Estrazione del cofattore _F420 per l'analisi della lunghezza della coda di poliglutammato da colture pure metanogeniche e campioni ambientali

_F420 è un cofattore diffuso ma spesso trascurato, che funziona come un vettore obbligato di idruro a due elettroni nei processi metabolici primari e secondari sia di Archaea che di ^Bacteria1,2. _F420 è una 5-deazaflavina e strutturalmente simile alle flavine, per cui le sue proprietà chimiche e biologiche sono più paragonabili a quelle di NAD⁺ o NADP⁺. A causa della sostituzione dell'azoto con il carbonio in posizione 5 dell'anello isoallossiazinico, è un forte riducente, esibendo così un basso potenziale redox standard di -340 ^mV1,3. _F420 comprende un anello 5-deazaflavina e un linker 2-fosfo-L-lattato (_F420-0). Una coda oligoglutammata contenente n+1 monomeri di glutammato può essere attaccata alla molecola (_F420-n+1)⁴.

Per molto tempo, il cofattore _F420 è stato associato esclusivamente ad Archaea e Actinobacteria. Questo è stato in gran parte ribaltato. Recenti analisi hanno rivelato che _F420 è distribuito tra diversi organismi anaerobici e aerobici dei phyla Proteobacteria, Chloroflexi e potenzialmente Firmicutes che abitano una miriade di habitat come suoli, laghi e intestino ^umano1,5. Nel 2019, Braga et ^al.6, hanno dimostrato che il proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica produce un derivato _F420 unico, contenente un 3-fosfoglicerato invece di una coda 2-fosfolactato, che potrebbe essere diffuso in vari habitat. All'interno del dominio Archaea, _F420 è stato trovato in diversi lignaggi, tra cui metanogenico7, metanotrofico8,9 e ordini di riduzione del solfato10, e si suppone che sia prodotto in Thaumarchaeota11. _F420 è meglio conosciuto come un coenzima redox essenziale nella metanogenesi idrogenotrofica e metilotrofica. La forma ridotta di _F420 (_F420H2) funziona come donatore di elettroni per la riduzione della metilenetetraidrometanopterina (metilene-H4MPT, Mer) e del metile-H4MPT12,13. Può anche essere usato come vettore di elettroni in vie di trasporto di elettroni indipendenti da _H2 di metanogeni contenenti citocromi12,14. Inoltre, la forma ossidata di _F420 ha una caratteristica fluorescenza blu-verde all'eccitazione a 420 nm, che facilita la rilevazione dei metanogeni al microscopio (Figura 1). Grazie al suo basso potenziale redox, _F420 facilita (i) la riduzione esogena di un ampio spettro di composti organici altrimenti recalcitranti o tossici, (ii) la sintesi di antibiotici tetracicline e lincosamide o fitotossine negli streptomiceti (phylum Actinobacteria) e (iii) la resistenza allo stress ossidativo o nitrosativo o ad altre condizioni sfavorevoli nei micobatteri (phylum Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Di conseguenza, le ossidoreduttasi _{F420-dipendenti} sono biocatalizzatori promettenti per scopi industriali e farmaceutici, nonché per il biorisanamento di ambienti ^{contaminati1,23}. Nonostante queste recenti scoperte, i ruoli esatti del cofattore _F420 sono ancora marginalmente noti negli Actinobacteria o in altri phyla batterici.

Esistono almeno tre percorsi per la biosintesi _F4202,6,24. All'inizio, la via della biosintesi è divisa in una biosintesi a 5-deazaflavina e un ramo del metabolismo a 2-fosfolattato. La parte reattiva della molecola _F420 viene sintetizzata tramite _FO-sintasi utilizzando i substrati tirosina e 5-ammino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pirimidinedione. Il risultato è il cromoforo _FO a livello di riboflavina. All'interno del ramo del metabolismo del lattato attualmente accettato, L-lattato è fosforilato a 2-fosfo-L-lattato da una L-lattato chinasi (CofB); Il 2-fosfo-L-lattato, a sua volta, è guanilato a L-lattil-2-difosfo-5'-guanosina dalla 2-fosfo-L-lattato guanililtransferasi (CofC). Nella fase successiva, L-lattil-2-difosfo-5'-guanosina è collegata a _FO da una 2-fosfo-L-lattato transferasi (CofD) per formare _F420-02. Infine, l'enzima _F420-0:ɣ-glutamil ligasi (CofE) lega i monomeri di glutammato a _F420-0, formando il cofattore ^finale6 in numeri ^{variabili23,25}. Organismi diversi mostrano modelli diversi nel numero di residui di glutammato attaccati, con code più corte trovate per i metanogeni rispetto ai micobatteri2,25,26. Generalmente, i metanogeni mostrano lunghezze della coda da due a tre, con fino a cinque nel metanogeno acetoclastico, Methanosarcina sp., mentre le lunghezze della coda trovate in Mycobacterium sp. variavano da cinque a sette residui di glutammato2,25,26,27. Tuttavia, recenti scoperte hanno mostrato che _F420 a catena lunga si lega alle ossidoreduttasi _{F420-dipendenti} con un'affinità maggiore rispetto alla _F420 a catena corta; inoltre, il legato A catena lunga _F420 aumenta l'affinità del substrato ma diminuisce il tasso di turnover dei rispettivi ^enzimi23.

Il rilevamento del cofattore _F420 è spesso basato sulla sua fluorescenza. In tal modo, i suoi derivati oligo glutammato sono stati separati utilizzando LA fase inversa (RP)-^HPLC27,28. Recentemente, Ney et al. hanno utilizzato l'idrossido di tetrabutilammonio come reagente di accoppiamento ionico per la coda di glutammato caricata negativamente per migliorare con successo la separazione su RP-HLPC5. Qui, presentiamo un metodo per la preparazione di campioni, successiva lisi, estrazione, purificazione, separazione e quantificazione del cofattore _F420 non solo da colture pure ma anche da diversi campioni ambientali (cioè terreni e fanghi del digestore).

NOTA: L'estrazione e l'analisi del cofattore _F420 è un processo in tre fasi che include la lisi del campione, la pre-purificazione del cofattore tramite estrazione in fase solida (SPE) e il rilevamento del cofattore tramite RP-HPLC accoppiato a ioni (IP-RP-HPLC) con rilevamento a fluorescenza. Prima di iniziare, preparare i materiali e i reagenti come indicato nella Tabella 1.

1. Lisi del campione

1. Aggiungere fino a 5 g di campione in provette appropriate (ad esempio, tubi conici da 50 ml).
2. Aggiungere 5 mL del tampone di lisi (2x soluzione madre, Tabella 1) ai campioni.
3. Portare ad un volume finale di 10 ml con acqua distillata per raggiungere una concentrazione finale di 0,5 g·^mL-1.
4. Vortice i campioni diluiti per 20 s.
5. Autoclave per 30 min a 121 °C.
6. Per i campioni secchi come il terreno forestale, portare a un volume finale di 20 ml con acqua distillata dopo l'autoclave e vorticare il campione diluito.
   ATTENZIONE: l'aumento della temperatura durante l'autoclave potrebbe causare lo scoppio dei tubi.

2. Pre-purificazione del cofattore F ₄₂₀ tramite estrazione in fase solida (SPE)

NOTA: Tutte le fasi della SPE sono condotte a temperatura ambiente

1. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente.
2. Centrifugare i campioni autoclavati per 5 min a 11.000 x g.
3. Preparare colonne SPE da 5 ml riempite con 100 mg di assorbente polimerico in modalità mista ad anione debole.
4. Condizionare lo scambiatore di anioni con 3 ml di metanolo (soluzione di condizione, Tabella 1).
5. Equilibrare lo scambiatore di anioni con 3 ml di acqua distillata (soluzione di equilibratura, tabella 1).
6. Caricare fino a 9,0 ml del surnatante dal lisato centrifugato sulla colonna SPE.
7. Lavare via le impurità con 5 mL di acetato di ammonio da 25 mM (soluzione di lavaggio SPE 1, Tabella 1).
8. Lavare via le impurità con 5 ml di metanolo (soluzione di lavaggio SPE 2, Tabella 1).
9. Eluire il cofattore _F420 in 1,0 mL di tampone di eluizione (Tabella 1).
   NOTA: Preparare un tampone di eluizione fresco. A causa del vuoto applicato e dell'elevata pressione di vapore del tampone di eluizione, i volumi di eluizione potrebbero differire da campione a campione. Al fine di garantire lo stesso volume finale in tutti i campioni, si raccomanda di pesare i recipienti di raccolta prima e dopo l'eluizione e calcolare il volume di eluizione effettivo. Bilanciare le differenze con l'aggiunta del tampone di eluizione.

3. Rilevazione del cofattore _F420

1. Impostare il forno a 40 °C e il rivelatore a fluorescenza a 420 nm di lunghezza d'onda di estinzione e 470 nm di lunghezza d'onda di emissione. Ottenere la separazione tramite modalità gradiente utilizzando le fasi mobili A e B (Tabella 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B ad una portata di 0,75 mL·^min-1.
   NOTA: Garantire l'equilibrio delle condizioni della colonna prima dell'iniezione dei campioni lavando la colonna almeno con volumi a 3 colonne di fase mobile A al 74% e al 26% fase B mobile (tabella 1).
   1. Filtrare i campioni eluiti dall'SPE in flaconcini HPLC utilizzando un filtro PTFE con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
      NOTA: si consigliano filtri ptfe con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
   2. Iniettare 50 μL del campione eluito sul sistema HPLC per analizzare la composizione e la concentrazione del cofattore _F420 .
      NOTA: poiché in questo protocollo non viene utilizzato alcuno standard quantitativo, i campioni e le varianti devono essere confrontati per area di picco.

Le colture pure di Methanosarcina thermophila e Methanoculleus thermophilus, entrambe archee metanogeniche termofile, sono state coltivate in mezzi idonei come descritto in precedenza29,30. Per Methanosarcina thermophila, il metanolo è stato utilizzato come fonte di energia, mentre Methanoculleus thermophilus è stato coltivato su H2 / CO2. La crescita è stata controllata mediante valutazione microscopica, mentre l'attività è stata esaminata tramite misurazione del metano (CH4) mediante gascromatografia come descritto in precedenza31. Colture pure sono state utilizzate per l'estrazione del cofattore F420 secondo il protocollo presentato. Inoltre, nell'autunno 2020 sono stati prelevati campioni ambientali tra cui campioni provenienti da fanghi di un reattore di biogas mesofilo (impianto di trattamento delle acque reflue, Zirl, Austria; per i dettagli relativi ai parametri dei fanghi, fare riferimento a 32), un prato utilizzato in agricoltura (Innsbruck, Austria) e terreno forestale (Lans, Austria) per l'estrazione e l'analisi del cofattore F420.

La crescita di colture pure è stata verificata al microscopio (Figura 1), con il CH4 prodotto analizzato tramite gascromatografia durante 14 giorni di incubazione (dati non mostrati). L'efficienza dell'estrazione del cofattore F420 da colture pure è stata testata applicando diverse strategie di disintegrazione: battitura con battiti ceramici da 0,5-1,0 mm, trattamento ad ultrasuoni e disintegrazione pressione-temperatura utilizzando 121 ° C e pressione di 1,2 bar (autoclave). La massima efficienza di estrazione è risultata evidente utilizzando il trattamento pressione-temperatura applicando un tampone come descritto nella sezione del protocollo ed è stata quindi ulteriormente applicata per tutti gli esperimenti successivi (Figura 2). I test di efficienza di estrazione sono stati eseguiti tramite l'aggiunta standard di diversi volumi di una coltura di Methanoculleus thermophilus ben coltivata. Inoltre, il confronto di diversi campioni e varianti si basava sull'area di picco dei cromatogrammi.

Successivamente, gli estratti cellulari sono stati sottoposti a una procedura di estrazione in fase solida (SPE). A tale scopo, sono stati testati diversi scambiatori di ioni. Si è scoperto che un assorbente polimerico in modalità mista ad anioni deboli ha prodotto la più alta quantità di cofattore F420 dopo l'eluizione. Inoltre, sono stati testati diversi tamponi di eluizione e soluzioni di lavaggio che hanno mostrato i migliori risultati per 25 mM di acetato di ammonio come tampone di lavaggio e una miscela di NH3 in metanolo come tampone di eluizione. Il metanolo dalla fase di eluizione potrebbe essere scambiato dopo l'eluizione con acqua attraverso un trattamento a temperatura di vuoto.

L'analisi HPLC del cofattore F420 è stata testata con diverse colonne C18 con i migliori risultati per la configurazione del sistema ottenuti durante lo studio presentato con una colonna NX C18. A scopo di riferimento è stato utilizzato uno standard contenente una distribuzione nota di derivati F420 con lunghezza variabile della coda del glutammato. Questo standard è stato gentilmente fornito dal Prof. Colin Jackson dell'Australian National University. L'analisi della lunghezza della coda del glutammato ha rivelato differenze nella concentrazione complessiva del cofattore F420 e nella distribuzione della lunghezza della coda F420 di colture pure metanogeniche e campioni ambientali (Figura 3).

Tabella 1: Composizione tampone e fase mobile per l'estrazione in fase solida (SPE) e l'analisi HPLC. 

Figura 1: Coltura pura metanogenica fluorescente. Visualizzazione di Methanosarcina thermophila tramite microscopia a contrasto di fase (A) e tramite microscopia a fluorescenza (B) quando il cofattore F420 è eccitato con luce UV (eccitazione a 395-440 nm ed emissione a 475-495 nm). Barra della scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Aggiunta standard. Area di picco del cofattore recuperato F420 dopo SPE da 1,0 g di matrice con picchi con diversi volumi di colture di M. thermophilus . La matrice è stata modificata con 0 μL, 250 μL, 500 μL, 750 μL e 1000 μL di coltura e sottoposta a diverse strategie di disintegrazione: beat-beating, trattamento ad ultrasuoni e disintegrazione pressione-temperatura (autoclave). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Distribuzione della lunghezza della coda del glutammato. Cofactor F420 distribuzione della lunghezza della coda di colture pure e campioni ambientali. Dall'alto verso il basso: prato (suolo) usato in agricoltura, foresta (suolo), reattore a biogas mesofilo, coltura pura di M. thermophilus e coltura pura di M. thermophila. L'assorbanza relativa è stata calcolata mediante normalizzazione sul picco più alto all'interno del cromatogramma mostrato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.