Un test di fluorescenza per valutare la permeabilità di una barriera endoteliale microvascolare cardiaca in un modello di ischemia/riperfusione di ratto

Sommario

Qui, descriviamo un metodo per valutare funzionalmente la barriera endoteliale dei microvasi cardiaci dopo danno da ischemia/riperfusione attraverso la misurazione dell'intensità media di fluorescenza di 70.000 Da FITC-destrano stravasato rispetto al blu di Evans.

Abstract

Le terapie di rivascolarizzazione per le arterie colpevoli, indipendentemente dall'intervento coronarico percutaneo e dall'innesto di bypass coronarico, sono considerate la migliore strategia per migliorare la prognosi clinica dei pazienti con sindrome coronarica acuta (SCA). Tuttavia, la riperfusione miocardica a seguito di un'efficace rivascolarizzazione può innescare una significativa morte dei cardiomiociti e il collasso dell'endotelio coronarico, noto come danno da ischemia/riperfusione miocardica (MIRI). Di solito, le cellule endoteliali e le loro giunzioni strette intercellulari mantengono in modo cooperativo la barriera endoteliale microvascolare e la sua permeabilità relativamente bassa, ma falliscono nelle aree di riperfusione.

L'iperpermeabilità endoteliale microvascolare indotta da ischemia/riperfusione (IR) contribuisce all'edema miocardico, all'aumento dell'infiltrazione di cellule pro-infiammatorie e all'aggravamento dell'emorragia intramiocardica, che può peggiorare la prognosi della SCA. Il tracciante utilizzato in questo studio - 70.000 Da FITC-destrano, una molecola di glucosio ramificata marcata dall'isotiocianato di fluoresceina (FITC) - sembra troppo grande per infiltrarsi nell'endotelio microvascolare cardiaco in condizioni normali. Tuttavia, è in grado di infiltrarsi in una barriera rotta dopo la MIRI. Pertanto, maggiore è la permeabilità endoteliale, maggiore è la quantità di FITC-destrano che si accumula nello spazio intercellulare extravascolare. Pertanto, l'intensità della fluorescenza da FITC può indicare la permeabilità della barriera endoteliale microvascolare. Questo protocollo sfrutta il FITC-destrano per valutare funzionalmente la barriera endoteliale microvascolare cardiaca, che viene rilevata da un sistema automatizzato di imaging patologico quantitativo.

Introduzione

Il fatto che un numero crescente di pazienti con malattie coronariche abbia beneficiato delle terapie di rivascolarizzazione per decenni non nega le conseguenze fatali della MIRI. Come descritto da Yellon e Hausenloy, circa il 30% della dimensione finale dell'infarto può essere attribuito a MIRI¹. La disfunzione endoteliale microvascolare cardiaca è il meccanismo principale alla base della MIRI e del fenomeno del "no-reflow" ed è il bersaglio di molti agenti cardioprotettivi e delle classiche vie cardioprotettive². Inoltre, l'iperpermeabilità endoteliale dei microvasi può innescare l'edema miocardico³ e l'eccessiva infiltrazione di cellule pro-infiammatorie, inclusi neutrofili⁴, macrofagi ed ertrociti⁵.

Lo stress ossidativo indotto da MIRI e le citochine pro-infiammatorie sovraespresse, come i membri della famiglia dei fattori di necrosi tumorale⁶ e della famiglia delle interleuchine⁷, attivano le vie di segnalazione dell'apoptosi cellulare per accelerare la morte del miocardio ischemico. Gli eritrociti penetrano la barriera endoteliale vulnerabile e si accumulano nella matrice extracellulare (ECM) per formare un ematoma intramiocardico⁸. Le metalloproteinasi della matrice derivate da macrofagi e neutrofili disassemblano il collagene nella MEC, aumentando il rischio di complicanze meccaniche e di aneurisma ventricolare post-infarto⁹. Pertanto, la permeabilità della barriera endoteliale è un segno cruciale per la valutazione prognostica dell'infarto miocardico acuto e segna la gravità della MIRI in una certa misura.

Il FITC-destrano è una serie di polisaccaridi costituiti da diverse lunghezze di molecole di glucosio ramificate di peso molecolare che vanno da 4.000 Da a 70.000 Da. È ampiamente utilizzato come tracciante standard per dimostrare la permeabilità delle membrane cellulari, delle barriere fisiologiche funzionali come la barriera emato-encefalica¹⁰ e delle membrane mucose¹¹ in condizioni specifiche e patologiche. La permeabilità di una specifica membrana varia per diverse sostanze in base al loro peso molecolare. Di solito, l'albumina è limitata ai microvasi cardiaci; tuttavia, può penetrare nell'endotelio nella fase iniziale dell'IR, causando edema miocardico. Poiché il peso molecolare dell'albumina è di circa 68.000 Da, 70.000 Da FITC-destrano sarebbe un agente adatto per dimostrare l'iperpermeabilità endoteliale dopo IR. Inoltre, il destrano è stato ampiamente adottato per mantenere il volume ematico e la pressione osmotica colloidale dei pazienti in shock e i traccianti marcati con FITC sono utilizzati in numerosi studi in vivo o in vitro con pochi effetti avversi.

Oltre al FITC-destrano, la permeabilità endoteliale è stata misurata con la colorazione Evans Blue (EB). Dopo l'iniezione nella circolazione sanguigna, l'EB si lega strettamente all'albumina sierica e forma un complesso¹². Pertanto, questo complesso EB-albumina, non solo EB, può essere utilizzato per la misurazione della permeabilità, il che significa che l'accuratezza di tale metodo basato su EB può essere influenzata da diverse concentrazioni di albumina sierica in soggetti sperimentali. Inoltre, è stato riportato che l'EB avvelena gli organi degli animali da esperimento, in particolare il cuore, il fegato e i polmoni, attraverso la degenerazione cellulare e l'aumento della permeabilità vascolare¹³. L'endotelio sottoposto a ischemia/riperfusione sarebbe più sensibile a tali effetti dannosi rispetto all'endotelio normale, il che può confondere il significato dei risultati sperimentali.

Rispetto al colorante EB, il FITC-destrano è esogeno e l'affinità di legame con l'albumina è trascurabile. Quindi, il FITC-destrano rimane allo stato libero e non è legato da macromolecole, come l'albumina e le proteine dei tessuti. Pertanto, se somministrato in base al peso corporeo, il FITC-destrano può funzionare a parità di concentrazione ematica e non è influenzato dalle differenze individuali nella concentrazione sierica di albumina e nel volume ematico. Il Tongxinluo (TXL), una medicina tradizionale cinese, è stato utilizzato per testare la sensibilità diagnostica di questo metodo. Il TXL riduce la MIRI mantenendo l'ultrastruttura cellulare endoteliale e l'integrità della barriera endoteliale¹⁴. Il TXL è anche usato per curare l'angina pectoris e migliorare clinicamente il no-reflow miocardico dopo l'infarto¹⁵. Contiene Radix ginseng, Buthus martensi, Hirudo, Eupolyphaga seu steleophaga, Scolopendra subspinipes, Periostracum cicadae, Radix paeoniae rubra, Semen ziziphi spinosae, Lignum dalbergiae odoriferae, Lignum santali albi e Borneolum syntheticum. È stato dimostrato che TXL protegge l'endotelio microvascolare attraverso la via MEK/ERK¹⁶ e i meccanismi mediati dall'ossido nitrico sintasi^{endoteliale 5,17} e allevia il danno da ischemia/riperfusione (IRI) degli organi¹⁸, in particolare del cuore, in modo dose-dipendente. Qui, i ratti sono stati alimentati con 0,5 g/kg di polvere di TXL (una dose equivalente a quella utilizzata clinicamente nell'uomo) come descritto¹⁹. Questo articolo fornisce un metodo per valutare funzionalmente la barriera endoteliale dei microvasi cardiaci dopo IR attraverso la misurazione dell'intensità totale di fluorescenza di 70.000 Da FITC-destrano stravasato rispetto all'EB.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" pubblicata dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (Bethesda, MD, USA, NIH Publication No. 85-23, rivista nel 1996) e il "Regolamento per la cura e l'uso degli animali da esperimento" del Consiglio di Pechino sulla cura degli animali (1996). Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato per la cura degli animali da esperimento dell'ospedale di Fuwai. In questo studio sono stati utilizzati ratti maschi Sprague-Dawley di classe SPF (ratti SD) del peso di 150-180 g.

1. Preparazione di reagenti, materiali e attrezzature

1. Preparare reagenti e soluzioni tra cui etanolo al 70%, FITC-destrano (70.000 Da, disciolto in soluzione salina ghiacciata per ottenere una soluzione al 10% p/v da utilizzare), crema depilatoria, terreno di montaggio con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 0,5-10 μg/mL), soluzione EB/soluzione salina all'1% p/v e soluzione sodica sodica/salina al 5% p/v (conservata a 4 °C al buio).
2. Sterilizzare in anticipo tutti gli strumenti e i materiali chirurgici, compreso il nastro chirurgico; garze; guanti chirurgici; Tubo endotracheale da 16 G; siringa da insulina; forbici operative; pinze da dissezione grandi e curve; pinza da dissezione diritta; pinze per zanzare diritte; pinze per zanzare curve; divaricatori (30 mm di apertura); Portamicroaghi da 5 cm; sutura in polipropilene 3-0 (ago conico); e sutura in polipropilene 6-0 (ago rotondo).
3. Controllare e assicurarsi che tutte le apparecchiature, inclusi il sistema di riscaldamento a temperatura costante, il sistema di illuminazione, il ventilatore, il sistema automatizzato di imaging patologico quantitativo e l'affettatrice per congelamento a raggi ultravioletti, siano in buone condizioni.

2. Preparazione dei ratti per le procedure chirurgiche

1. Dividi tutti i ratti SD in gruppo Sham, gruppo IR e gruppo TXL (gruppo IR+TXL) in modo casuale.
   NOTA: In questo protocollo, sei ratti sono stati assegnati in modo casuale a ciascun gruppo, n=6.
2. Pesare ogni ratto SD, registrare il peso e calcolare la dose di TXL da somministrare per ogni ratto.
3. Somministrare ibuprofene alla dose di 30 mg/kg mediante sonda gastrica a ciascun ratto almeno 12 ore prima della toracotomia per alleviare il dolore e l'angoscia preoperatoria.
4. Somministrare una polvere superfine di TXL alla dose di 0,5 g/kg mediante sonda gastrica 12 ore e 1 ora a ciascun ratto SD nel gruppo IR+TXL prima dell'anestesia, come descritto¹⁹.
5. Disinfettare il tavolo operatorio con etanolo al 70% e posizionare gli strumenti e i materiali chirurgici sterilizzati sulla superficie disinfettata.
6. Regolare la temperatura del sistema di riscaldamento a temperatura costante per mantenere la temperatura corporea dei ratti a 37 ± 1 °C.

3. Stabilire un modello di ischemia/riperfusione cardiaca nel ratto

1. Iniettare una soluzione salina tamponata con sodio/fosfato (PBS) al 5% p/v di pentobarbital alla dose di 50 mg/kg (0,1 ml/100 g di peso corporeo) nella cavità addominale per anestetizzare il ratto. Preparare il sito chirurgico rimuovendo con cura il pelo dal collo al petto mediante rasatura o utilizzando una crema depilatoria.
2. Regolare delicatamente la posizione della lingua secondo necessità con una pinzetta sterilizzata e pulire le secrezioni respiratorie con batuffoli di cotone sterilizzati. Tenere la glottide ben in vista e inserire delicatamente un tubo endotracheale nella trachea.
3. Collegare il tubo endotracheale a un ventilatore che gira a 65-80 respiri al minuto e regolare il volume corrente a 4-5 ml fissando la testa e gli arti del ratto.
4. Posizionare un telo sterile sul ratto, disinfettare l'area operatoria con tintura di iodio seguita da etanolo al 70% e ripetere questa procedura tre volte.
5. Praticare un'incisione parasternale sinistra a livello del quarto spazio intercostale per esporre il muscolo grande pettorale sinistro e il piccolo pettorale.
6. Sezionare la fascia tra il muscolo grande pettorale e il piccolo pettorale utilizzando una tecnica di dissezione smussata per esporre il quarto spazio intercostale sinistro.
   NOTA: Evitare danni eccessivi ai tessuti e lesioni vascolari che causeranno gravi emorragie e morte postoperatoria.
7. Sezionare i muscoli intercostali, posizionare un divaricatore toracico all'interno del quarto spazio intercostale, quindi allargare le costole.
8. Strappare il pericardio e rimuovere il tessuto adiposo attaccato.
   NOTA: Evitare di danneggiare altri organi con strumenti chirurgici affilati, in particolare i polmoni. Il danno ai polmoni può provocare lo sviluppo di pneumotorace ed emopneumotorace durante l'operazione, causando conseguenze cacoetiche che vanno dai disturbi emodinamici alla ridotta sopravvivenza degli animali.
9. Manipolare la posizione del timo ed esporre delicatamente l'aorta ascendente e gli atri sinistri. Identificare e legare l'arteria discendente anteriore sinistra prossimale (LAD) transitoriamente per 45 minuti con una sutura in polipropilene 6-0 (vedere Figura 1 A-D).
   NOTA: Questa procedura è identica per i ratti di controllo fittizi, tranne per il fatto che il LAD non è legato.
10. Rimuovere il divaricatore toracico e unire le costole in uno schema di sutura interrotto con una sutura in polipropilene 3-0.
11. Ripristinare la pressione intratoracica negativa per garantire una respirazione efficace.
    NOTA: Due metodi possono essere utilizzati per ripristinare la pressione intratoracica negativa: i) prima di chiudere la cavità toracica, i ricercatori possono tappare l'uscita dell'aria del ventilatore per 2 cicli per gonfiare i polmoni. ii) L'aria rimasta nella cavità toracica può essere estratta con una siringa dopo che lo spazio intercostale è stato chiuso.
12. Dopo la depilazione e la disinfezione, praticare un'incisione nell'arto inferiore destro e sezionare la fascia superficiale dalla vena femorale destra.
13. Allentare la legatura e controllare le condizioni di respirazione e circolazione dopo aver indotto l'ischemia miocardica per 45 minuti.
14. Iniettare il 10% (p/v) di soluzione FITC-destrano/soluzione salina nella vena femorale a 0,15 mL/100 g di peso corporeo e premere la vena femorale per 1 minuto con batuffoli di cotone sterili per arrestare l'emorragia (Figura 2A, B).
    NOTA: In alternativa, iniettare l'1% p/v di soluzione fisiologica di EB/soluzione fisiologica nella vena femorale alla dose di 0,5 ml/100 g di peso corporeo.
15. Cucire le incisioni con una sutura in polipropilene 3-0 e disinfettare le incisioni, seguita da analgesia postoperatoria con ibuprofene, come descritto sopra.

4. Preparazione di fette di tessuto congelato per la misurazione della fluorescenza

1. Iniettare una soluzione di pentobarbital sodico/PBS al 5% p/v alla dose di 150 mg/kg (0,3 ml/100 g di peso corporeo) per via intraperitoneale per anestetizzare profondamente i ratti dopo 3 ore di riperfusione miocardica.
2. Tagliare la cavità addominale ed esporre l'aorta addominale e la vena cava (vedi Figura 3A).
3. Iniettare costantemente 50 ml di PBS ghiacciato nella vena cava, tagliare l'aorta addominale per eliminare il sangue dal miocardio e prelevare il cuore.
   NOTA: Osservare i cambiamenti nei polmoni e nel fegato. Il sudorazione del fegato suggerisce che la soluzione salina viene iniettata accuratamente nella vena cava (vedi Figura 3C) e un polmone pallido è considerato un segno di un miocardio ben perfuso (vedi Figura 3B).
4. In una stanza buia, sciacquare delicatamente il cuore con soluzione salina ghiacciata o PBS per rimuovere il sangue rimanente e il FITC-destrano (o EB) dalle camere del cuore.
5. Taglia il cuore dalla legatura e scarta il miocardio sopra la legatura.
6. Incorporare il cuore in stampi con composto di inclusione seguito da conservazione a -80 °C.
7. Scaricare i fazzoletti congelati dagli stampi di inclusione e caricarli sui portacampioni in una camera preraffreddata a -20 °C di un'affettatrice per congelamento.
8. Regolare lo spessore di una singola fetta a 5-8 μm e affettare il tessuto approssimativamente al punto medio dell'asse base-apice (ad esempio, il centro dell'ischemia).
9. Caricare il tessuto affettato su vetrini adesivi da microscopio e sigillare ogni fetta con una goccia (circa 40 μL) di terreno di montaggio fluorescente contenente DAPI.
10. Conservare i vetrini in una scatola asciutta e buia.
    NOTA: Se non è possibile eseguire immediatamente la scansione dei vetrini, conservarli in un luogo asciutto, fresco e buio per evitare la formazione di acqua di condensa e l'estinzione della fluorescenza.

5. Misura della fluorescenza e analisi dei dati

1. Configurare il sistema di imaging e controllare il software collegato allo scanner.
2. Caricare i vetrini negli appositi ripiani e inserirli nello scanner.
3. Aprire il software dello scanner di diapositive (vedere la Tabella dei materiali) e impostare un nuovo protocollo di esposizione facendo clic su Modifica protocollo | Nuovo....
   NOTA: Se lo scanner o il suo software affiliato non sono disponibili, un microscopio confocale laser (vedere la Tabella dei materiali) o altri normali scanner per vetrini con la modalità di fluorescenza (vedere la Tabella dei materiali) possono essere un'alternativa allo scanner a fluorescenza quantitativa automatizzata.
4. Rinominare il protocollo e lo studio e selezionare la modalità di fluorescenza .
5. Definizione della scansione dell'intero vetrino | Risoluzione dei pixel e regioni multispettrali | Risoluzione dei pixel rispettivamente di 0,25 μm (40x ).
6. Fare clic su Modifica filtri e bande... per selezionare la colonna Filtri scansione diapositive intere e la colonna Bande regione multispettrale .
   NOTA: Se si utilizza EB, selezionare Filtri scansione vetrini interi | DAPI e Texas Red o AF495. Se si utilizza FITC-destrano, selezionare Bande della regione multispettrale | DAPI e FITC o AF488.
7. Clicca su Modifica esposizioni... e carica il vettore.
8. Seleziona lo slot di destinazione e fai clic su Acquisisci panoramica.
   NOTA: Questo esegue una scansione in campo chiaro di ciascuna sezione del cuore. Selezionare il miocardio per la messa a fuoco o selezionare l'area alla cieca.
9. Selezionare la diapositiva di destinazione, regolare l'altezza del tavolino a circa -50 μm e fare clic su Messa a fuoco automatica.
10. Fare clic su Esposizione dell'intera scansione (ms)-DAPI | Esposizione automatica.
    NOTA: Il tempo di esposizione di DAPI per ogni vetrino non deve essere lo stesso perché le immagini con DAPI vengono utilizzate per illustrare le sezioni trasversali del cuore, che sono convenienti per delineare l'area del miocardio ma non per calcolare la densità di fluorescenza.
11. Fare clic su Esposizione scansione intera (ms)-FITC | Esposizione automatica.
    NOTA: Fare clic su Esposizione dell'intera scansione (ms)-Texas Red | Esposizione automatica se si utilizza EB. È importante ricordare e assicurarsi che il tempo di esposizione di FITC o Texas Red sia lo stesso in tutte le scansioni dei vetrini.
12. Fare nuovamente clic su Messa a fuoco automatica e assicurarsi che la diapositiva sia a fuoco.
13. Fare clic su Indietro e salvare il protocollo.
14. Ripetere i passaggi 5.7-5.14 per ogni diapositiva.
15. Torna alla home page e fai clic su Scansiona diapositive.
16. Selezionare uno slot, rinominare tutte le diapositive e selezionare il protocollo di esposizione corrispondente per ciascuna diapositiva.
17. Scansiona le diapositive e cattura le immagini.
18. Aprire le immagini con il software di visualizzazione delle diapositive per le scansioni (vedere la Tabella dei materiali).
19. Ingrandisci tutte le immagini in misura relativamente uguale.
20. Istantanea e salva le immagini come .tiff.
    NOTA: È meglio salvare contemporaneamente le immagini con e senza barre di scala. Le immagini con barre di scala possono essere utilizzate per la pubblicazione, mentre quelle senza barre di scala possono essere utilizzate per l'analisi statistica.
21. Aprire il software ImageJ, fare clic su Analizza e selezionare Imposta misurazione.
22. Seleziona area | Densità integrata.
23. Aprire l'immagine nel canale FITC con l'immagine J.
24. Fare nuovamente clic su Analizza e registrare il valore numerico della densità integrata (IntDen) che appare.
    NOTA: poiché le barre della scala nelle immagini possono essere scambiate per la scala di grigi della fluorescenza dai computer, utilizzare immagini senza barre della scala per misurare l'IntDen.
25. Chiudere l'immagine FITC e aprire l'immagine nel canale DAPI.
26. Delinea una sezione trasversale del miocardio.
27. Fare clic su Analizza e raccogli dati area .
28. Calcolare i rapporti IntDen/Area (media della fluorescenza) per ciascun cuore.
29. Inserisci tutti i rapporti nel software di analisi statistica.

Risultati

Prima di eseguire il test FITC-destrano per valutare i cambiamenti nella permeabilità endoteliale cardiaca dopo IR, raccomandiamo vivamente che gli esperimenti siano condotti dallo stesso ricercatore specializzato nella creazione di un modello IR miocardico nei ratti per confermare che le arterie coronarie sono occluse con successo nella stessa posizione e che i rapporti tra area ischemica/area totale sono costanti tra tutti i ratti. Come mostrato nella Figura 1A, B, il cuore (indicato dalla freccia gialla) era esposto e si è formata un'ansa (indicata dalla freccia verde) nel miocardio situato nella parete anteriore del ventricolo sinistro, a circa 2 mm sotto il bordo dell'appendice atriale sinistra con un tubo capillare in silicone da 0,5 mm (diametro interno) e sutura 6-0. Come si vede nella Figura 1C, quando l'ansa è stata fissata, il miocardio ischemico è passato immediatamente dal rosa al rosa grigiastro (indicato dalla freccia bianca).

Inoltre, il miocardio si è riperfuso e ha recuperato il suo colore rosa subito dopo che l'ansa è stata allentata, come illustrato nella Figura 1D. Dopo aver allentato l'anello, è stata praticata un'incisione parallela all'asse lungo del femore nell'interno coscia. La vena femorale è stata esposta e perforata con una siringa da insulina, come mostrato nella Figura 2A, B. Dopo una riperfusione di 3 ore, è stata praticata un'incisione a "V" nell'addome inferiore e l'aorta addominale e la vena cava sono state sezionate dal peritoneo (Figura 3A). La soluzione salina fredda è stata iniettata delicatamente nella vena cava e l'aorta addominale è stata tagliata per evitare che la parete ventricolare si allungasse eccessivamente a causa della pressione intraventricolare che ne avrebbe influenzato la struttura istopatologica. I polmoni sbiancati (freccia rossa nella Figura 3B) e il fegato nella Figura 3C indicano che il tessuto era ben riperfuso con soluzione fisiologica.

Di conseguenza, non c'era alcuna differenza significativa nell'area della sezione trasversale tra i tre gruppi: 1,00 ± 0,08 nel gruppo Sham contro 0,97 ± 0,08 nel gruppo IR contro 1,02 ± 0,04 nel gruppo IR+TXL (Figura 4A, n = 6 in ciascun gruppo, p > 0,05 tra due gruppi qualsiasi). Come mostrato nella Figura 4B, C, l'intensità media della fluorescenza verde in tutte le sezioni dei ratti Sham era estremamente bassa. Al contrario, la fluorescenza emessa dal FITC-destrano stravasato è aumentata notevolmente nel gruppo IR, normalizzato al gruppo Sham (5,52 ± 0,85 nel gruppo IR rispetto a 1,00 ± 0,19 nel gruppo Sham, n = 6, p < 0,05). Inoltre, la polvere superfine TXL, nota per proteggere l'endotelio microvascolare cardiaco^14,16, ha notevolmente invertito la maggiore intensità di fluorescenza indotta dall'IR (2,87 ± 0,52 nel gruppo IR+TXL rispetto a 5,52 ± 0,85 nel gruppo IR, n = 6, p < 0,05). Le immagini del miocardio regionale hanno indicato che il FITC-destrano si accumulava in modo schiacciante nella matrice extracellulare ma non nei microvasi e che il TXL migliorava la funzione della barriera endoteliale (Figura 5).

Rispetto al FITC-destrano, l'EB può essere un'alternativa non ottimale perché l'EB è inferiore a 70.000 Da FITC-destrano sia in termini di qualità dell'immagine che di sensibilità. Allo stesso modo, non c'era alcuna differenza significativa nell'area della sezione trasversale tra i tre gruppi: 1,00 ± 0,08 nel gruppo Sham contro 0,97 ± 0,08 nel gruppo IR contro 0,98 ± 0,05 nel gruppo IR+TXL (Figura supplementare S1A, n = 6 in ciascun gruppo, p > 0,05 tra due gruppi qualsiasi). Come mostrato nella Figura supplementare S1B, C, l'intensità media della fluorescenza rossa in intere sezioni trasversali di ratti Sham era relativamente più alta, specialmente nell'endocardio e nell'epicardio. Sebbene la fluorescenza rossa emessa dall'EB sia aumentata bruscamente nel gruppo IR (4,41 ± 0,66 nel gruppo IR rispetto a 1,00 ± 0,22 nel gruppo Sham, n = 6, p < 0,05), la differenza tra i gruppi IR+TXL e IR non era significativa (3,73 ± 0,47 nel gruppo IR+TXL rispetto a 4,41 ± 0,66 nel gruppo IR, n = 6, p = 0,0956).

Inoltre, questo metodo è stato testato in un modello di infarto del miocardio (IM) (Figura supplementare S2). Nel gruppo Myocardico I njectionfirst (MII), la soluzione di FITC-destrano (alla stessa concentrazione menzionata in precedenza) è stata iniettata in circolo 5 minuti prima della legatura LAD. Ciò era in contrasto con la soluzione di FITC-destrano iniettata immediatamente dopo la legatura nei ratti MIL (Mifarczione iocardicaper prima) descritta in precedenza in questo protocollo. È interessante notare che solo basse quantità di FITC-destrano sono state stravasate nella ECM del miocardio danneggiato nei ratti MI di entrambi i gruppi, indicate da una debole intensità di fluorescenza verde nella Figura S2 supplementare.

Figura 1: Campo visivo della toracotomia e instaurazione di ischemia/riperfusione in un modello di ratto. (A) Esporre il cuore del ratto (indicato da una freccia gialla); (B) formando un anello per circondare l'arteria coronaria (indicato da una freccia verde); (C) allacciamento dell'ansa e induzione dell'ischemia miocardica per 45 minuti (indicato da una freccia bianca); (D) allentando l'ansa e consentendo la riperfusione miocardica per 3 ore (indicata dalla freccia blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dissezione della vena femorale e iniezione endovenosa. (A) Esposizione della vena femorale (il nervo femorale è indicato dalla freccia a sinistra; l'arteria femorale è indicata dalla freccia al centro; la vena femorale è indicata dalla freccia a destra). (B) Iniezione di soluzione di FITC-destrano nella vena femorale con una siringa da insulina. Abbreviazione: FITC = isotiocianato di fluoresceina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Perfusione tissutale e sintomi di una perfusione efficiente. (A) Sezionamento dell'aorta addominale e della vena cava (l'aorta addominale è indicata dalla freccia bianca; la vena cava è indicata dalla freccia nera). (B) I polmoni sbiancati sono un sintomo di un'adeguata perfusione; (C) mucosa sbiancata, rene sbiancato e sudorazione epatica sono tutti sintomi di adeguata perfusione (freccia rossa: mucosa; freccia bianca: fegato; freccia nera: rene). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini rappresentative e analisi dell'intensità media di fluorescenza mediante colorazione FITC-destrano. (A) Area della sezione trasversale relativa di ciascun gruppo normalizzata a quella del gruppo Sham (p > 0,05); (B) intensità di fluorescenza relativa nel canale FITC di ciascun gruppo normalizzata a quella del gruppo Sham; (C) immagini rappresentative con ingrandimento 9,5x in ciascun gruppo. Barre di scala = 800 μm. ANOVA unidirezionale con i confronti post-hoc di più gruppi di Tukey. * contro il gruppo Sham, p < 0,05; # contro il gruppo IR, p < 0,05. I grafici a barre mostrano la media del gruppo ± SD. Abbreviazioni: IR = ischemia/riperfusione; TXL = Tongxinluo; FITC = isotiocianato di fluoresceina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo; ANOVA = analisi della varianza; SD = deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini rappresentative delle aree di interesse con ingrandimento 200x di ciascun gruppo dopo colorazione FITC-destrano. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: FITC = isotiocianato di fluoresceina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1 supplementare: Immagini rappresentative e analisi dell'intensità media della fluorescenza mediante colorazione con blu di Evans. (A) Area della sezione trasversale relativa di ciascun gruppo normalizzata a quella del gruppo Sham (p > 0,05); (B) intensità relativa di fluorescenza nel canale rosso del Texas di ciascun gruppo normalizzata a quella del gruppo Sham; (C) immagini rappresentative in ciascun gruppo. ANOVA unidirezionale con i confronti post-hoc di più gruppi di Tukey. Barre della scala = 800 μm. * rispetto al gruppo Sham, p < 0,05. I grafici a barre mostrano la media del gruppo ± SD. Abbreviazioni: IR = ischemia/riperfusione; TXL = Tongxinluo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo; ANOVA = analisi della varianza; SD = deviazione standard. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S2 supplementare: Immagini rappresentative con ingrandimento 9,5x della colorazione FITC-destrano in un modello di infarto del miocardio. Barre di scala = 800 μm. Abbreviazioni: MII = iniezione prima di infarto del miocardio (iniettare FITC-destrano prima dell'infarto del miocardio); MIL = legatura prima dell'infarto del miocardio (iniettare FITC-destrano subito dopo l'infarto del miocardio); FITC = isotiocianato di fluoresceina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo articolo presenta un protocollo per valutare la disfunzione della barriera endoteliale cardiaca dopo essere stati esposti a MIRI. Va notato che ci sono diversi passaggi cruciali in questo protocollo che determinano l'affidabilità e l'accuratezza dei risultati. Tutti i passaggi che coinvolgono il destrano FITC devono essere eseguiti in una stanza buia. Le soluzioni FITC-destrano/soluzione salina devono essere conservate a 4 °C e avvolte con carta stagnola. Inoltre, le arterie coronarie devono essere legate, come illustrato nella Figura 1, in modo che il miocardio possa essere riperfuso immediatamente dopo l'allentamento dell'ansa. I ricercatori possono scegliere suture in polietilene 5-0 o 6-0 perché le corde più sottili sotto il 7-0 hanno maggiori probabilità di tagliare le fibre e i vasi miocardici. È importante sottolineare che la soluzione tracciante deve essere iniettata nelle vene femorali e non nelle vene della coda. Ogni cuore deve essere ben perfuso e ben risciacquato con soluzione salina ghiacciata prima e dopo essere stato sacrificato, rispettivamente.

Molti ricercatori specializzati in MIRI sono inclini a studiare la struttura subcellulare interrotta dell'endotelio nella fase iniziale della riperfusione miocardica - la formazione di corpi apoptotici, mitocondri gonfi e giunzioni intercellulari anormali - per dimostrare l'iperpermeabilità dell'endotelio tramite esame al microscopio elettronico. L'immunoblotting è stato utilizzato anche per misurare la permeabilità microvascolare perché la diminuzione dei livelli di proteine a congiunzione stretta è considerata il meccanismo principale del danno endoteliale e del malfunzionamento della barriera endoteliale nel tempo. Ad esempio, la VE-caderina²⁰ e la β-catenina²¹ sono elementi chiave delle giunzioni di adesione cellula-cellula endoteliali e queste connessioni contribuiscono al mantenimento dell'integrità vascolare²². Anche le giunzioni strette, come JAM-A^23,24 e l'occludina²⁵, partecipano in modo cooperativo alla costruzione della barriera endoteliale nel sistema circolatorio.

Attualmente, un numero crescente di studi suggerisce che la funzione mitocondriale e l'omeostasi mitocondriale potrebbero essere bersagli chiave delle vie protettive contro il danno da riperfusione. Come riportato in studi fisiopatologici e farmacologici, la mitofagia può svolgere un ruolo importante nella morte cellulare dell'endotelio e del miocardio indotta da IR²⁶. Inoltre, la fissione mitocondriale, la proteostasi mitocondriale e il controllo della qualità mitocondriale possono proteggere il miocardio ad alto rischio nelle aree riperfuse ^27,28. I metodi di cui sopra si concentrano più sulla dimostrazione di diversi meccanismi o cause di iperpermeabilità che sulla visualizzazione diretta e visiva della permeabilità endoteliale. Inoltre, la preparazione del campione per l'esame al microscopio elettronico è complicata e pericolosa. Le soluzioni di glutaraldeide, acetone e acido osmico utilizzate nella microscopia elettronica probabilmente volatilizzano ed erodono la mucosa, la congiuntiva e la pelle, minacciando persino la vita se utilizzate in ambienti non controllati.

Rispetto a questi metodi indiretti e pericolosi per la vita, questo metodo, che misura l'intensità della fluorescenza emessa dallo stravaso di FITC-destrano, è ideale per valutare la permeabilità microvascolare cardiaca. In primo luogo, 70.000 Da FITC-destrano non possono penetrare attraverso l'endotelio in condizioni fisiologiche normali, ma possono entrare nello spazio interstiziale miocardico sotto IR, il che consente una chiara differenziazione tra i ratti sottoposti a diversi trattamenti. Inoltre, la soluzione di FITC-destrano viene iniettata nel sangue attraverso le vene femorali, il che garantisce che tutto il fluido venga iniettato nella circolazione del ratto. Al contrario, l'iniezione della vena caudale è più difficile nei ratti perché la vena caudale è indistinta e ricoperta da uno strato spesso. Inoltre, a differenza della normale fissazione con paraformaldeide e dell'inclusione di paraffina, il trattamento del tessuto miocardico è semplificato e ottimizzato utilizzando la tecnica della sezione patologica a congelamento rapido utilizzata in questo studio. Il breve tempo di conservazione, l'ambiente a prova di luce e la crioconservazione possono insieme alleviare l'estinzione della fluorescenza di FITC.

Ancora più importante, questo metodo può ridurre al minimo il bias di selezione durante l'analisi statistica. Eseguiamo una perfusione cardiaca sufficiente con soluzione fisiologica per garantire che quasi tutto il sangue miscelato con FITC-destrano venga espulso dal miocardio e dalle camere cardiache, il che può eliminare la fluorescenza emessa da qualsiasi FITC rimasto nei vasi. In caso contrario, la fluorescenza fusa con i capillari deve essere esclusa e tagliata artificialmente. Durante la raccolta di tessuto dalle aree di interesse, non è stato osservato alcun confine visivo tra il miocardio ischemico e il miocardio remoto, specialmente dopo la colorazione con colorante EB. Ciò ha ostacolato la raccolta di campioni da queste aree rappresentative. Utilizzando il metodo qui descritto, i ricercatori possono ottenere immagini di intere sezioni e analizzare l'intensità della fluorescenza utilizzando uno scanner a scorrimento quantitativo.

È interessante notare che il colorante EB può essere un'alternativa, anche se non ottimale, al FITC-destrano. Rispetto alle condizioni di conservazione relativamente difficili del FITC-destrano, la polvere di EB o la sua soluzione possono rimanere stabili a temperatura ambiente per lungo tempo. Inoltre, l'EB è relativamente economico per la maggior parte delle istituzioni. Tuttavia, alcuni svantaggi potrebbero limitarne l'applicazione. In primo luogo, la colorazione EB mostra una sensibilità inferiore rispetto al FITC-destrano, che può sottostimare le differenze tra i gruppi e aumentare la dimensione del campione di ciascun gruppo. Inoltre, l'EB mostra una maggiore adesione alle proteine. L'endocardio e l'epicardio sono più facilmente colorati dall'EB, il che può influenzare i risultati della densità di fluorescenza. Inoltre, evidenti difetti di riempimento nell'area di riperfusione riducono notevolmente la qualità dell'immagine, il che può limitare l'uso di EB.

Per estendere l'applicazione di questo metodo in un modello MI, il metodo è stato testato in un modello MI. In primo luogo, il FITC-destrano è stato iniettato nei vasi sanguigni dopo la legatura LAD. Come previsto, un basso livello di fluorescenza è stato emesso dalla fetta perché il FITC-destrano nel flusso sanguigno non può passare attraverso il sito legato e nessun FITC-destrano è entrato nell'area ischemica. Il FITC-destrano è stato applicato anche 5 minuti prima della legatura per garantire il passaggio del FITC-destrano in tutti gli organi. Di conseguenza, il FITC-destrano non è riuscito a penetrare l'endotelio microvascolare, probabilmente perché nessuna pressione di perfusione nei vasi sanguigni legati può guidare il FITC-destrano attraverso l'endotelio. In generale, questo metodo richiede probabilmente molte più modifiche per soddisfare la sua applicazione nel modello MI.

Nonostante i vantaggi di cui sopra, ci sono dei limiti a questo metodo. In primo luogo, questo protocollo non è stato testato in modelli IR di altri animali, il che potrebbe limitarne l'applicazione negli studi preclinici e clinici. In secondo luogo, i coloranti etichettati con FITC sono più costosi di altri coloranti comuni come l'EB. Tuttavia, a differenza dell'EB, poiché la soluzione di FITC-destrano al 10% p/v, diluita con siero, raramente cambia il colore del miocardio, la colorazione FITC-destrano e la doppia colorazione EB/2,3,5-trifeniltetrazolo cloruro (TTC) possono essere condotte nello stesso cuore, il che può ridurre il budget rispetto al numero di animali e ai coloranti utilizzati. Infine, lo scanner per vetrini utilizzato in questo studio, lo scanner quantitativo per vetrini e strumenti simili, potrebbe non essere disponibile in alcuni laboratori. In sintesi, questo protocollo presenta un metodo semplificato, affidabile e visivo per il rilevamento della permeabilità endoteliale microvascolare cardiaca in un modello IR nei ratti utilizzando un test di fluorescenza basato su un sistema di imaging patologico quantitativo automatizzato. Questo protocollo dimostra che 70.000 Da FITC-destrano si comporta meglio dell'EB nella valutazione funzionale della barriera endoteliale dei microvasi cardiaci dopo una lesione IR.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
16 G Angiocather	Becton Dickinson, USA	2089312
Sutura in polipropilene 3-0, ago conico	Ethicon, USA	KGP693
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Invitrogen, USA	D3571	Alternativa al mezzo di montaggio con
sutura in polipropilene DAPI 6-0, ago rotondo	Ethicon, USA	KGJ656
Vetrini adesivi per microscopio	CITOTEST, Cina	188105
ALC-V8S Ventilatore	Shanghai Alcott Biotech, Cina	ALC-V8S Sistema di
riscaldamento a temperatura costante	Shanghai Alcott Biotech, Cina	ALC-HTP203
Pinze da dissezione-Large Cvd	RWD life Science, Cina	F12007-10
Pinze da dissezione-Str	RWD life Science, Cina	F12005-10
FITC-destrano, 70.000Da	Sigma-Aldrich, USA	53471
Crema depilatoria	Nair, USA	NA
Siringa da insulina, 1ml	Becton Dickinson, USA	8155672
Portaaghi per microaghi	RWD Life Science, Cina	F31047-12
Pinze per zanzare-CVD	RWD life Science, Cina	F22007-12
Supporto di montaggio con DAPI	ZSGB-BIO, Cina	ZLI-9557
Sistema di illuminazione a fibra ottica multiposizione	RWD life Science, Cina	76301
Forbici operative	RWD life Science, Cina	S14014-12
Scansione panoramica	3DHISTECH, Budapest, Ungheria	SC150-211305	Scansione di diapositive alternativa a Vectra Polaris
Phenochart 1.0.8	PerkinElmer, USA	N/A	Software per la visualizzazione di vetrini
Soluzione salina tamponata con fosfato	HyClone, USA	Divaricatori SH30256.01
, 30 mm di diffusione, 5 cm	RWD Life Science, Cina	F22005-45
SP8 Microscopio confocale	Leica, tedesco	TCS-SP8 SR	Alternativa al nastro chirurgico Vectra Polaris
	3M, USA	1527C-0
Tissue-Tek O.C.T. Composto	SAKURA, Giappone	0822-00
Tongxinluo polvere superfine	Yiling, Cina	Z19980015
Affettatrice per congelamento a raggi ultravioletti	Leica, software tedesco	CM1950
Vectra Polaris 1.0.7	PerkinElmer, USA	N/A	Software di scansione
diapositive Vectra Polaris Scanner quantitativo per diapositive	PerkinElmer, Stati Uniti	VP1814N1068