ricerca clinica e fisiologica.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH), come approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Southern Methodist University.

1. Rivestimento dell'array multielettrode (MEA) per la registrazione

  1. Crea un buffer di borato da 25 mM.
    1. Sciogliere 0,953 g di Na2B4O7·10 H2O in 80 ml di acqua distillata.
    2. Regolare il pH a 8,4 con HCl e quindi aggiungere acqua distillata a un volume finale di 100 ml.
  2. Fare una soluzione stock al 0,1% di polietileneimmina (PEI).
    1. Aggiungere 100 μL di PEI al 50% (p/v) a 4,9 mL di acqua distillata per produrre una soluzione di PEI all'1%.
    2. Diluire la soluzione di PEI all'1% allo 0,1% in tampone borato aggiungendo 1 mL della soluzione di PEI all'1% a 9 mL del tampone borato da 25 mM.
  3. Pipettare ~1 mL della soluzione di PEI allo 0,1% nella parabola MEA (microelectrode array) in modo che gli elettrodi siano completamente coperti (Figura 1A e 1B).
    NOTA: I microelettrodi del MEA sono tipicamente composti da nanotubi di platino nero o carbonio e isolati con poliimmide (o acrilico); entrambi i materiali sono idrofobici. Rivestendo il MEA con un polimero cationico come il PEI, la superficie idrofobica DEL MEA viene resa più idrofila, consentendo ai campioni di tessuto di avere un migliore contatto con la superficie MEA (Figura 1A1).
  4. Coprire la teglia MEA con film termoplastico per ridurre l'evaporazione e lasciare il MEA durante la notte a temperatura ambiente (Figura 1C).
  5. Aspirare la soluzione di PEI dalla parabola MEA utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non toccare la griglia dell'elettrodo che può danneggiare gli elettrodi, quindi risciacquare ≥4 volte con acqua distillata (Figura 1D).
  6. Conservare il MEA rivestito in PEI sotto 1-2 ml di acqua ultrapura e sigillato con film termoplastico a 4 °C fino a quando necessario. In alternativa, conservare il MEA rivestito immergendolo in un becher riempito con acqua ultrapura (Figura 1E).
    NOTA: il processo di rivestimento PEI deve essere eseguito solo una volta per il MEA prima del suo primo utilizzo e, dopo ogni sessione di registrazione, il MEA deve essere conservato immerso in acqua ultrapura.

2. Preparazione della soluzione completa di Tyrode per la dissezione dei tessuti

  1. Produrre 1.000 ml di soluzione completa di Tyrode per la dissezione; in primo luogo, aggiungere 8,1816 g di NaCl a 800 ml di acqua ultrapura.
  2. Aggiungere la seguente quantità di sostanze chimiche alla soluzione: 0,4025 g di KCl; 0,1633 g di KH2PO4; 1,1915 g di HEPES; 0,9999 g di glucosio; 0,0952 g di MgCl2; 0,2646 g di CaCl2·2H2O.
  3. Regolare il pH a 7,4 con NaOH e quindi aggiungere acqua ultrapura fino a quando il volume totale è di 1.000 ml.
    NOTA: La composizione finale della soluzione di Tyrode completa sarà la seguente (in mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4,5 HEPES, 5,55 glucosio, 1 MgCl2,1,8 CaCl2.

3. Preparazione della soluzione di Tyrode ossigenata per la registrazione

  1. Produrre 500 ml di soluzione di Tyrode; aggiungere 4.003 g di NaCl a 400 ml di acqua ultrapura.
  2. Aggiungere le seguenti quantità di sostanze chimiche alla soluzione: 0,651 g di NaHCO3; 0,042 g di NaH2PO4; 0,132 g di CaCl2·2H2O; 0,149 g di KCl; 0,0476 g di MgCl2; 0,999 g di glucosio.
  3. Regolare il pH a 7,4 con HCl e quindi aggiungere acqua ultrapura fino a quando il volume totale è di 500 ml.
  4. Ossigenare la soluzione con carbogeno per almeno 30 minuti a temperatura ambiente prima di iniziare la registrazione.
    NOTA: La composizione finale della soluzione di Tyrode sarà la seguente (in mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1,8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glucosio. Questa soluzione di Tyrode ha una composizione leggermente diversa dalla soluzione di Tyrode completa utilizzata per la dissezione.

4. Preparazione della soluzione di 4-aminopiridina (4-AP) per la modulazione farmacologica

  1. Realizzare una soluzione di lavoro da 1 mM di 4-AP; aggiungere 18,82 mg di 4-AP a 200 ml di soluzione di Tyrode dal passaggio 3.
  2. Ossigenare la soluzione 4-AP per almeno 30 minuti prima dell'esperimento.

5. Preparare la capsula di Petri per la dissezione

  1. Mescolare i componenti in elastomero siliconico in un rapporto 10:1 (in peso) tra la base e l'agente polimerizzante.
  2. Versare ~ 15 ml di miscela di elastomero siliconico in una capsula di Petri di 60 mm di diametro.
  3. Lasciare polimerizzare l'elastomero a temperatura ambiente per 48 ore prima dell'uso.
    NOTA: La capsula di Petri siliconata può essere riutilizzata per future dissezioni.

6. Dissezione del nodo senoatriale (SAN)

  1. Preparare la soluzione completa di Tyrode eparinizzata per la dissezione SAN.
    1. Aggiungere 400 μL di eparina (1.000 USP/mL) a 40 mL di soluzione di Complete Tyrode e riscaldare a bagnomaria a 37 °C.
  2. Iniettare il topo per via intraperitoneale con 200-300 μL di eparina (1000 USP/mL) e lasciare riposare l'animale per 10 minuti.
  3. Eutanasia del topo eparinato per sovradosaggio di isoflurano.
    1. Posizionare il mouse in una piccola camera di vetro che contiene vapori di isoflurano generati aggiungendo 200-300 μL di isoflurano liquido a una carta da filtro all'interno di un tubo di plastica perforato.
      NOTA: Poiché l'isoflurano può causare irritazione cutanea e può anche essere assorbito attraverso la pelle, il liquido non deve contattare direttamente il mouse. Pertanto, la salvietta imbevuta di isoflurano viene posta in un tubo perforato per la somministrazione.
    2. Verificare la morte per cessazione del movimento e dello sforzo respiratorio e per l'assenza di un riflesso di pizzicamento della dita. La morte di solito richiede circa 1-2 minuti dopo il posizionamento nella camera.
      NOTA: La morte è di solito accompagnata da minzione.
  4. Posizionare il mouse in posizione supina su una scheda di dissezione con le zampe distese e fissare le zampe alla tavola utilizzando aghi per siringhe lunghe 1 pollice e calibro 23. Quindi rimuovere la pelliccia in prossimità del fondo della gabbia toracica usando forbici chirurgiche e tagliando la pelliccia alle radici.
    NOTA: per un comitato di dissezione, è possibile utilizzare coperchi di raffreddamento in polistirolo.
  5. Mentre si tiene la pelle con un mostato, utilizzare le forbici chirurgiche per praticare un'incisione trasversale nella pelle appena sotto il fondo della gabbia toracica da circa l'arco costale sinistro all'arco costale destro (Figura 3A).
  6. Tagliare il peritoneo con le forbici chirurgiche e separare accuratamente il fegato dal diaframma, facendo attenzione a non graffiare il fegato, che causerà un eccessivo sanguinamento (Figura 3B). Incidere il diaframma lungo il torace per esporre la cavità toracica (Figura 3C-D).
  7. Utilizzando le forbici chirurgiche, tagliare le pareti laterali della gabbia toracica dai bordi degli archi costali fino alle clavicola per esporre il cuore, facendo attenzione a evitare di danneggiare il cuore (Figura 3D). Quindi utilizzare un ago per siringa calibro 23 per fissare la gabbia toracica sopra la spalla, tenendola in posizione e fuori dal campo chirurgico.
  8. Utilizzare una pipetta di trasferimento per gocciolare la soluzione di Complete Tyrode eparinata a goccia (37 °C) sul cuore per mantenerlo umido.
    NOTA: Non lasciare asciugare il cuore.
  9. Rimuovere i polmoni tenendoli con una pinza Graefe extra fine e recidendo la trachea con forbici chirurgiche (Figura 3E).
  10. Tenere l'apice del cuore con una pinza Graefe extra fine e rimuoverla tagliando l'aorta e le vene cavae con forbici chirurgiche. Trasferire il cuore in una capsula di Petri contenente elastomero siliconico indurito (Figura 4A) e utilizzare una pipetta di trasferimento per bagnare il cuore con 2-3 mL di soluzione di Tyrode completa eparinata calda (37 °C).
    NOTA: Fare attenzione a non danneggiare la delicata parete posteriore degli atri destri, che contiene la SAN, e le vene atriali destre collegate. Bagnare il cuore con la soluzione di Complete Tyrode impedisce al cuore di asciugarsi, ma non immergere completamente il cuore in soluzione in quanto comprometterà la visibilità durante la dissezione.
  11. Orienta il cuore con l'atrio destro alla destra dello sperimentatore e l'atrio sinistro alla sinistra dello sperimentatore.
    NOTA: La dissezione del tessuto SAN deve essere eseguita rapidamente al fine di prevenire lesioni correlate all'ischemia.
  12. Attaccare l'apice del cuore al piatto con un perno di dissezione. Quindi, mentre si tiene la vena cava inferiore con dumont #2 pinna per laminectomia, inserire un ago siringa da 22 G attraverso la vena cava inferiore e superiore per individuare la loro posizione nell'atrio destro, che identifica anche la posizione approssimativa della SAN (situata nella zona di tessuto tra la vena cava inferiore e superiore (Figura 4B).
  13. Usando piccoli perni di dissezione, appuntare le appendici atriali sinistra e destra al piatto.
    1. Mentre tieni l'appendice atriale sinistra con Dumont #2 pinci per laminectomia, metti un perno di dissezione attraverso l'appendice atriale sinistra per tenerlo in posizione.
    2. Mentre tieni l'appendice atriale destra con Dumont #55 pina di forza, metti una spilla di dissezione attraverso l'appendice atriale destra per tenerla in posizione.
      NOTA: Lo stesso tipo di pinp può essere utilizzato per contenere le appendici atriali sinistra e destra, se lo si desidera.
  14. Rimuovere l'ago della siringa che attraversa le venae cavae.
  15. Per rilasciare il sangue dal cuore, utilizzare le forbici Castroviejo per rimuovere l'apice del cuore (cioè la metà inferiore) praticando un'incisione trasversale attraverso i ventricoli (Figura 4C). Quindi, lavare il cuore aggiungendo la soluzione di Complete Tyrode eparinata calda (37 °C) con una pipetta di trasferimento.
  16. Utilizzare le forbici Castroviejo per tagliare lungo il setto atrioventricolare mantenendo l'incisione più vicina al ventricolo rispetto agli atri. Continuare a tagliare lungo il setto atrioventricolare fino a quando gli atri sono separati dai ventricoli.
  17. Tagliare lungo il setto interatriale per rimuovere l'atrio sinistro.
  18. Posizionare i perni di dissezione nella periferia dell'atrio destro per renderlo piatto (Figura 4D). Rimuovere il grasso, i vasi o il tessuto rimanenti dall'atrio usando le forbici Castroviejo.
  19. Individuare la SAN nell'atrio destro, che in questo orientamento è approssimativamente delimitato dalla vena cava superiore (in alto), dalla vena cava inferiore (in basso) e dalla cristae terminalis (a sinistra) (Figura 4D).
    NOTA: La crista terminalis appare come una cresta muscolare scura tra l'appendice atriale destra e la SAN. Spesso l'arteria SAN può anche essere vista scorrere attraverso la SAN (Figura 4D).

7. Preparazione del sistema MEA per la registrazione

  1. Aggiungere la soluzione di Tyrode (dalla fase 3) alla bottiglia della soluzione di ingresso (Figura 5C) e ossigenarla attivando il flusso di gas carbogeno (Figura 5A) al sistema.
    NOTA: La soluzione di Tyrode utilizzata per la registrazione è leggermente diversa nella composizione dalla soluzione di Tyrode completa utilizzata per la dissezione.
  2. Verificare il flusso di carbogeno osservando le bolle nel pallone conico, che viene utilizzato per umidificare il gas (Figura 5B), e la bottiglia della soluzione in ingresso (Figura 5C) .
  3. Inserire il tubo di afflusso della pompa peristaltica (Figura 5D) nella soluzione di registrazione di Tyrode (Figura 5C). Quindi, inserire il tubo di deflusso della pompa peristaltica nel flacone di raccolta (Figura 5I).
  4. Impostare la pompa peristaltica a 25 giri/min, che dà una portata di 2 ml/min e avviare la pompa. Controllare il sistema per eventuali perdite o tracimazioni del buffer.
  5. Impostare il regolatore di temperatura a 37 °C, la temperatura fisiologica dei topi (Figura 5E).

8. Posizionamento del tessuto cardiaco sulla griglia MEA

  1. Trasferire il tessuto SAN sezionato con l'aiuto di un pennello (Figura 6A) dalla piastra di Petri sezionante sulla griglia MEA (Figura 1A1).
    1. Mentre guardi al microscopio invertito, posiziona delicatamente il tessuto con un pennello morbido in modo che la regione SAN si sovrapporrà alla griglia dell'elettrodo.
    2. Ricosizionare il tessuto secondo necessità per assicurarsi che si trovi piatto sulla griglia dell'elettrodo, facendo un buon contatto con gli elettrodi.
      NOTA: per spostare il tessuto è necessario un pennello morbido per evitare di danneggiare la griglia dell'elettrodo.
  2. Una volta che il tessuto è posizionato correttamente, utilizzare una pinica ossea (o qualsiasi pinca curva) per posizionare la rete sopra il tessuto (Figura 6A). Quindi utilizzare la pinca ossea per posizionare l'ancora dell'arpa (Figura 6A) sulla rete per tenere tutto in posizione (Figura 6B).
  3. Scatta una foto del posizionamento del tessuto sul MEA in modo che l'attività dei singoli elettrodi possa essere correlata con la loro posizione anatomica durante la registrazione. Questo può essere fatto tenendo uno smartphone fino all'obiettivo del microscopio invertito o utilizzando una fotocamera del microscopio collegata.
    NOTA: se l'orientamento del MEA non viene modificato dopo aver scattato la foto, l'elettrodo in alto a sinistra apparirà come primo canale (Ch1) durante la registrazione.
  4. Posizionare la parabola MEA sulla piastra del connettore (Figura 5F e 6C) e posizionare con attenzione il tappo di perfusione (Figura 6C) sulla piastra MEA senza disturbare l'ancora della fetta di arpa. Il cappuccio di perfusione può essere ulteriormente fissato utilizzando un pezzo di nastro da laboratorio (Figura 6C).
    NOTA: Oltre ad avere tubi di afflusso e deflusso della soluzione regolabili, il tappo ha anche una porta per l'erogazione del gas (Figura 6C). Inoltre, l'anello dell'elettrodo di riferimento attraversa il cappuccio (Figura 6C).
  5. Lasciare che il tessuto si riprenda dalla manipolazione e si acclimati alla camera per 15-20 minuti prima della registrazione.

9. Impostazione del protocollo di acquisizione dati per la registrazione

NOTA: i seguenti passaggi descrivono l'apertura del protocollo software per la registrazione spontanea del battito e la definizione delle condizioni di registrazione. Le specifiche di questi passaggi possono variare a seconda del software specifico utilizzato, ma lo schema generale dovrebbe rimanere lo stesso.

  1. Accendere l'amplificatore (Figura 5G) e impostare un flusso di lavoro per la registrazione nel software sul computer (Figura 5H).
    1. Apri il software e fai clic su Workflow.
    2. Seleziona Apri nuova cartella.
    3. Aprire la cartella Da modelli.
    4. Selezionare 64MD1-1920X1080 (a seconda della risoluzione del desktop).
    5. Aprire la cartella QT.
    6. Aprire la cartella Registrazione spontanea.
    7. Selezionare Beat_recording.moflo e aprirlo (Figura 7A).
  2. Impostare i parametri di registrazione per specificare il numero di tracce, la durata della traccia, l'intervallo di traccia, la tensione di ingresso, la frequenza di campionamento, ecc., In base alle condizioni di registrazione desiderate (Figura 7B).
    NOTA: per l'acquisizione dei dati in frequenza di battita e interspike, in genere utilizzare una tensione di intervallo di ingresso di 2,9 mV, un filtro passa alto a 1 Hz, un filtro passa-basso a 1000 Hz e una frequenza di campionamento di 20 kHz.
  3. Per contrassegnare diverse fasi o condizioni dell'esperimento, ad esempio prima e dopo la somministrazione del farmaco, fare clic sulla scheda Annotazioni per aggiungere le notazioni desiderate (Figura 7C).
  4. Per specificare la destinazione del file per i dati da raccogliere, selezionare la casella Abilita archiviazione e immettere il nome file desiderato nella casella Modificatore nome file.

10. Esecuzione della registrazione e raccolta dei dati

  1. Fare clic sul pulsante Registra e riproduci nella barra dei menu più in alto del software di acquisizione per avviare la registrazione. Acquisire dati per 10 tracce della durata di 1 min con intervalli di 2 min tra le tracce.
  2. Da queste tracce iniziali, verificare che le forme d'onda registrate siano coerenti con una preparazione tissutale sana e di alta qualità confermando che la maggior parte dei canali di registrazione presenta ampiezze di segnale di ≥ 0,5 mV e intervalli inter-spike identici (Figura 8).
    NOTA: Una prima valutazione dell'attività e delle forme d'onda dei singoli microelettrodi corrispondenti alle loro posizioni anatomiche può essere eseguita facendo riferimento all'immagine acquisita dopo aver posizionato il tessuto sul MEA.
  3. Per misurare gli effetti dei farmaci sul tessuto, mettere in pausa la registrazione dopo aver acquisito i dati iniziali della linea di base facendo clic sul pulsante di pausa nella barra dei menu più in alto.
    NOTA: La fase di risposta al farmaco dell'esperimento può essere annotata nella registrazione facendo clic sulla scheda Annotazioni e aggiungendo la notazione desiderata come descritto sopra (Figura 7C).
  4. Mettere in pausa la pompa e commutare il tubo di afflusso della pompa dalla normale soluzione di registrazione alla soluzione di Tyrode contenente il farmaco desiderato di scelta.
    NOTA: Nell'esperimento di esempio, la soluzione di Tyrode è stata utilizzata con 1 mM di 4-aminopiridina (4-AP).
  5. Riavviare la pompa e annullare la pausa della registrazione per iniziare nuovamente a raccogliere i dati.
  6. Una volta che la soluzione di Tyrode infusa con il farmaco ha raggiunto il tessuto, registrare 10 tracce nello stesso modo in cui è stato fatto in precedenza per le registrazioni di base.
    NOTA: Le tracce impiegheranno del tempo per stabilizzarsi mentre il farmaco si infonde nella camera di registrazione. Il meccanismo d'azione del farmaco può anche influenzare la stabilità della registrazione. Per i farmaci che hanno meccanismi d'azione reversibili, dovrebbe anche essere registrato un periodo di washout per confermare il ripristino dell'attività ai livelli basali, che è un indicatore di tessuto sano.
  7. Fare clic su Stop per concludere le registrazioni.
  8. Scatta una foto finale del posizionamento del tessuto sul MEA al microscopio nel caso in cui il tessuto si sia spostato dopo la procedura di configurazione della registrazione iniziale.

11. Pulizia della configurazione dopo la registrazione

  1. Pulire il MEA.
    1. Al termine della registrazione, rimuovere delicatamente la soluzione di registrazione dalla parabola MEA utilizzando una micropipetta da 1 mL.
      NOTA: Fare attenzione a non contattare gli elettrodi MEA che possono danneggiarli.
    2. Rimuovere la rete e l'ancora dell'arpa con una pinica ossea (o qualsiasi pinca curva). Quindi utilizzare un pennello per rimuovere il tessuto dalla superficie MEA facendo sempre attenzione a non toccare i singoli microelettrodi.
    3. Usando un flacone di lavaggio, sciacquare delicatamente il piatto MEA con acqua ultrapura circa 3 o 4 volte.
    4. Conservare il MEA pulito immerso in acqua ultrapura a 4 °C.
  2. Risciacquare il tubo del sistema facendo scorrere acqua ultrapura per almeno 5 minuti utilizzando l'impostazione della velocità massima sulla pompa peristaltica.
    NOTA: Per prevenire la crescita di funghi, non deve essere lasciata acqua o soluzione tampone all'interno del tubo dopo la pulizia.

12. Analisi delle registrazioni MEA per misurare la frequenza del battito SAN

  1. Aprire il file di dati registrati salvato nel modello "Beat_frequency_analysis" del software di analisi (Figura 9) .
  2. Fare clic sul pulsante Riproduci e consentire l'esecuzione dell'intera registrazione per visualizzare il set di dati e assegnare i parametri di analisi appropriati.
    1. Selezionare la finestra di binning per il formato di visualizzazione desiderato dei dati, indipendentemente dal fatto che vengano visualizzati come media per traccia o media per volta (Figura 10A).
    2. Selezionare i canali da includere nell'analisi e impostare i valori di soglia minimi di ampiezza o ampiezza desiderati per l'identificazione automatica dei picchi di forma d'onda (Figura 10B).
      NOTA: in questo passaggio è possibile selezionare un singolo canale, una combinazione di canali o tutti i 64 canali per l'analisi (Figura 9). Se i valori di soglia selezionati sono troppo vicini ai valori massimi e minimi della forma d'onda, alcuni picchi di forma d'onda potrebbero non essere identificati dal software di analisi.
    3. Impostare la quantità di tempo pre-spike e post-spike da includere nell'analisi.
      NOTA: le impostazioni di 50 ms pre-spike e 100 ms post-spike di solito funzionano bene (Figura 10B).
  3. Dopo aver impostato le condizioni di analisi, fare nuovamente clic sul pulsante Riproduci per eseguire nuovamente il set di dati e verificare che i parametri di analisi siano appropriati per l'estrazione del picco.
  4. Per l'analisi, identificare le tre tracce consecutive più stabili che mostrano un tasso di battito stabile per ogni traccia attraverso la maggior parte dei canali sia durante il periodo basale dell'esperimento che altre tre tracce stabili consecutive durante il periodo di esposizione al farmaco (Figura 10A).
  5. Specificare le tracce di inizio e di fine per l'analisi e immettere la durata temporale di ciascuna traccia da analizzare (Figura 9).
  6. Prima di iniziare l'analisi, selezionare le caselle di attivazione sia per Salva battuta al minuto che per Salva intervallo interspike (Figura 10B).
  7. Immettere il nome file desiderato nella casella Modificatore nome file (Figura 10B). I dati analizzati per la frequenza di battitura e l'intervallo interspike verranno salvati sotto forma di formato ASCII (testo).
    NOTA: per analizzare condizioni diverse (come la risposta al basale e al farmaco), l'analisi deve essere eseguita separatamente per ciascuna condizione.
  8. Fare clic sul pulsante Riproduci e registra sulla barra delle schede superiore per avviare l'analisi.
  9. Per esportare i dati per altre applicazioni, selezionare le caselle Salva battuta al minuto e Salva intervallo interspike (Figura 10B). Immettere il nome file desiderato nella casella Modificatore nome file (Figura 10B) e fare clic su Salva per salvare i dati analizzati in formato testo ASCII nella cartella selezionata.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dopo aver permesso al tessuto di acclimatarsi nel piatto per 15 minuti, vengono registrate 10 tracce di un minuto. Il nostro protocollo attuale registra l'attività per oltre un'ora, ma abbiamo registrato modelli di sparo stabili per ≥4 ore in dati non pubblicati non mostrati qui. Se una preparazione sperimentale è buona per la raccolta dei dati, ogni canale di registrazione dovrebbe presentare forme d'onda ricorrenti coerenti e uniformemente distanziate (cioè picchi) di forma uniforme per un dato canale (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praticare e padroneggiare il processo di dissezione SAN è imperativo poiché il tessuto è fragile e il tessuto sano è necessario per una registrazione di successo. Durante la dissezione SAN, il corretto orientamento è essenziale per ottenere la corretta regione del tessuto. Tuttavia, l'orientamento originale del cuore può essere facilmente perso durante il processo di dissezione, il che complica questo sforzo. Pertanto, per garantire il corretto orientamento sinistra-destra, gli atri devono essere ispezionati visivamente....

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health, numeri di sovvenzione R01NS100954 e R01NS099188.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-AminopiridinaSigmaA78403-25G
Ago per siringa calibro 22Fisher Scientific14-826-5AUtilizzato per la dissezione
Ago per siringa calibro 23Fisher Scientific14-826-6CUtilizzato per la dissezione
Piastre di Petri da 60 mmGenesee Scientific32-105G
Flacone in Pyrex da 500 mlFisher Scientific06-414-1CUtilizzato per conservare soluzioni
Flacone in Pyrex da 1000 mlFisher Scientific06-414-1DUtilizzato per conservare soluzioni
Pinze osseeStrumenti per scienze fini16060-11
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)Castroviejo
Forbici, 4"Fine Science Tools15024-10
D-(+)-GlucosioSigma-AldrichG7021-1KG
PCdi acquisizione datiCPU: Intel Xeon o Intel Core i7, Memoria: 8 GB, HDD: 1 TB, Scheda grafica: NVIDIA o integrata, Schermo: 1920x1080
Microscopio da dissezioneJenco
Perni da dissezione Strumenti perscienza fine26002-20
Dumont #2 Pinze per laminectomiaStrumenti per la scienza fine 11223-20
Dumont #55 PinzeStrumenti per la scienza fine11295-51
  Extra Fine Graefe ForcipeFine Science Tools11152-10
di vetroGrainger49WF30Utilizzato per l'eutanasia del topo
Harp Anchor KitWarner Instruments  SHD-22CL/15 WI 64-0247
HClFisher ChemicalsSA48-4Utilizzato per il bilanciamento del pH
EmostaticoFine Science Tools13013-14
EparinaAurobindo Pharma Limited IDA, PashamylaramNDC 63739-953-25
HEPESSigma-AldrichH3375-250G
Microscopio invertitoMoticAE2000
IsofluranoPatterson Veterinario07-893-1389
Nastro da laboratorioFisher Scientific15-950
Luce per microscopio da dissezioneDolan-JennerMI150DG 660000391014
Cloruro di magnesio (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
MED64 Amplificatore di testaMED64MED-A64HE1S
Amplificatore principale MED64MED64MED-A64MD1A
Tappo di perfusione MED64MED-KCAP01
Kit supporto tubo di perfusione MED64MED-KPK02
MED64 ThermoConnectorMED64MED-CP04
Mesh  Warner Instruments640246
Array di microelettrodi (MEA)Alpha Med ScientificMED-R515A
Mobius SoftwareWitWerx Inc.Software specifico per MED64
NaOHFisher ChemicalsS320-500Utilizzato per il bilanciamento del pH
Soluzione salina normaleUltigieneNDC 50989-885-17
PennelloFisher ScientificNC1751733
ParafilmGenesee ScientificPM-996
Pompa peristalticaGilsonF155009
Tubo Pompa Peristaltica FisherScientific14-171-2981/8'' Diametro Interno
PolietilenimminaSigmaP3143
Cloruro di Potassio (KCl)Sigma-AldrichP9333-500G
Fosfato di Potassio monobasico (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655-500G
Sodio BicarbonatoSigmaS6297
Cloruro di sodio (NaCl)Fisher ScientificS671-3
Sylgruard Elastomero KitDow Corning184 SIL ELAST KIT 0,5 KG
Fosfato di sodio monobasicoSigmaS6566
Tetraborato di sodioSigmaS9640
Forbici chirurgicheStrumentiper la scienza fine14074-09
Pipette di trasferimento (3mL graduate)Samco Scientific225
la Camera

References

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