Sviluppo di una striscia immunocromatografica a flusso laterale per la rilevazione rapida e quantitativa di composti di piccole molecole

Le strisce immunocromatografiche a flusso laterale (ICI) a membrana sono strumenti utili per il rilevamento rapido e a basso costo. La membrana di nitrocellulosa come vettore e l'oro colloidale come marcatori dei reagenti diagnostici rapidi per cromatografia immunitaria sono il metodo POCT (point of care testing) più comunemente usato e l'ambito di prova del progetto è più ampio. Dalla loro applicazione originale nel monitoraggio durante la gravidanza, il loro uso è stato esteso per monitorare lo stato di coagulazione del sangue^1,2, danno miocardico³, medicina veterinaria⁴, residui di pesticidi⁵, malattie infettive⁶ e concentrazioni di farmaci. È possibile valutare più tipi di campioni, tra cui urina, saliva, sangue intero, siero e altri fluidi corporei^7,8,9.

Negli ultimi anni, sono stati sviluppati numerosi nuovi saggi per rilevare biomarcatori nella diagnosi di disturbi, tra cui HPLC, UPLC, LC-MS ed ELISA, che sono sensibili e accurati, credibili e specifici. Tuttavia, questi metodi richiedono strumentazione sofisticata, pre-elaborazione complessa e trattamenti dispendiosi in termini di tempo⁹. Quindi, lo sviluppo di una strategia diagnostica point-of-care più rapida e conveniente per il rilevamento autonomo e in tempo reale dei composti attivi medicinali è urgente^10,11.

La popolarità degli I BIOS, soprattutto per i test comuni, è guidata dalla loro facilità d'uso, in quanto non richiedono professionisti o elaborate configurazioni strumentali¹². In altre parole, le persone che non hanno una formazione speciale possono utilizzare strisce o auto-test¹³. I risultati del test possono essere ottenuti in 5 minuti, il che significa che può essere utilizzato per le ispezioni in loco¹⁴. Inoltre, secondo i nostri calcoli, il costo delle strisce potrebbe essere inferiore a 1 RMB¹⁵, il che significa che i test sono economici per promuovere¹⁶. Quindi, l'ICS è un dispositivo usa e getta relativamente accurato, semplice ed economico. Gli ISI basati sull'oro colloidale^17,18 sono applicati anche nel rilevamento rapido covid-19.

Il principio di ICS può essere suddiviso in ICS sandwich e ICS competitivo. La Figura 1A è un diagramma schematico dell'ICS sandwich, che viene utilizzato principalmente per rilevare sostanze macromolecolari come le proteine, compresi i marcatori tumorali, i fattori infiammatori e la gonadotropina corionica umana (HCG, antigene della gravidanza precoce). In questo metodo, vengono utilizzati anticorpi accoppiati mirati a diversi epitopi dell'antigene e l'anticorpo di cattura viene essiccato sulla membrana NC come linea di prova. L'anticorpo etichettato viene essiccato sul tampone coniugato e l'anticorpo secondario viene utilizzato come linea di controllo.

La Figura 1B è un diagramma schematico dell'ICS competitivo, che viene utilizzato principalmente per rilevare sostanze a piccole molecole (MWCO < 2000 Da). L'antigene di rivestimento è fissato sulla membrana NC come linea di prova e l'anticorpo etichettato viene essiccato sul tampone coniugato. Durante il rilevamento, il campione e l'anticorpo marcato fluiscono attraverso la linea di rilevamento sotto azione capillare e l'antigene rivestito lega in modo competitivo l'antigene libero nel campione e sviluppa un colore rosso sulla linea di rilevamento.

Recentemente, abbiamo descritto la procedura di generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali¹⁹. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un nuovo test immunologico a flusso laterale basato sull'anti-SSD mA²⁰ preparato per un rilevamento rapido e in loco. I risultati indicano che il test immunocromatografico è uno strumento indispensabile e conveniente per rilevare composti naturali derivati dal prodotto.

Figura 1 Schema schematico del saggio immunocromatografico (A) Strisce reattive immunocromatografiche sandwich. (B) Strisce reattive immunocromatografiche competitive indirette. Questa cifra è stata modificata da Zhang et al., 2018²¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tutte le procedure eseguite in questo studio sono state approvate dal Comitato di revisione etica presso l'Università di Medicina Cinese di Pechino (numero di approvazione 2017BZYYL00120).

1. Preparazione e caratterizzazione dell'oro colloidale

NOTA: Per la sintesi dell'oro colloidale, poiché l'oro colloidale è facilmente adsorbito sulla parete interna del recipiente ed è soggetto a precipitazioni da parte di impurità, il recipiente per la sintesi e lo stoccaggio dell'oro colloidale deve essere accuratamente pulito e imbevuto di acido (40 ml di acqua distillata, 360 ml di acido solforico concentrato, 20 g di dicromato di potassio) o sottoposto a trattamento di passivazione superficiale. Un metodo di riduzione dell'acido citrico è stato utilizzato per sintetizzare l'oro colloidale.

1. Accendere l'agitatore magnetico e posizionare il pallone (250 ml) sul mixer.
2. Preparare rispettivamente la soluzione acida di cloruro d'oro al 4% e la soluzione di citrato di sodio all'1%.
3. Aggiungere 120 ml di acqua distillata in un matraccio a fondo tondo e riscaldarlo fino all'ebollizione su un agitatore magnetico termostatico.
4. Continuare a bollire e aggiungere rapidamente 0,5 ml di acido cloroaurico al 4% e 5 ml di citrato di sodio all'1%.
5. Osservare il colore della soluzione. La soluzione di acido cloroaurico giallo pallido diventa rosso vino in pochi minuti.
6. Continuare a riscaldare per 10 minuti, fino a quando la soluzione cambia da incolore a rosso vino trasparente.
7. Spegnere l'alimentazione del miscelatore magnetico termostatico, raffreddare a temperatura ambiente e spostare la miscela in una bottiglia pulita. Conservare a 4 °C.
8. Determinare le dimensioni e la morfologia degli AuNP mediante spettroscopia ultravioletta e imaging TEM.
   NOTA: Diverse dimensioni di particelle di oro colloidale per varie applicazioni possono essere ottenute modificando la proporzione di citrato sodico e acido cloroaurico.

2. Sintesi del coniugato AuNPs-mAb

NOTA: Poiché gli anticorpi si legano all'oro colloidale per adsorbimento elettrostatico, le cariche sulla superficie delle proteine e dell'oro colloidale influenzano direttamente l'intensità di legame; pertanto, il valore del pH tampone è un fattore importante che influenza la stabilità del coniugato anticorpo-oro colloidale. SSD e anti-SSD mAbs sono usati come esempi in questo protocollo.

1. Valutazione del pH di accoppiamento
   1. Aggiungere 100 μL di soluzione di NaCl (10% m/v) in otto tubi.
   2. Regolare le soluzioni AuNP a pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 con 0,1 M K₂CO₃.
   3. Aggiungere 100 μL di soluzione di oro colloidale (pH regolato 5-12) a otto tubi contenenti NaCl.
   4. Lasciare riposare le soluzioni per diversi minuti dopo la miscelazione. Osservare il cambiamento di colore di ogni soluzione di tubo e registrare il tubo che rimane rosso.
   5. Scegli il valore di pH con la minima aggiunta di K₂CO 3 e il colore della_soluzione stabile come valore di pH ottimale per la preparazione dei coniugati AuNP-mAb.
      NOTA: non utilizzare un pHmetro perché la sonda potrebbe essere distrutta da AuNP.
2. Valutazione della quantità di anticorpi
   1. Aggiungere 100 μL di soluzione di NaCl (10% m/v) a otto tubi.
   2. Aggiungere 100 μL di soluzione di oro colloidale con pH ottimale a ciascun tubo.
   3. Aggiungere le soluzioni di anticorpi monoclonali (concentrazione proteica 0,1 mg/mL-3,2 mg/mL) alle otto provette sopra menzionate.
   4. Lasciare riposare le soluzioni per diversi minuti dopo la miscelazione. Osservare il cambiamento di colore di ogni soluzione di tubo e registrare il tubo che rimane rosso.
   5. Scegli la quantità di anticorpi con la più bassa concentrazione di mAb e il colore stabile della soluzione come quantità ottimale di mAb per preparare i coniugati AuNP-mAb.
3. Preparare il tampone di risuspensione: aggiungere 1 M Tris-HCl (pH 8,8), 1% (p/v) BSA, 0,5% (v/v) Tween 20 e 1% (v/v) PEG 20000 e frullare bene.
4. Sintesi del coniugato AuNP-mAb
   1. Prendere 10 mL di soluzione di oro colloidale e utilizzare 0,1 M K₂CO₃ per regolare la soluzione al valore di pH ottimale.
   2. Aggiungere lentamente SSD mAbs a concentrazioni appropriate e agitare a temperatura ambiente per 30 minuti.
   3. Centrifugare la miscela a 83 x g (1.000 giri/min) per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere il precipitato, che contiene impurità o oro colloidale precipitato.
   4. Centrifugare la miscela a 8.330 x g (10.000 giri/min) per 30 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e il precipitato è il coniugato colloidale oro-mAb.
   5. Aggiungere il buffer di risuspensione per dissociare la precipitazione.

3. Assemblaggio della striscia

NOTA: per i test immunologici a flusso successivo, la selezione e il pretrattamento del materiale di membrana influenzeranno direttamente il test, che dovrebbe essere studiato. La striscia immunocromatografica è costituita da un tampone campione, un tampone coniugato, una membrana di nitrocellulosa (NC), un tampone assorbente e un cartone in PVC (Figura 1). Il materiale della membrana deve essere controllato e valutato mediante stereomicroscopia per eliminare la disomogeneità.

1. Incollare la membrana NC su un cartone in PVC a 2 cm di distanza dal bordo dell'estremità di aspirazione della scheda.
2. Aggiungere SSD-BSA (2 mg/mL) a goccia alla membrana NC (2 cm a parte il bordo superiore) come linea di prova (1 mm di larghezza) e aggiungere IgG anti-topo di capra (1,5 mg/mL) a goccia sulla membrana NC (2 cm a parte il bordo inferiore) come linea di controllo (1 mm di larghezza). Controllare la quantità di proteine aggiunte.
3. Fissare il tampone assorbente al foglio di PVC sopra la membrana NC e sovrapporlo alla membrana NC di 2 mm.
4. Immergere la membrana in fibra di vetro nella soluzione coniugata AuNPs-mAb. Asciugare la membrana bagnata in un incubatore a 37 °C.
5. Tagliare la membrana in fibra di vetro a 5 cm di lunghezza e 2 cm di larghezza e utilizzarla come cuscinetto coniugato.
6. Incollare il tampone coniugato pretrattato sotto la membrana NC. La lunghezza di sovrapposizione con la membrana NC dovrebbe essere di 0,1 cm.
   NOTA: La membrana in fibra di vetro ha una forte capacità di legare e rilasciare proteine.
7. Tagliare la membrana fusion 3 a 1,8 cm di lunghezza e 3,5 cm di larghezza e utilizzarla come tampone di campionamento.
8. Incollare il tampone campione sulla scheda in PVC e sovrapporlo al tampone coniugato di 2 mm.
9. Tagliare il cartone assemblato in strisce larghe 3,5 mm utilizzando una macchina da taglio e compattarlo utilizzando un sistema di laminazione batch.
10. Infine, posizionare le strisce reattive nel guscio, sigillarle in un sacchetto di alluminio contenente essiccante e conservarle al lontano dalla luce. Gli IS sono ora assemblati.
    NOTA: Quanto sopra è la procedura di laboratorio. Nella produzione, le attrezzature per la spruzzatura dell'oro e gli strumenti a membrana incrociata vengono utilizzati per spruzzare l'oro e realizzare le linee T e C.

4. Rilevazione quantitativa

1. Rilasciare 50 μL di soluzione campione sul foro del campione per osservare il processo di cromatografia.
   NOTA: A seguito dell'azione capillare guidata dal tampone assorbente, la soluzione campione migra verso l'altra estremità della striscia. Quando la soluzione campione raggiunge il pad coniugato, l'SSD (antigene) nel campione reagisce con gli AuNP-mAb precaricati sul pad. Quando la soluzione migra e raggiunge la T-line, l'AuNPs-mAb senza SSD può essere catturato selettivamente da SSD-BSA (coniugato proteico antigene-vettore), mostrandosi come un colore rosso sulla T-line. Quindi, la soluzione migra verso la linea C, dove gli AuNP-mAb vengono catturati dalle IgG anti-topo di capra nella regione, mostrandosi così come un colore rosso sulla linea C.
2. Analizza le strisce con un lettore di strisce portatile. La macchina può fornire il rapporto tra la linea di prova e la linea di controllo (T/C).
3. Valutare la specificità, la sensibilità, la ripetibilità e la stabilità del test ICS.
   NOTA: in caso di rilevamento qualitativo, una linea rossa indica un risultato positivo (linea di controllo). Due linee rosse indicano un risultato negativo (linee di test e controllo). Se la linea di controllo non è presente, il test è considerato non valido.

Caratterizzazione dell'oro colloidale
Le soluzioni di oro colloidale preparate erano rosso claret. Le analisi TEM sono state utilizzate per determinare la morfologia e la forma degli AuNP (Figura 2A-D). La Figura 2A e la Figura 2B rivelano che le particelle sono di forma poliedrica e uniformemente distribuite. Il diametro medio degli AuNP è risultato essere di circa 14 nm (Figura 2C). Un'immagine TEM (HRTEM) ad alta risoluzione di AuNP è mostrata nella Figura 2D e nella Figura 2E. L'immagine HRTEM presa da un singolo AuNP mostra un modello di frangia continua con una spaziatura di 0,117 nm. I picchi di assorbimento UV-vis delle cinque soluzioni colloidali d'oro sono stati 518 nm, 521 nm, 524 nm, 534 nm e 540 nm, il che ha mostrato che la dimensione delle particelle è leggermente aumentata con la diminuzione del citrato di sodio (Figura 2F).

Figura 2 Caratterizzazione dell'oro colloidale. (A) Immagine TEM di AuNP (ingrandimento 100.000×). (B) Immagine TEM di AuNP (ingrandimento 500.000×). (C) La distribuzione dimensionale degli AuNP. Come si vede nell'immagine TEM, i diametri degli AuNP variavano da 10 nm a 18 nm, con un diametro medio di circa 14 nm. (D, E) Immagine TEM (HRTEM) ad alta risoluzione di AuNP. L'immagine HRTEM presa da un singolo AuNP mostra un modello di frangia continua con una spaziatura di 0,117 nm. (F) Spettri di assorbimento UV-vis di diverse AuNP compresi tra 10 nm e 18 nm. Questa cifra è stata modificata da Zhang et al., 201821. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Valutazione delle aste
Sensibilità dell'ICS
Per determinare la sensibilità dell'ICS, sono state utilizzate strisce immunocromatografiche per rilevare una varietà di diverse concentrazioni di campioni standard SSD (150.000, 60.000, 12.000, 2400, 480 e 96 ng/ mL) (Figura 3A). L'acqua a doppia distillazione è stata utilizzata come controllo. Nell'esperimento quantitativo, le strisce sono state scansionate da un lettore ICS portatile JY1502GS (Figura 3B-C). L'equazione di regressione lineare era y = −0,113ln(x) + 1,5451, con un coefficiente di correlazione (R2) di 0,983 (Figura 3D). Ha mostrato una buona linearità da 96 ng / mL a 150 μg / mL. Il valore IC50 era di 10,39 μg/mL. Nell'esperimento quantitativo, il tempo di prova ottimale è stato suggerito per essere di 10 minuti.

Figura 3 Caratterizzazione del saggio immunologico a flusso laterale per SSD. (A) Fotografie dei risultati per soluzioni standard contenenti diverse concentrazioni di SSD analizzate utilizzando l'ICS. (B) Fotografia della scansione dell'oro colloidale abbinato. (C) I modelli di intensità delle linee di prova e di controllo scansionate dallo strumento quantitativo dell'oro colloidale. (D) Curva standard di icELISA per la determinazione SSD utilizzando l'ICS. L'equazione di regressione è y = −0,113ln(x) + 1,5451, con un coefficiente di correlazione (R2) di 0,983. Questa cifra è stata modificata da Zhang et al., 201821. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Specificità dell'ICS
La specificità dell'ICS è stata testata valutando la cross-reattività con composti simili agli SSD. La Tabella 1 mostra la cross-reattività di ICS con composti correlati a SSD. Si può chiaramente vedere che l'ICS aveva solo una bassa cross-reattività con SSa e non aveva reazioni crociate con altri composti, tra cui SSc, SSb1 o SSb2(Tabella 1),indicando che l'ICS preparato ha un'elevata specificità.

Tabella 1. Cross-reattività di composti misurati da ICS e icELISA.  La specificità dell'ICS è stata valutata dall'ICS (a) e dall'icELISA (b). Questa tabella è stata modificata da Zhang et al., 201821.

Tasso di recupero
Come mostrato nella Tabella 2,il tasso medio di recupero è stato del 102,05% (media ± SD, n = 3). Sulla base della sua accuratezza e coerenza, questo test era sufficientemente affidabile per la determinazione di SSD in campioni biologici.

Tabella 2. Tasso di recupero di SSD.   I dati sono la media ± SD da campioni triplicati ad ogni concentrazione di SSD. La percentuale di recupero è stata calcolata come segue: recupero (%) = importo/importo misurato × 100%. Questa tabella è stata modificata da Zhang et al., 201821.

Analisi di stabilità del test ICS
Per valutare la stabilità dell'ICS, le strisce reattive conservate per 8 e 16 settimane sono state testate e confrontate con le strisce appena preparate. La tabella 3 mostra che i risultati delle strisce conservate e appena preparate per i campioni negativi e positivi sono rimasti sostanzialmente invariati, indicando che l'ICS può essere conservato a temperatura ambiente per almeno diversi mesi e che è adatto per la promozione e l'applicazione su larga scala.

Tabella 3. Variazioni tra ICS utilizzate per l'analisi di SSD.   aI valori indicano i coefficienti di varianza per i campioni triplicati su 3 strisce diverse utilizzate 1 giorno dopo la fabbricazione. b I valori indicano coefficienti di varianza per i campioni di triplice copia su 3 diverse strisce utilizzate dopo essere state conservate per 4 settimane. c I valori indicano coefficienti di varianza per i campioni di triplice copia su 3 diverse strisce utilizzate dopo essere state conservate per 8 settimane. Questa tabella è stata modificata da Zhang et al., 201821.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.