Registrazione di microelettrodi della velocità di attivazione dei nodi senoatriali per identificare i difetti intrinseci del pacemaking cardiaco nei topi

Summary

Questo protocollo mira a descrivere una nuova metodologia per misurare la velocità di sparo cardiaca intrinseca utilizzando la registrazione di array di microelettrodi dell'intero tessuto del nodo senoatriale per identificare i difetti di pacemaking nei topi. Gli agenti farmacologici possono anche essere introdotti in questo metodo per studiare i loro effetti sul pacemaking intrinseco.

Abstract

Il nodo senoatriale (SAN), situato nell'atrio destro, contiene le cellule pacemaker del cuore e la disfunzione di questa regione può causare tachicardia o bradicardia. L'identificazione affidabile dei difetti cardiaci di pacemaking richiede la misurazione della frequenza cardiaca intrinseca prevenendo in gran parte l'influenza del sistema nervoso autonomo, che può mascherare i deficit di frequenza. I metodi tradizionali per analizzare la funzione intrinseca del pacemaker cardiaco includono il blocco autonomo indotto da farmaci per misurare le frequenze cardiache in vivo, le registrazioni cardiache isolate per misurare le frequenze cardiache intrinseche e le registrazioni a striscia sinoatriale o patch-clamp a singola cellula delle cellule pacemaker senoatriali per misurare le velocità di attivazione del potenziale d'azione spontanea. Tuttavia, queste tecniche più tradizionali possono essere tecnicamente impegnative e difficili da eseguire. Qui, presentiamo una nuova metodologia per misurare la velocità di sparo cardiaco intrinseco eseguendo registrazioni MEA (microelectrode array) di preparati di nodi senoatriali a montaggio intero da topi. I MEA sono composti da più microelettrodi disposti in uno schema a griglia per la registrazione in vitro di potenziali di campo extracellulare. Il metodo qui descritto ha il vantaggio combinato di essere relativamente più veloce, più semplice e più preciso rispetto agli approcci precedenti per la registrazione delle frequenze cardiache intrinseche, consentendo al contempo un facile interrogatorio farmacologico.

Introduction

Il cuore è un organo complesso governato da influenze sia cardiache intrinseche che estrinseche come quelle che hanno origine nel cervello. Il nodo senoatriale (SAN) è una regione definita nel cuore che ospita le cellule pacemaker (note anche come cellule senoatriali, o cellule SA) responsabili dell'inizio e della perpetuazione del battito cardiaco dei mammiferi^1,2. La frequenza cardiaca intrinseca è la frequenza guidata dalle cellule pacemaker senza influenza da altre influenze cardiache o neuro-umorali, ma le misure tradizionali della frequenza cardiaca negli esseri umani e negli animali vivi, come gli elett....

Protocol

Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH), come approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Southern Methodist University.

1. Rivestimento dell'array multielettrode (MEA) per la registrazione

1. Crea un buffer di borato da 25 mM.
   1. Sciogliere 0,953 g di Na₂B₄O₇·10 H₂O in 80 ml di acqua distillata.
   2. Regolare il pH a 8,4 con HCl e quindi aggiungere acqua distillata a un volume finale di 100 ml.
2. Fare una soluzione stock al 0,1% di ....

Results

Dopo aver permesso al tessuto di acclimatarsi nel piatto per 15 minuti, vengono registrate 10 tracce di un minuto. Il nostro protocollo attuale registra l'attività per oltre un'ora, ma abbiamo registrato modelli di sparo stabili per ≥4 ore in dati non pubblicati non mostrati qui. Se una preparazione sperimentale è buona per la raccolta dei dati, ogni canale di registrazione dovrebbe presentare forme d'onda ricorrenti coerenti e uniformemente distanziate (cioè picchi) di forma uniforme per un dato canale (

Discussion

Praticare e padroneggiare il processo di dissezione SAN è imperativo poiché il tessuto è fragile e il tessuto sano è necessario per una registrazione di successo. Durante la dissezione SAN, il corretto orientamento è essenziale per ottenere la corretta regione del tessuto. Tuttavia, l'orientamento originale del cuore può essere facilmente perso durante il processo di dissezione, il che complica questo sforzo. Pertanto, per garantire il corretto orientamento sinistra-destra, gli atri devono essere ispezionati visivamente........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Aminopiridina	Sigma	A78403-25G
Ago per siringa calibro 22	Fisher Scientific	14-826-5A	Utilizzato per la dissezione
Ago per siringa calibro 23	Fisher Scientific	14-826-6C	Utilizzato per la dissezione
Piastre di Petri da 60 mm	Genesee Scientific	32-105G
Flacone in Pyrex da 500 ml	Fisher Scientific	06-414-1C	Utilizzato per conservare soluzioni
Flacone in Pyrex da 1000 ml	Fisher Scientific	06-414-1D	Utilizzato per conservare soluzioni
Pinze ossee	Strumenti per scienze fini	16060-11
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)Castroviejo
Forbici, 4"	Fine Science Tools	15024-10
D-(+)-Glucosio	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
PC			di acquisizione datiCPU: Intel Xeon o Intel Core i7, Memoria: 8 GB, HDD: 1 TB, Scheda grafica: NVIDIA o integrata, Schermo: 1920x1080
Microscopio da dissezione	Jenco
Perni da dissezione Strumenti per	scienza fine	26002-20
Dumont #2 Pinze per laminectomia	Strumenti per la scienza fine 11223-20
Dumont #55 Pinze	Strumenti per la scienza fine	11295-51
Extra Fine Graefe Forcipe	Fine Science Tools	11152-10
di vetro	Grainger	49WF30	Utilizzato per l'eutanasia del topo
Harp Anchor Kit	Warner Instruments	SHD-22CL/15 WI 64-0247
HCl	Fisher Chemicals	SA48-4	Utilizzato per il bilanciamento del pH
Emostatico	Fine Science Tools	13013-14
Eparina	Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram	NDC 63739-953-25
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Microscopio invertito	Motic	AE2000
Isoflurano	Patterson Veterinario	07-893-1389
Nastro da laboratorio	Fisher Scientific	15-950
Luce per microscopio da dissezione	Dolan-Jenner	MI150DG 660000391014
Cloruro di magnesio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337-100G
MED64 Amplificatore di testa	MED64	MED-A64HE1S
Amplificatore principale MED64	MED64	MED-A64MD1A
Tappo di perfusione MED64		MED-KCAP01
Kit supporto tubo di perfusione MED64		MED-KPK02
MED64 ThermoConnector	MED64	MED-CP04
Mesh	Warner Instruments	640246
Array di microelettrodi (MEA)	Alpha Med Scientific	MED-R515A
Mobius Software	WitWerx Inc.		Software specifico per MED64
NaOH	Fisher Chemicals	S320-500	Utilizzato per il bilanciamento del pH
Soluzione salina normale	Ultigiene	NDC 50989-885-17
Pennello	Fisher Scientific	NC1751733
Parafilm	Genesee Scientific	PM-996
Pompa peristaltica	Gilson	F155009
Tubo Pompa Peristaltica Fisher	Scientific	14-171-298	1/8'' Diametro Interno
Polietilenimmina	Sigma	P3143
Cloruro di Potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Fosfato di Potassio monobasico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655-500G
Sodio Bicarbonato	Sigma	S6297
Cloruro di sodio (NaCl)	Fisher Scientific	S671-3
Sylgruard Elastomero Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0,5 KG
Fosfato di sodio monobasico	Sigma	S6566
Tetraborato di sodio	Sigma	S9640
Forbici chirurgiche	Strumenti	per la scienza fine14074-09
Pipette di trasferimento (3mL graduate)	Samco Scientific	225