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Articolo metodologico
La profilazione degli N-glicani delle glicoproteine è essenziale per scoprire nuovi biomarcatori e comprendere le funzioni dei glicani negli eventi cellulari. Inoltre, l'analisi degli N-glicani dei biofarmaci proteici è molto importante per l'uso umano. In questo articolo, è stata presentata una strategia ad alto rendimento per identificare e quantificare le strutture di N-glicani utilizzando la tecnica HILIC-FLD-MS/MS.
La glicosilazione è una modifica vitale che si trova nelle proteine. La profilazione degli N-glicani delle glicoproteine è necessaria per rilevare nuovi candidati biomarcatori e determinare le alterazioni dei glicani nelle malattie. La maggior parte delle proteine biofarmaceutiche disponibili in commercio sono glicoproteine. L'efficacia di questi farmaci è influenzata dai pattern di glicosilazione. Pertanto, è necessario un metodo di caratterizzazione approfondito per gli N-glicani. Qui, presentiamo un approccio completo per l'analisi qualitativa e quantitativa degli N-glicani utilizzando la cromatografia liquida a interazione idrofila dotata di rivelazione a fluorescenza e spettrometria di massa tandem (HILIC-FLD-MS/MS). Gli N-glicani sono stati rilasciati dalle glicoproteine con un metodo facile e marcati con un marcatore di fluoroforo di procainamide nella strategia. Successivamente, gli N-glicani marcati con procainamide sono stati analizzati con una tecnica HILIC-FLD-MS/MS. In questo approccio, le strutture degli N-glicani sono state confermate dall'analisi spettrometrica di massa tandem, mentre per l'analisi quantitativa è stata utilizzata la rilevazione della fluorescenza. Nello studio viene descritta un'applicazione per l'analisi dei dati dei picchi di N-glicani rilevati. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi glicoproteina estratta da varie specie.
La glicosilazione è una modificazione post-traduzionale vitale osservata nelle proteine1. Molteplici processi enzimatici regolano la modificazione della glicosilazione negli organismi cellulari. I glicani sono attaccati alle proteine da questi processi enzimatici e le proteine sottoposte a questa modifica sono chiamate glicoproteine1. Due tipi di glicosilazione sono comunemente osservati nelle proteine. L'O-glicosilazione è l'attaccamento degli O-glicani alla catena laterale dei residui di aminoacidi di serina o treonina. La N-glicosilazione è l'attaccamento de....
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NOTA: Il plasma umano utilizzato è disponibile in commercio (Tabella dei materiali). Non sono stati utilizzati ulteriori campioni biologici ottenuti dall'uomo.
1. Rilascio di glicani
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In questo approccio presentato, gli N-glicani sono stati prima rilasciati, marcati con il tag procainamide e purificati da cartucce SPE contenenti cellulosa. Quindi, l'analisi degli N-glicani di IgG, trastuzumab e plasma umano è stata eseguita da un sistema HPLC-HILIC-FLD-MS/MS. I cromatogrammi MS (picco base) e FLD delle strutture N-glicani determinate ottenute da IgG e trastuzumab sono mostrati rispettivamente nella Figura 1. I dati MS/MS ottenuti da queste anali.......
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La profilazione degli N-glicani delle glicoproteine comprende passaggi impegnativi. Sebbene esistano molte metodologie diverse per questo scopo, dovrebbe essere scelto un approccio adatto sia per l'identificazione che per la quantificazione delle strutture N-glicani 14. HILIC-FLD è l'approccio gold standard per la quantificazione degli N-glicani. Tuttavia, l'identificazione di tutti i tipi di N-glicani mediante rilevamento FLD n.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal Ministero dello Sviluppo della Repubblica di Turchia con il numero di progetto: 2016 K121230. Bekir Salih ringrazia l'Accademia turca delle scienze (TUBA) per il parziale sostegno finanziario.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido acetico | Carlo Erba Reagenti | 401413 | Glaciale RS per LC/MS |
| Acetonitrile | Merck | 1000292500 | LC-MS LiChrosolv |
| Agilent Serie 1200 HPLC con delettore FLD Serie 1260 | Agilent Technologies | ||
| Formiato di ammoniaca | Carlo Erba Reagenti | 419741 per spettrometria di massa LC/MS | |
| Bruker TIMS-TOF (Q-TOF) | Bruker Daltonics | ||
| Cellulosa | Sigma Aldrich | 310697 | microcristallina, polvere, 20 μ m |
| Acqua deionizzata | Carlo Erba Reagenti | 412111 per LC/MS | |
| Dimetil solfossido | Sigma Aldrich | 41639 | BioUltra, per biologia molecolare, ≥ 99,5% (GC) |
| Tubo SPE in polipropilene vuoto con fritte in PE | Sigma Aldrich | 54220 | 20 μ m porosità, volume 1 mL |
| Collettore di estrazione, 20 posizioni | Acque | WAT200607 | Completo di rack per 13 provette da 100 mm |
| Plasma umano | Sigma Aldrich | P9523 | liofilizzato |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896 | per biologia molecolare |
| IgG | Sigma Aldrich | I4506 | polvere liofilizzata |
| Soluzione salina | tamponata con fosfatoSigma Aldrich | P4417 | Tablet |
| PNGase F enzima | Promega | V483A | |
| Procainamide cloridrato | abcam | ab120955 | |
| Cianoboroidruro di sodio | Sigma Aldrich | 156159 | grado di reagente, 95% |
| sodio dodecil solfato | Sigma Aldrich | 71725 | |
| trastuzumab | Roche Diagnostics | ||
| Acido trifluoroacetico | Sigma Aldrich | 302031 | per HPLC, ≥ 99,9% |
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