Definizione delle funzioni geniche nella tumorigenesi mediante ablazione ex vivo di alleli floxed in cellule tumorali maligne della guaina del nervo periferico

Jody  Fromm Longo; Stephanie N. Brosius; Steven L. Carroll

doi:10.3791/62740

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Articolo metodologico

Definizione delle funzioni geniche nella tumorigenesi mediante ablazione ex vivo di alleli floxed in cellule tumorali maligne della guaina del nervo periferico

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DOI:

10.3791/62740

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25 agosto 2021

Jody Fromm Longo¹ , Stephanie N. Brosius²^,³ , Steven L. Carroll¹

¹Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, ²Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, ³Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire knockout genici che sono embrionali letali in vivo in tumori derivati da modelli murini geneticamente modificati e quindi valutare l'effetto che il knockout ha sulla crescita, proliferazione, sopravvivenza, migrazione, invasione e trascrittoma in vitro e in vivo.

Abstract

Lo sviluppo di nuovi farmaci che colpiscono con precisione le proteine chiave nei tumori umani sta alterando fondamentalmente le terapie contro il cancro. Tuttavia, prima che questi farmaci possano essere utilizzati, le loro proteine bersaglio devono essere convalidate come bersagli terapeutici in specifici tipi di cancro. Questa convalida viene spesso eseguita eliminando il gene che codifica per il bersaglio terapeutico candidato in un modello di cancro del topo geneticamente modificato (GEM) e determinando quale effetto questo ha sulla crescita del tumore. Sfortunatamente, questioni tecniche come la letalità embrionale nei knockout convenzionali e il mosaicismo nei knockout condizionali spesso limitano questo approccio. Per superare queste limitazioni, è stato sviluppato un approccio per ablare un gene letale embrionale floxed di interesse in colture a breve termine di tumori maligni della guaina del nervo periferico (MPNNT) generati in un modello GEM.

Questo articolo descrive come stabilire un modello murino con il genotipo appropriato, derivare colture tumorali a breve termine da questi animali e quindi ablare il gene letale embrionale flossato utilizzando un vettore adenovirale che esprime Cre ricombinasi e proteina fluorescente verde potenziata (eGFP). Viene quindi dettagliata la purificazione delle cellule trasdotte con adenovirus utilizzando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e la quantificazione degli effetti che l'ablazione genica esercita sulla proliferazione cellulare, la vitalità, il trascrittoma e la crescita dell'allotrapianto ortotopico. Queste metodologie forniscono un approccio efficace e generalizzabile per identificare e convalidare bersagli terapeutici in vitro e in vivo. Questi approcci forniscono anche una fonte rinnovabile di cellule derivate da tumori a basso passaggio con artefatti di crescita in vitro ridotti. Ciò consente di studiare il ruolo biologico del gene bersaglio in diversi processi biologici come la migrazione, l'invasione, le metastasi e la comunicazione intercellulare mediata dal secretoma.

Introduzione

Prima degli ultimi due decenni, il trattamento dei tumori umani si basava fortemente sulla radioterapia e sugli agenti chemioterapici che miravano ampiamente alle popolazioni cellulari in rapida proliferazione danneggiando il DNA o inibendo la sintesi del DNA. Sebbene questi approcci abbiano inibito la crescita delle cellule tumorali, hanno anche avuto effetti collaterali deleteri su normali tipi di cellule in rapida proliferazione come le cellule epiteliali intestinali e le cellule del follicolo pilifero. Più recentemente, la terapia del cancro ha iniziato a utilizzare agenti chemioterapici che colpiscono con precisione le proteine all'interno delle vie di segnalazio....