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Articolo metodologico

Isolamento dell'RNA totale da Pseudomonas aeruginosa all'interno di biofilm per la misurazione dell'espressione genica

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DOI:

10.3791/62755

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24 settembre 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo per isolare l'RNA dai biofilm di Pseudomonas aeruginosa cresciuti in vetrini da camera per il sequenziamento ad alto rendimento.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa è un patogeno batterico opportunista che causa infezioni nelle vie aeree dei pazienti affetti da fibrosi cistica (FC). P. aeruginosa è noto per la sua capacità di formare biofilm protetti da una matrice di esopolisaccaridi. Questa matrice consente ai microrganismi di essere più resistenti ai fattori esterni, compreso il trattamento antibiotico. Uno dei metodi più comuni di crescita del biofilm per la ricerca è costituito da piastre per microtitolazione o vetrini a camera. Il vantaggio di questi sistemi è che consentono di testare più condizioni di crescita, ma il loro svantaggio è che producono quantità limitate di biofilm per l'estrazione dell'RNA. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire un protocollo dettagliato e passo dopo passo su come estrarre l'RNA totale da piccole quantità di biofilm di qualità e quantità sufficienti per il sequenziamento ad alto rendimento. Questo protocollo consente lo studio dell'espressione genica all'interno di questi sistemi di biofilm.

Introduzione

La maggior parte delle infezioni batteriche croniche, come le infezioni polmonari nei pazienti con fibrosi cistica (FC) e le infezioni correlate alla protesi, sono caratterizzate dalla crescita di organismi all'interno dei biofilm. I biofilm1 sono comunità di batteri racchiusi in una matrice composta principalmente da polisaccaridi2. I batteri all'interno dei biofilm possono essere a crescita lenta, metabolicamente dormienti e in condizioni anaerobiche e ipossiche. I biofilm sono più resistenti agli antibiotici a causa di fattori quali la diminuzione della penetrazione degli antibiotici, l'aumento dell'espressione delle pompe di efflusso dei farmaci e la diminuzione della divisione cellulare3. Per questi e altri motivi, sono di grande interesse per la ricerca.

Al fine di studiare accuratamente le infezioni persistenti come le infezioni croniche da Pseudomonas aeruginosa nei pazienti con FC, le condizioni di crescita osservate con la formazione di biofilm devono essere accuratamente riflesse in vitro. Un metodo comune ad alto rendimento consiste nel coltivarli in vetrini da camera o piastre per microtitolazione e monitorare la formazione di biofilm mediante microscopia confocale4. È noto che un regolatore chiave nella transizione da uno stile di vita planctonico, o free-floating, a uno stile di vita batterico del biofilm è il messaggero secondario, ciclico-di-GMP5. L'aumento dei livelli di di-GMP ciclico aumenta l'espressione di geni specifici che promuovono la crescita del biofilm. Anche i piccoli RNA regolatori non codificanti e il quorum sensing svolgono un ruolo importante nella regolazione della formazione del biofilm5. Misurare l'espressione genica del biofilm sequenziando l'RNA batterico estratto può essere difficile. P. aeruginosa, ad esempio, produce tre esopolisaccaridi (Psl, Pel e alginato), che sono prodotti in quantità significative nei biofilm 6,7. Questi polisaccaridi possono interferire con l'estrazione e la purificazione dell'RNA, portando a preparazioni impure contenenti bassi livelli di mRNAbatterico 8. I kit di estrazione dell'RNA disponibili in commercio sono in grado di produrre RNA di alta qualità da colture batteriche planctoniche, ma potrebbero non funzionare altrettanto bene con le colture di biofilm 9,10,11. Esistono alcuni kit commerciali per l'estrazione dell'RNA che affermano di funzionare per i biofilm, uno dei quali viene utilizzato con questo metodo.

In questo manoscritto, descriviamo le procedure per la crescita di biofilm di P. aeruginosa in vetrini da camera e l'estrazione dell'mRNA batterico per il sequenziamento ad alto rendimento12,13. Utilizzando isolati clinici raccolti da campioni di espettorato di pazienti con FC, dimostriamo che questi metodi possono essere utilizzati per isolati con caratteristiche di crescita variabili. Rispetto alle pubblicazioni precedenti, questo protocollo è descritto in dettaglio per consentire un migliore successo nello studio dell'espressione genica del biofilm batterico 11,14,15,16.

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Protocollo

Il Comitato Etico della Ricerca (REB) è necessario per la raccolta e l'elaborazione di campioni di espettorato da soggetti umani. Questo studio è stato approvato dall'Hospital for Sick Children (REB#1000019444). Il Research Ethics Board (REB) è tenuto a raccogliere e conservare campioni di espettorato da soggetti umani. Questi studi sono stati approvati dall'Hospital for Sick Children REB#1000058579.

1. Formazione del biofilm

  1. Coltiva gli isolati di Pseudomonas aeruginosa ottenuti dai campioni di espettorato di pazienti con FC utilizzati in questo studio su piastre di agar Luria Broth (LB) in un'incubatrice a 37 °C durante la notte.
    NOTA: Una corretta tecnica di striature è importante per ottenere singole colonie batteriche. Le striature durante la rotazione della piastra diluiranno le cellule batteriche a sufficienza in modo che le singole colonie possano crescere.
    1. Striare i batteri utilizzando un anello di inoculazione a zig-zag all'estremità superiore di una piastra LB fresca fino a coprire circa 1/4 della piastra.
    2. Ruotare la piastra di circa 60°. Prendi un nuovo anello di inoculazione e passalo una volta attraverso l'area striata e in una seconda area pulita della piastra, ripetendo lo schema a zig-zag.
    3. Ripetere il passaggio 1.1.2 con un nuovo anello in una terza area della piastra. Riposizionare il coperchio e capovolgere la piastra quando si inserisce nell'incubatrice.
  2. Utilizzare un ansa di inoculazione sterile per prelevare una singola colonia batterica da una piastra di agar (contenente un singolo ceppo batterico) e inoculare una provetta di coltura riempita con 5 ml di terreno sterile LB. Utilizzando ogni volta un nuovo ansa, inoculare due provette di coltura aggiuntive riempite con 5 mL di terreno LB dalla stessa piastra.
  3. Ripetere la stessa procedura di inoculazione per i diversi ceppi batterici. Coltivare le colture durante la notte a 37 °C con agitazione a 220 giri/min.
    NOTA: Ogni piastra di agar contenente un singolo ceppo batterico viene utilizzata per inoculare 3 provette di coltura indipendenti. Le tre provette rappresentano repliche biologiche in triplicato per un ceppo e sono trattate come campioni separati. Questo è diverso dalle repliche tecniche che comporterebbero l'estrazione dell'RNA 3 volte da una singola provetta di coltura.
  4. Preparare diluizioni 1:100 delle colture notturne trasferendo 50 μL di una coltura notturna in una nuova provetta contenente 4,95 mL di nuovo terreno LB.
  5. Far crescere le colture diluite per altre 3 ore a 37 °C agitando a 220 giri/min o fino a quando l'OD600 è 0,1 o superiore. Misurare le densità delle celle su uno spettrofotometro a OD600.
  6. In una nuova provetta per microfugo da 1,7 mL, regolare l'OD600 a 0,1 (fase di log iniziale) in un volume totale di 1,5 mL con LB fresco.
  7. Mescolare delicatamente per inversione. Trasferire 300 μl di ciascuna coltura regolata in 4 pozzetti di un vetrino a camera da 8 pozzetti per ottenere 2 campioni diversi per vetrino (Figura 1).
  8. Posizionare i vetrini, indisturbati, in un'incubatrice a 37 °C per una notte per 24 ore. Per evitare l'evaporazione, posizionare i vetrini sopra un tovagliolo di carta umido in un piccolo vassoio di plastica.

2. Recupero del biofilm

NOTA: Ogni vetrino contiene otto pozzetti separati. Un singolo campione è costituito da quattro pozzetti con biofilm che verranno raggruppati17. Questo protocollo di estrazione è per 1 campione (4 pozzetti) in cui i biofilm vengono recuperati da 2 pozzetti alla volta. Le estrazioni dell'RNA vengono eseguite utilizzando un kit di estrazione dell'RNA commerciale che include una fase di battitura delle perle e una pulizia basata su colonna, con modifiche. Seguire le istruzioni del produttore per la preparazione del reagente.

  1. In una cappa a flusso laminare, rimuovere lentamente il terreno da 2 dei 4 pozzetti utilizzando un puntale per pipetta. Inclinare il vetrino di un angolo di 45° e pipettare il terreno dall'angolo inferiore dei pozzetti per evitare il distacco dei biofilm.
  2. Mantenendo il vetrino inclinato, lavare via le cellule planctoniche pipettando delicatamente 300 μl di acqua priva di RNasi nell'angolo inferiore dei due pozzetti svuotati. Rimuovere l'acqua pipettandola delicatamente, come descritto al punto 2.1. Ripetere la fase di lavaggio rimuovendo quanta più acqua possibile.
  3. Aggiungere 300 μl di un reagente di protezione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali) a ciascuno dei due pozzetti svuotati con biofilm alla base. Posizionare il vetrino della camera su una lastra di vetro per evitare che i pozzetti si rompano, quindi raschiare i biofilm nei 2 pozzetti con una piccola spatola metallica sterile priva di nucleasi per risospendere i batteri del biofilm. Lasciare riposare fino a quando i biofilm non vengono recuperati dai 2 pozzetti rimanenti intatti dello stesso campione.
    NOTA: L'aggiunta di un reagente di protezione dell'RNA garantisce la stabilità dei campioni di biofilm nei pozzetti raschiati a temperatura ambiente durante l'elaborazione dei restanti due pozzetti dello stesso campione. Il reagente di protezione dell'RNA lisa le cellule e inattiva le nucleasi e gli agenti infettivi, con conseguente conservazione dell'RNA.
  4. Per recuperare i biofilm dai restanti 2 pozzetti per un campione (promemoria: un campione è composto da 4 pozzetti), rimuovere il terreno LB dai 2 nuovi pozzetti rimanenti nello stesso modo descritto nel passaggio 2.1. Ripetere il passaggio 2.2 per lavare via le cellule planctoniche con acqua priva di RNasi da entrambi i nuovi pozzetti, come prima.
  5. Tornare ai primi 2 pozzetti con i biofilm raschiati nel reagente di protezione, generati alla fine del passaggio 2.3, e pipettare lentamente per miscelare i 300 μL di biofilm risospeso da un pozzetto raschiato, cercando di non creare troppe bolle.
    1. Trasferire tutto il contenuto dal pozzetto in uno dei pozzetti appena lavati e svuotati. Miscelare e trasferire 300 μl di biofilm risospeso dal secondo pozzetto raschiato, nel pozzetto rimanente, appena lavato e svuotato.
      NOTA: Invece di aggiungere un nuovo reagente di protezione dell'RNA ai 2 pozzetti appena lavati con biofilm, trasferire i biofilm precedentemente raschiati già nel reagente di protezione in questi pozzetti appena lavati. In questo modo il volume del campione combinato rimarrà sufficientemente basso da soddisfare i requisiti di input per il kit di estrazione dell'RNA commerciale. Vedere la Figura 1 per uno schema.
  6. Ripetere la raschiatura dei biofilm nei nuovi pozzetti come al punto 2.3, posizionando il vetrino della camera su una lastra di vetro e raschiando i biofilm nei 2 nuovi pozzetti con una piccola spatola metallica sterile priva di nucleasi per risospendere i batteri del biofilm.
  7. Combina tutto il biofilm risospeso dai 2 nuovi pozzetti in un'unica provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, priva di RNasi, a basso legame. Misurare il volume, che dovrebbe essere ~500 - 600 μL totali.
    NOTA: La sospensione combinata di biofilm di questa seconda coppia di nuovi pozzetti conterrà tutto il materiale del biofilm proveniente dai 4 pozzetti originali di un campione.

3. Isolamento dell'RNA totale e valutazione della qualità

NOTA: L'estrazione dell'RNA viene eseguita utilizzando un kit di estrazione dell'RNA commerciale che afferma di funzionare sui biofilm. I singoli componenti sono inclusi nella tabella dei materiali, se possibile. Quando possibile, vengono fornite spiegazioni sui meccanismi alla base di ogni fase di purificazione.

  1. Aggiungere una quantità sufficiente di reagente di protezione dell'RNA per un totale di 750 μl nella provetta. Trasferire l'intero volume in una provetta da 2 mL contenente perle da 0,1 e 0,5 mm (vedere la Tabella dei materiali). Sbattere per 2 1/2 min in una frusta per perline alla massima velocità.
    NOTA: La combinazione di perle ad alta densità da 0,1 mm e 0,5 mm e la miscelazione ad alta velocità su un battitore di microsfere garantisce un'omogeneizzazione completa delle pareti cellulari microbiche.
  2. Centrifugare a 16.000 x g per 1 minuto per pellettare le perline. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga, riducendo al minimo il trasferimento di eventuali perline, il che renderà più facile il passaggio 3.3. Misura il volume.
  3. Aggiungere un volume uguale di tampone di lisi dell'RNA (~450 μL) e mescolare bene. Trasferire fino a 800 μl di campione, evitando il trasferimento di perline, in una colonna di silice in una provetta di raccolta e centrifugare a 16.000 x g per 30 s. Salvare il flusso in quanto contiene l'RNA mentre il DNA è legato alla colonna.
    NOTA: Il tampone di lisi dell'RNA contiene tiocianato di guanidinio e il detergente N-lauroilsarcosina per lisi le cellule. Il tiocianato di guanidinio è un agente caotropo che inattiva anche le nucleasi e, in presenza di silice, presente nella colonna di spin, favorisce il legame del DNA alla silice18. L'assenza di etanolo consente il legame preferenziale del DNA e non dell'RNA alla colonna di spin19 della silice. Lo scopo della fase 3.3 è quello di legare e rimuovere il DNA genomico. Vogliamo trattenere l'RNA, che è contenuto nella porzione a flusso continuo.
  4. Se rimane più campione, trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta e ricaricare con il resto del campione. Centrifugare a 16.000 x g per 30 s. Mantenere il flusso con l'RNA e combinarlo con la prima aliquota.
  5. Misurare il volume di flusso combinato e aggiungere un volume uguale di etanolo al 100 % e mescolare bene. Trasferire fino a 800 μl della soluzione in una nuova seconda colonna di centrifuga di silice in una provetta di raccolta e centrifugare a 16.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
    NOTA: L'aggiunta di etanolo alla soluzione salina caotropica contenente l'RNA migliora il legame dell'RNA alla colonna di spin della silice19.
  6. Per soluzioni > 800 μl, ricaricare la colonna rotante e centrifugare fino a quando l'intera soluzione non è stata centrifugata. Scartare il flusso dopo ogni centrifuga.
  7. Aggiungere 400 μl di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 16.000 x g per 30 s per rimuovere alcuni sali. Scartare il flusso.
  8. Preparare la miscela di reazione DNasi I secondo le istruzioni del produttore ed eseguire il trattamento DNasi in colonna per rimuovere eventuali residui di DNA.
  9. Risospendere la DNasi I liofilizzata in 275 μL di acqua priva di RNasi per ottenere una soluzione da 1 U/μL. Mescolare per leggera inversione.
  10. Combinare 5 μl di DNasi I diluita con 75 μl del tampone di digestione DNasi fornito. Mescolare delicatamente per inversione.
  11. Aggiungere 80 μl della soluzione preparata direttamente sulla matrice della colonna. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
  12. Aggiungere 400 μl di tampone di preparazione dell'RNA alla colonna e centrifugare a 16.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
  13. Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio dell'RNA alla colonna e ripetere la centrifugazione. Scartare il flusso.
  14. Aggiungere 400 μl di tampone di lavaggio dell'RNA e centrifugare la colonna per 2 minuti per rimuovere completamente l'eventuale tampone residuo.
    NOTA: Ci sono 2 diverse fasi di lavaggio per rimuovere le impurità sulla colonna. Il tampone di preparazione contiene un sale caotropico debole mescolato con etanolo per rimuovere le proteine residue. Successivamente, il tampone di lavaggio viene utilizzato per eseguire lavaggi con etanolo per rimuovere i sali. L'eventuale etanolo rimanente deve essere rimosso per consentire un'efficiente eluizione dell'RNA19,20.
  15. Trasferire con cautela la colonna in una nuova provetta per microcentrifuga a basso legante.
  16. Aggiungere 50 μl di acqua priva di RNasi direttamente nella matrice della colonna e incubare per 5 minuti. Centrifugare a 16.000 x g per 1 minuto per eluire l'RNA.
  17. Per un'ulteriore pulizia per rimuovere gli inibitori della PCR, posizionare un filtro inibitore della PCR in una nuova provetta di raccolta. Aggiungere 600 μl della soluzione di preparazione dell'inibitore fornita (vedere la Tabella dei materiali).
  18. Centrifugare a 8.000 x g per 3 min per lavare il filtro. Trasferire il filtro lavato in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legante.
  19. Trasferire l'RNA eluito dal passaggio 3.13 nel filtro lavato e centrifugare a 16.000 x g per 3 minuti.
    NOTA: L'RNA può essere utilizzato immediatamente o conservato a -80 °C.
  20. Determinare la concentrazione dell'RNA utilizzando un sistema fluorimetrico ad alta sensibilità21.
    NOTA: Questi sistemi consentono la quantificazione sensibile di una piccola quantità di RNA in soluzione specifica per il bersaglio di interesse.
    1. Valutare la qualità dell'RNA utilizzando un sistema di elettroforesi automatizzato in grado di fornire un RIN (numero di integrità dell'RNA), che è una misura della qualità dell'RNA22,23.

4. Deplezione dell'RNA ribosomiale e sequenziamento ad alto rendimento

  1. Inviare gli RNA al Centro per l'Analisi dell'Evoluzione e della Funzione del Genoma (CAGEF) presso l'Università di Toronto (Toronto, Canada) (https://www.cagef.utoronto.ca/) per la deplezione batterica dell'rRNA e la preparazione della libreria direzionale dell'RNA (vedi Tabella dei Materiali).
    NOTA: La deplezione batterica dell'rRNA prende di mira gli rRNA 5S, 16S e 23S per la rimozione24.
  2. Esaurire gli rRNA utilizzando un kit di deplezione batterica rRNA commerciale. Seguire il protocollo per l'immissione di 10 ng - 1 μg di RNA totale intatto o parzialmente degradato.
  3. Costruisci librerie di sequenziamento dell'RNA utilizzando un kit di preparazione della libreria direzionale dell'RNA con diversi indici collegati a ciascuna libreria.
  4. Raggruppare quantità equimolari di ciascuna libreria di RNA ed eseguire il sequenziamento ad alto rendimento con 100 letture di estremità accoppiate di 100 basi25.

5. Valutazione della qualità delle letture di sequenziamento

NOTA : Verificare la qualità delle letture di sequenziamento utilizzando il programma disponibile gratuitamente, FastQC26, disponibile attraverso la piattaforma gratuita e open source, Galaxy27.

  1. Vai a https://usegalaxy.org/. Clicca sul menu Accedi o Registrati ed effettua l'accesso con le credenziali o crea un account.
  2. Fare clic sul collegamento Carica dati in alto a sinistra della pagina, nel menu Strumenti, e caricare i file di sequenziamento fastq.gz. Attendi che i nomi dei file appaiano sul lato destro della pagina, sotto il pannello Cronologia.
  3. Selezionare Controllo qualità FASTQ nel menu Strumenti per visualizzare un elenco di programmi. Seleziona FastQC, che popolerà il pannello centrale dello schermo.
  4. In Lettura breve dei dati dalla cronologia corrente, selezionare i file di fastq.gz caricati dal menu a discesa.
  5. Selezionare Esegui per eseguire il programma.
  6. Visualizzare i risultati nel pannello Cronologia (Tabella 2).
    NOTA: Per istruzioni più dettagliate su come utilizzare Galaxy, visitare la pagina di supporto all'indirizzo https://galaxyproject.org/support/.

6. Mappatura delle letture di sequenziamento

NOTA : Di seguito è elencata una pipeline di base per il taglio dell'adattatore e la mappatura della lettura per i dati RNA-seq. Le sequenze dell'adattatore vengono tagliate dalle letture utilizzando Trimmomatic28. Le reads tagliate sono mappate sul genoma di riferimento PAO1 di P. aeruginosa (NC_002516.2), ottenuto da NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)29utilizzando BWA30 e Samtools31. Per semplicità, una coppia di letture è chiamata PA_1.fq e PA_2.fq; Il file letto dell'adattatore da tagliare si chiama adapter.fa; e la sequenza di riferimento PAO1 è chiamata PAO1.fasta. Tutti gli strumenti sono open source e vengono eseguiti in ambiente UNIX/LINUX. Si consiglia vivamente di familiarizzare con i fondamenti di UNIX/LINUX per eseguire questi comandi.

  1. Aprire una finestra in UNIX/LINUX.
  2. Installa Java, Trimmomatic, BWA e Samtools.
  3. Passare alla cartella in cui risiede il file trimmomatic-0.39.jar.
  4. Taglia tutte le sequenze dell'adattatore dalle letture digitando il comando:
    Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adattatori.fa
    NOTA: Vengono rimosse solo le sequenze dell'adattatore. Le letture non sono state tagliate per la qualità32.
  5. Spostare il file di riferimento PAO1.fasta nella stessa cartella.
  6. Indicizzare il riferimento utilizzando BWA con il comando:
    Indice Bwa PA01.fasta
  7. Mappare le letture accoppiate al genoma di riferimento digitando i seguenti 4 comandi. Digitare ogni comando al termine del precedente.
    Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
    Samtools view -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
    Samtools ordina PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
    Indice Samtools PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
  8. Visualizza le statistiche di mappatura digitando il comando:
    Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
    NOTA: La 3ariga delle statistiche riporta la proporzione delle letture che mappano il genoma di riferimento.
  9. Calcola la profondità media di lettura e l'ampiezza della copertura con i seguenti 2 comandi33, rispettivamente:
    Samtools profondità -A PA_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; s+=$3}END{stampa s/c}'
    Samtools profondità -A PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) totale+=1}END{stampa (totale/c)*100}'

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Risultati

La panoramica generale del metodo è illustrata nella Figura 1. In precedenza abbiamo utilizzato vetrini da camera a 8 pozzetti per far crescere biofilm di P. aeruginosa ed esporli ad antibiotici prima di esaminarli tramite microscopia confocale in diversi punti temporali12,13. Questo metodo può essere utilizzato per estrarre l'RNA totale direttamente dai biofilm cresciuti in questo sistema al fine di studiare i cambiamenti d...

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Discussione

L'RNA totale viene estratto con successo da 17 diversi campioni di biofilm batterico in triplicato, per un totale di 51 campioni. Le quarantanove librerie di RNA vengono raggruppate e sequenziate con successo. Nel complesso, ciò convalida i nostri criteri di qualità con un tasso di successo del 96%, anche se più della metà dei campioni è considerata di bassa abbondanza e di qualità non ottimale 34,35,36,37.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno divulgazioni da dichiarare.

Ringraziamenti

Contributi degli autori: P.W., Y.Y. e V.W sono stati coinvolti nella concettualizzazione dello studio. K.G., L.J., A.M. e P.W. hanno ottimizzato i protocolli di laboratorio. Il finanziamento di K.G. è stato sostenuto dal sussidio del programma di tirocinio studentesco attraverso BioTalent Canada.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bioanalizzatore Agilent 2100AgilentG2939BAElettroforesi automatizzata di biomolecole Kit
Agilent RNA 6000 picoAgilent5067-1513Chip per elettroforesi RNA ad alta sensibilità per generare un tampone di
lisi RIN DNA/RNA ZymoResearchD7001-1-50Un tiocianato di guanidinio e un tampone di lisi a base di N-Lauroilsarcosina, venduto come parte di un kit di purificazione degli acidi nucleici
Tampone per la preparazione del DNA/RNAZymo ResearchD7010-2-10Un tampone guanidina HCl ed etanolo utilizzato per la purificazione del DNA e dell'RNA DNA
/RNA ShieldZymo ResearchR1100-50Reagente per la conservazione/protezione del DNA e dell'RNA
Tampone di lavaggio del DNA/RNAZymo ResearchD7010-3-6Un tampone sale ed etanolo utilizzato per la purificazione del DNA e dell'RNA
DNBSEQ G-400RSMGIG-400RSSequenziatore ad alto rendimento
MGIEasy RNA Set di preparazione della libreria direzionaleMGIGenera librerie per piattaforme di sequenziamento MGI ad alto rendimento a partire dall'RNA totale.
Mini-Beadbeater-96BioSpec1001Un disgregatore cellulare ad alta energia e ad alta produttività
NEBNext rRNA Depletion Kit (batteri)New England BiolabsE7850XDeplezione efficiente e specifica dell'rRNA batterico (5S, 16S, 23S)
Sistema di vetrini a camera Nunc Lab-Tek IIThermo Fisher Scientific154534Vetrino a camera a 8 pozzetti con pozzetti rimovibili
Qubit FluorimetroThermo Fisher ScientificQ33238Fluorimetro per DNA, RNA e proteine
Kit di analisi Qubit RNA HSThermo Fisher ScientificQ32852Saggio fluorimetrico ad alta sensibilità per misurare la concentrazione di RNA
Filtri Spin-AwayZymo ResearchC1006-50-FColonna rotante a base di silice utilizzata principalmente per legare o rimuovere il DNA genomico
Anelli di inoculazione sterili, 1 uLSarstedt86.1567.050Anelli di inoculazione sterili e monouso per la manipolazione di microrganismi Provette
per lisi ZR BashingBeadZymo ResearchS6003-50Provette da 2 mL contenenti matrice di lisi a microsfere da 0,1 e 0,5 mm per l'omogeneizzazione di campioni biologici
Colonne Zymo Spin IIICG ZymoResearchC1006-50-GColonna rotante a base di silice per la purificazione di DNA e RNA
Filtri Zymo-Spin III-HRCZymo ResearchC1058-50Rimuove inibitori quali composti polifenolici, acidi umici/fulvici, tannini, melanina, ecc.
Zymobiomics Kit di minipreparazione DNA/RNAZymo ResearchR2002Kit di doppia estrazione di DNA e RNA
Zymobiomics HRC Prep solutionZymo ResearchD4300-7-30Da utilizzare con i filtri Zymo-Spin III-HRC per rimuovere gli inibitori della PCR
1000006386

Riferimenti

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