Un metodo per l'estrazione del cofattore F420 da colture pure è stato ottimizzato per la separazione cromatografica liquida e l'analisi della lunghezza della coda F420 in campioni di coltura pura e ambientali.
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Articolo metodologico
Estrazione del cofattore F420 per l'analisi della lunghezza della coda di poliglutammato da colture pure metanogeniche e campioni ambientali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cofattore F420 svolge un ruolo centrale come vettore di idruro nel metabolismo primario e secondario di molti taxa batterici e archeali. Il cofattore è meglio conosciuto per il suo ruolo nella metanogenesi, dove facilita reazioni termodinamicamente difficili. Poiché la coda di poliglutammato varia in lunghezza tra diversi organismi, le analisi del profilo di lunghezza potrebbero essere un potente strumento per distinguere e caratterizzare diversi gruppi e percorsi in vari habitat. Qui, il protocollo descrive l'estrazione e l'ottimizzazione del rilevamento del cofattore F420 applicando l'estrazione in fase solida combinata con l'analisi cromatografica liquida ad alte prestazioni indipendente dagli approcci biologici culturali o molecolari. Il metodo è stato applicato per ottenere ulteriori informazioni sull'espressione del cofattore F420 da comunità microbiche in terreni, fanghi anaerobici e colture pure ed è stato valutato mediante esperimenti di spiking. In tal modo, lo studio è riuscito a generare diversi profili di lunghezza della coda F420 per metanogeni idrogenotrofici e acetoclastici in colture pure metanogeniche controllate, nonché da campioni ambientali come fanghi e terreni del digestore anaerobico.
Introduzione
F420 è un cofattore diffuso ma spesso trascurato, che funziona come un vettore obbligato di idruro a due elettroni nei processi metabolici primari e secondari sia di Archaea che di Bacteria1,2. F420 è una 5-deazaflavina e strutturalmente simile alle flavine, per cui le sue proprietà chimiche e biologiche sono più paragonabili a quelle di NAD+ o NADP+. A causa della sostituzione dell'azoto con il carbonio in posizione 5 dell'anello isoallossiazinico, è un forte riducente, esibendo così un basso potenziale redox standard di -340 mV1,....
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Protocollo
NOTA: L'estrazione e l'analisi del cofattore F420 è un processo in tre fasi che include la lisi del campione, la pre-purificazione del cofattore tramite estrazione in fase solida (SPE) e il rilevamento del cofattore tramite RP-HPLC accoppiato a ioni (IP-RP-HPLC) con rilevamento a fluorescenza. Prima di iniziare, preparare i materiali e i reagenti come indicato nella Tabella 1.
1. Lisi del campione
- Aggiungere fino a 5 g di campione in provette appropriate (ad esempio, tubi conici da 50 ml).
- Aggiungere 5 mL del tampone di lisi (2x soluzione madre, Tabella 1) ai campioni. <....
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Risultati
Le colture pure di Methanosarcina thermophila e Methanoculleus thermophilus, entrambe archee metanogeniche termofile, sono state coltivate in mezzi idonei come descritto in precedenza29,30. Per Methanosarcina thermophila, il metanolo è stato utilizzato come fonte di energia, mentre Methanoculleus thermophilus è stato coltivato su H2 / CO2. La crescita è stata controllata mediante valutazione micro.......
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Discussione
Per la valutazione del cofattore F420 da colture pure metanogeniche, è possibile eseguire una valutazione microscopica per visualizzare la crescita e l'attività (microscopia a fluorescenza) dei microrganismi coinvolti (Figura 1). Per i campioni derivanti da ambienti naturali, l'uso della microscopia per rilevare o quantificare F420 è limitato a causa di interferenze con altri microrganismi fluorescenti, particelle organiche e inorganiche. In questo contesto, l'estrazion.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo con gratitudine il Prof. Colin Jackson per il supporto con il cofattore purificato F420. Questa ricerca è stata sostenuta dal Fondo scientifico tirolese (TWF) e dall'Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Riconosciamo vivamente il supporto di GPS, HK, SB, GG e HB.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Autoclave | |||
| Sistema HPLC biocompatibile dotato di modulo di gradiente, forno e rivelatore di fluorescenza | HPLC | Shimadzu | |
| Centrifuga e rotore per 50 mL" Falco" tubi (11.000 rcf) e tubi | |||
| Colonna HPLC: Gemini NX C18, 5 μ m, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC | |
| (dimensione dei pori 0,22 &; micro; m) per rimuovere il particolato prima dell'analisi | |||
| Resina per SPE: Strata-X-AW 33 μ m come adsorbente polimerico a modalità mista anione debole | Phenomenex | sorbente polimerico a modalità mista ad anione debole | |
| Collettore a vuoto per SPE e provette | Attrezzatura SPE Miscelatore | ||
| a vortice |
Riferimenti
- Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).
- Bashiri, G., et al.
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Ristampe e permessi
