Estrazione del cofattore F420 per l'analisi della lunghezza della coda di poliglutammato da colture pure metanogeniche e campioni ambientali

Sommario

Un metodo per l'estrazione del cofattore _F420 da colture pure è stato ottimizzato per la separazione cromatografica liquida e l'analisi della lunghezza della coda _F420 in campioni di coltura pura e ambientali.

Abstract

Il cofattore _F420 svolge un ruolo centrale come vettore di idruro nel metabolismo primario e secondario di molti taxa batterici e archeali. Il cofattore è meglio conosciuto per il suo ruolo nella metanogenesi, dove facilita reazioni termodinamicamente difficili. Poiché la coda di poliglutammato varia in lunghezza tra diversi organismi, le analisi del profilo di lunghezza potrebbero essere un potente strumento per distinguere e caratterizzare diversi gruppi e percorsi in vari habitat. Qui, il protocollo descrive l'estrazione e l'ottimizzazione del rilevamento del cofattore _F420 applicando l'estrazione in fase solida combinata con l'analisi cromatografica liquida ad alte prestazioni indipendente dagli approcci biologici culturali o molecolari. Il metodo è stato applicato per ottenere ulteriori informazioni sull'espressione del cofattore _F420 da comunità microbiche in terreni, fanghi anaerobici e colture pure ed è stato valutato mediante esperimenti di spiking. In tal modo, lo studio è riuscito a generare diversi profili di lunghezza della coda _F420 per metanogeni idrogenotrofici e acetoclastici in colture pure metanogeniche controllate, nonché da campioni ambientali come fanghi e terreni del digestore anaerobico.

Introduzione

_F420 è un cofattore diffuso ma spesso trascurato, che funziona come un vettore obbligato di idruro a due elettroni nei processi metabolici primari e secondari sia di Archaea che di ^Bacteria1,2. _F420 è una 5-deazaflavina e strutturalmente simile alle flavine, per cui le sue proprietà chimiche e biologiche sono più paragonabili a quelle di NAD⁺ o NADP⁺. A causa della sostituzione dell'azoto con il carbonio in posizione 5 dell'anello isoallossiazinico, è un forte riducente, esibendo così un basso potenziale redox standard di -340 ^mV1,3. _F420 comprende un anello 5-deazaflavina e un linker 2-fosfo-L-lattato (_F420-0). Una coda oligoglutammata contenente n+1 monomeri di glutammato può essere attaccata alla molecola (_F420-n+1)⁴.

Per molto tempo, il cofattore _F420 è stato associato esclusivamente ad Archaea e Actinobacteria. Questo è stato in gran parte ribaltato. Recenti analisi hanno rivelato che _F420 è distribuito tra diversi organismi anaerobici e aerobici dei phyla Proteobacteria, Chloroflexi e potenzialmente Firmicutes che abitano una miriade di habitat come suoli, laghi e intestino ^umano1,5. Nel 2019, Braga et ^al.6, hanno dimostrato che il proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica produce un derivato _F420 unico, contenente un 3-fosfoglicerato invece di una coda 2-fosfolactato, che potrebbe essere diffuso in vari habitat. All'interno del dominio Archaea, _F420 è stato trovato in diversi lignaggi, tra cui metanogenico7, metanotrofico8,9 e ordini di riduzione del solfato10, e si suppone che sia prodotto in Thaumarchaeota11. _F420 è meglio conosciuto come un coenzima redox essenziale nella metanogenesi idrogenotrofica e metilotrofica. La forma ridotta di _F420 (_F420H2) funziona come donatore di elettroni per la riduzione della metilenetetraidrometanopterina (metilene-H4MPT, Mer) e del metile-H4MPT12,13. Può anche essere usato come vettore di elettroni in vie di trasporto di elettroni indipendenti da _H2 di metanogeni contenenti citocromi12,14. Inoltre, la forma ossidata di _F420 ha una caratteristica fluorescenza blu-verde all'eccitazione a 420 nm, che facilita la rilevazione dei metanogeni al microscopio (Figura 1). Grazie al suo basso potenziale redox, _F420 facilita (i) la riduzione esogena di un ampio spettro di composti organici altrimenti recalcitranti o tossici, (ii) la sintesi di antibiotici tetracicline e lincosamide o fitotossine negli streptomiceti (phylum Actinobacteria) e (iii) la resistenza allo stress ossidativo o nitrosativo o ad altre condizioni sfavorevoli nei micobatteri (phylum Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Di conseguenza, le ossidoreduttasi _{F420-dipendenti} sono biocatalizzatori promettenti per scopi industriali e farmaceutici, nonché per il biorisanamento di ambienti ^{contaminati1,23}. Nonostante queste recenti scoperte, i ruoli esatti del cofattore _F420 sono ancora marginalmente noti negli Actinobacteria o in altri phyla batterici.

Esistono almeno tre percorsi per la biosintesi _F4202,6,24. All'inizio, la via della biosintesi è divisa in una biosintesi a 5-deazaflavina e un ramo del metabolismo a 2-fosfolattato. La parte reattiva della molecola _F420 viene sintetizzata tramite _FO-sintasi utilizzando i substrati tirosina e 5-ammino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pirimidinedione. Il risultato è il cromoforo _FO a livello di riboflavina. All'interno del ramo del metabolismo del lattato attualmente accettato, L-lattato è fosforilato a 2-fosfo-L-lattato da una L-lattato chinasi (CofB); Il 2-fosfo-L-lattato, a sua volta, è guanilato a L-lattil-2-difosfo-5'-guanosina dalla 2-fosfo-L-lattato guanililtransferasi (CofC). Nella fase successiva, L-lattil-2-difosfo-5'-guanosina è collegata a _FO da una 2-fosfo-L-lattato transferasi (CofD) per formare _F420-02. Infine, l'enzima _F420-0:ɣ-glutamil ligasi (CofE) lega i monomeri di glutammato a _F420-0, formando il cofattore ^finale6 in numeri ^{variabili23,25}. Organismi diversi mostrano modelli diversi nel numero di residui di glutammato attaccati, con code più corte trovate per i metanogeni rispetto ai micobatteri2,25,26. Generalmente, i metanogeni mostrano lunghezze della coda da due a tre, con fino a cinque nel metanogeno acetoclastico, Methanosarcina sp., mentre le lunghezze della coda trovate in Mycobacterium sp. variavano da cinque a sette residui di glutammato2,25,26,27. Tuttavia, recenti scoperte hanno mostrato che _F420 a catena lunga si lega alle ossidoreduttasi _{F420-dipendenti} con un'affinità maggiore rispetto alla _F420 a catena corta; inoltre, il legato A catena lunga _F420 aumenta l'affinità del substrato ma diminuisce il tasso di turnover dei rispettivi ^enzimi23.

Il rilevamento del cofattore _F420 è spesso basato sulla sua fluorescenza. In tal modo, i suoi derivati oligo glutammato sono stati separati utilizzando LA fase inversa (RP)-^HPLC27,28. Recentemente, Ney et al. hanno utilizzato l'idrossido di tetrabutilammonio come reagente di accoppiamento ionico per la coda di glutammato caricata negativamente per migliorare con successo la separazione su RP-HLPC5. Qui, presentiamo un metodo per la preparazione di campioni, successiva lisi, estrazione, purificazione, separazione e quantificazione del cofattore _F420 non solo da colture pure ma anche da diversi campioni ambientali (cioè terreni e fanghi del digestore).

Protocollo

NOTA: L'estrazione e l'analisi del cofattore _F420 è un processo in tre fasi che include la lisi del campione, la pre-purificazione del cofattore tramite estrazione in fase solida (SPE) e il rilevamento del cofattore tramite RP-HPLC accoppiato a ioni (IP-RP-HPLC) con rilevamento a fluorescenza. Prima di iniziare, preparare i materiali e i reagenti come indicato nella Tabella 1.

1. Lisi del campione

1. Aggiungere fino a 5 g di campione in provette appropriate (ad esempio, tubi conici da 50 ml).
2. Aggiungere 5 mL del tampone di lisi (2x soluzione madre, Tabella 1) ai campioni.
3. Portare ad un volume finale di 10 ml con acqua distillata per raggiungere una concentrazione finale di 0,5 g·^mL-1.
4. Vortice i campioni diluiti per 20 s.
5. Autoclave per 30 min a 121 °C.
6. Per i campioni secchi come il terreno forestale, portare a un volume finale di 20 ml con acqua distillata dopo l'autoclave e vorticare il campione diluito.
   ATTENZIONE: l'aumento della temperatura durante l'autoclave potrebbe causare lo scoppio dei tubi.

2. Pre-purificazione del cofattore F ₄₂₀ tramite estrazione in fase solida (SPE)

NOTA: Tutte le fasi della SPE sono condotte a temperatura ambiente

1. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente.
2. Centrifugare i campioni autoclavati per 5 min a 11.000 x g.
3. Preparare colonne SPE da 5 ml riempite con 100 mg di assorbente polimerico in modalità mista ad anione debole.
4. Condizionare lo scambiatore di anioni con 3 ml di metanolo (soluzione di condizione, Tabella 1).
5. Equilibrare lo scambiatore di anioni con 3 ml di acqua distillata (soluzione di equilibratura, tabella 1).
6. Caricare fino a 9,0 ml del surnatante dal lisato centrifugato sulla colonna SPE.
7. Lavare via le impurità con 5 mL di acetato di ammonio da 25 mM (soluzione di lavaggio SPE 1, Tabella 1).
8. Lavare via le impurità con 5 ml di metanolo (soluzione di lavaggio SPE 2, Tabella 1).
9. Eluire il cofattore _F420 in 1,0 mL di tampone di eluizione (Tabella 1).
   NOTA: Preparare un tampone di eluizione fresco. A causa del vuoto applicato e dell'elevata pressione di vapore del tampone di eluizione, i volumi di eluizione potrebbero differire da campione a campione. Al fine di garantire lo stesso volume finale in tutti i campioni, si raccomanda di pesare i recipienti di raccolta prima e dopo l'eluizione e calcolare il volume di eluizione effettivo. Bilanciare le differenze con l'aggiunta del tampone di eluizione.

3. Rilevazione del cofattore _F420

1. Impostare il forno a 40 °C e il rivelatore a fluorescenza a 420 nm di lunghezza d'onda di estinzione e 470 nm di lunghezza d'onda di emissione. Ottenere la separazione tramite modalità gradiente utilizzando le fasi mobili A e B (Tabella 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B ad una portata di 0,75 mL·^min-1.
   NOTA: Garantire l'equilibrio delle condizioni della colonna prima dell'iniezione dei campioni lavando la colonna almeno con volumi a 3 colonne di fase mobile A al 74% e al 26% fase B mobile (tabella 1).
   1. Filtrare i campioni eluiti dall'SPE in flaconcini HPLC utilizzando un filtro PTFE con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
      NOTA: si consigliano filtri ptfe con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
   2. Iniettare 50 μL del campione eluito sul sistema HPLC per analizzare la composizione e la concentrazione del cofattore _F420 .
      NOTA: poiché in questo protocollo non viene utilizzato alcuno standard quantitativo, i campioni e le varianti devono essere confrontati per area di picco.

Risultati

Le colture pure di Methanosarcina thermophila e Methanoculleus thermophilus, entrambe archee metanogeniche termofile, sono state coltivate in mezzi idonei come descritto in ^{precedenza29,30}. Per Methanosarcina thermophila, il metanolo è stato utilizzato come fonte di energia, mentre Methanoculleus thermophilus è stato coltivato su _H2 / _CO2. La crescita è stata controllata mediante valutazione micro...

Discussione

Per la valutazione del cofattore _F420 da colture pure metanogeniche, è possibile eseguire una valutazione microscopica per visualizzare la crescita e l'attività (microscopia a fluorescenza) dei microrganismi coinvolti (Figura 1). Per i campioni derivanti da ambienti naturali, l'uso della microscopia per rilevare o quantificare _F420 è limitato a causa di interferenze con altri microrganismi fluorescenti, particelle organiche e inorganiche. In questo contesto, l'estrazion...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Autoclave
Sistema HPLC biocompatibile dotato di modulo di gradiente, forno e rivelatore di fluorescenza	HPLC	Shimadzu
Centrifuga e rotore per 50 mL" Falco" tubi (11.000 rcf) e tubi
Colonna HPLC: Gemini NX C18, 5 μ m, 150 x 3 mm	Phenomenex		HPLC
(dimensione dei pori 0,22 &; micro; m) per rimuovere il particolato prima dell'analisi
Resina per SPE: Strata-X-AW 33 μ m come adsorbente polimerico a modalità mista anione debole	Phenomenex		sorbente polimerico a modalità mista ad anione debole
Collettore a vuoto per SPE e provette			Attrezzatura SPE Miscelatore
			a vortice

Sistema appropriati Filtro in PTFE a colonna HPLC di raccolta appropriate