Un metodo scalabile per studiare la sopravvivenza neuronale in coltura neuronale primaria con risoluzione a singola cellula e in tempo reale

Sommario

Qui, presentiamo una metodologia semplice, potente e versatile per studiare la sopravvivenza neuronale in seguito a stress citotossico in neuroni corticali primari con risoluzione cellulare in tempo reale o in materiale fisso.

Abstract

La perdita neuronale è al centro di molte neuropatologie, tra cui l'ictus, il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson. Diversi metodi sono stati sviluppati per studiare il processo di sopravvivenza neuronale in seguito a stress citotossico. La maggior parte dei metodi si basa su approcci biochimici che non consentono la risoluzione di singole cellule o che comportano metodologie complesse e costose. Qui viene presentato un paradigma sperimentale versatile, economico ed efficace per studiare la sopravvivenza neuronale. Questo metodo sfrutta la marcatura a fluorescenza sparsa dei neuroni seguita dall'imaging dal vivo e dalla quantificazione automatizzata. A questo scopo, i neuroni vengono elettroporati per esprimere marcatori fluorescenti e co-coltivati con neuroni non elettroporati per regolare facilmente la densità cellulare e aumentare la sopravvivenza.

La marcatura sparsa mediante elettroporazione consente una quantificazione automatizzata semplice e robusta. Inoltre, la marcatura fluorescente può essere combinata con la co-espressione di un gene di interesse per studiare specifici percorsi molecolari. Qui, presentiamo un modello di ictus come modello neurotossico, vale a dire, il test di privazione ossigeno-glucosio (OGD), che è stato eseguito in una camera ipossica fatta in casa economica e robusta. Infine, vengono descritti due diversi flussi di lavoro utilizzando IN Cell Analyzer 2200 o l'open-source ImageJ per l'analisi delle immagini per l'elaborazione semiautomatica dei dati. Questo flusso di lavoro può essere facilmente adattato a diversi modelli sperimentali di tossicità e scalato per lo screening ad alto rendimento. In conclusione, il protocollo descritto fornisce un modello in vitro di neurotossicità accessibile, economico ed efficace, che può essere adatto per testare i ruoli di geni e percorsi specifici nell'imaging dal vivo e per lo screening di farmaci ad alto rendimento.

Introduzione

Lo studio dei disturbi neuronali richiede modelli sperimentali suscettibili di analisi genetiche, molecolari e cellulari. I neuroni corticali primari sono un modello molto potente per studiare la sopravvivenza neuronale e la tossicità 1,2,3,4. Nelle condizioni appropriate, i neuroni primari svilupperanno progressivamente contatti sinaptici e presenteranno i segni distintivi dei neuroni maturi. Pertanto, questo modello è più affidabile delle linee cellulari immortalizzate nel modellare la fisiologia dei neuroni e più suscettibile di manipolazioni rispetto ai modelli animali. Tuttavia, rispetto alle linee cellulari, i neuroni corticali primari sono difficili da trasfettare e relativamente fragili. Inoltre, l'intricata morfologia dei neuroni corticali può complicare l'imaging e l'analisi in colture ad alta densità. Al contrario, le colture neuronali primarie a bassa densità sono più facili da analizzare, ma tendono ad essere più fragili.

Tenendo conto di tutto ciò, questo articolo presenta un flusso di lavoro in vitro conveniente, versatile e scalabile per modellare e studiare la sopravvivenza neuronale (Figura 1). Punti chiave di questo protocollo sono i) il metodo di elettroporazione in vitro dei neuroni con un marcatore fluorescente per consentire la marcatura sparsa e l'imaging di cellule vive; ii) la sua versatilità in diversi modelli di citotossicità; e iii) l'analisi semi-automatica o automatizzata.

Il sistema di elettroporazione (vedi Tabella Materiali) prevede una procedura aperta ed economica che non prevede kit e soluzioni specifiche ^4,5,6. Inoltre, questo metodo può essere facilmente adattato per ottenere un'efficienza di trasformazione e una densità ottimali di neuroni trasfettati, mescolando cellule elettroporate con cellule non elettroporate. La co-coltura con neuroni naïve (non elettroporati) migliora significativamente la vitalità delle cellule elettroporate rispetto alle colture a bassa densità. Inoltre, consente una marcatura sparsa con una densità regolabile dei neuroni elettroporati, mantenendo un livello costante di espressione genica. È importante puntare al 3-5% di neuroni elettroporati nei saggi di sopravvivenza.

La marcatura sparsa facilita essenzialmente l'automazione dell'analisi delle immagini perché le celle sono ben separate e facilmente distinguibili. In particolare, questo paradigma sperimentale può essere adattato per testare più geni di interesse co-coltivando simultaneamente neuroni co-elettroporati con diversi marcatori fluorescenti citosolici (ad esempio, proteina fluorescente ciano, proteina fluorescente rossa (RFP), proteina fluorescente verde (GFP)) nello stesso pozzetto. Analogamente ad altri test di citotossicità (ad esempio, ioduro di propidio o lattato deidrogenasi), il test qui descritto si basa sul fatto che la morte neuronale è accompagnata dalla rottura della membrana cellulare. Ciò provoca il rilascio di proteine citosoliche per diffusione e, di conseguenza, la perdita della fluorescenza GFP.

Un modello in vitro di ictus, ovvero il modello OGD, viene presentato come esempio di neurotossicità ^7,8,9. Questo protocollo prevede l'esposizione dei neuroni primari a un tampone salino simile a un liquido cerebrospinale artificiale, ma privo di ossigeno e glucosio. Sebbene questo modello sia stato presentato come un esempio di stress neurotossico, diverse condizioni citotossiche possono essere testate con lo stesso flusso di lavoro ^8,9. Infine, l'etichettatura sparsa consente facilmente lo sviluppo di analisi automatizzate delle immagini. In questo caso, è stato stabilito un protocollo basato sull'immunofluorescenza standard e sull'analisi ImageJ in una configurazione più piccola. Successivamente, questo flusso di lavoro è stato adattato e scalato utilizzando un sistema di imaging cellulare che consente un'analisi automatizzata nell'imaging dal vivo in modalità a medio e alto rendimento. In conclusione, questo articolo presenta una metodologia flessibile, economica e scalabile per studiare la sopravvivenza neuronale in diversi modelli sperimentali di tossicità utilizzando l'imaging dal vivo e la quantificazione automatizzata.

Protocollo

Tutte le procedure che utilizzano gli animali devono essere supervisionate dal comitato bioetico per gli animali dell'istituto ed eseguite in conformità con le normative locali. Le procedure qui presentate sono state approvate dall'autorità delegata e sono conformi alle normative in Spagna e in Europa.

1. Coltura neuronale primaria

NOTA: Tutte le fasi vengono eseguite all'interno della cappa di coltura, utilizzando materiali e soluzioni sterili per mantenere le condizioni di sterilità.

1. Rivestimento in poli-L-lisina (PLL)
   1. Lavare i vetrini coprioggetti (CV, 15 mm) in etanolo al 70% per una notte (o/n) in un agitatore orbitale.
      NOTA: La velocità dell'agitatore orbitale dovrebbe essere sufficiente per muovere delicatamente il CV ma non troppo velocemente per evitare di danneggiare o graffiare i CV. Il numero di giri specifico varia a seconda del modello dello shaker. I CV possono essere conservati in etanolo per lunghi periodi (mesi).
   2. Togliere l'etanolo e lavare due volte con acqua deionizzata per 10 minuti ciascuna.
   3. Lasciare asciugare i CV a temperatura ambiente (RT) in una piastra di Petri da 100 mm (circa 13 CV/piastra). Assicurarsi che i CV non si tocchino tra loro o con i bordi della targa.
      NOTA: I CV asciutti possono essere conservati presso RT per lunghi periodi (mesi).
   4. Preparare la soluzione madre di PLL da 5 mg/mL in acqua, fare aliquote e conservarle a -20 °C. Diluire la soluzione madre in 1x PBS a una concentrazione di lavoro di 0,1 mg/mL.
      NOTA: Possono essere testate concentrazioni più elevate, fino a 1 mg/mL di PLL.
   5. Aggiungere il volume minimo di PLL per coprire la superficie dei CV (vedere i volumi ottimali di PLL nella Tabella 1). Aggiungere la soluzione PLL goccia a goccia per facilitare la formazione di una gocciolina.
      NOTA: Per l'immunofluorescenza è necessario placcare i neuroni sui CV. Per l'imaging time-lapse (ad esempio, per la cellula IN), le cellule vengono piastrate direttamente sopra il pozzetto senza CV perché le CV possono muoversi durante il time-lapse. In tal caso, aggiungi il volume minimo di PLL per coprire la superficie di ciascun pozzetto.

Superficie	Volume PLL (mL)
Vetrini coprioggetti 15 mm	0.2
Vetrini coprioggetti 13 mm	0.18
Piastra a 96 pozzetti	0.07
Piastra a 24 pozzetti	0.3
Piastra a 6 pozzetti	2
Piastra da 60 mm	4.5

Tabella 1: Volumi ottimali di poli-L-lisina in base alla superficie.

6. Incubare per almeno 1 ora a 37 °C.
   NOTA: Il periodo di incubazione potrebbe essere lungo fino a o/n.
7. Rimuovere il PLL dai CV. Lavare i CV due volte con acqua deionizzata per 10 minuti ciascuno. Lascia asciugare i CV a RT.
   NOTA: La soluzione PLL può essere conservata a 4 °C per il riutilizzo (3 volte al massimo).
8. Conservare i CV essiccati all'interno di una piastra di Petri a 4 °C (per un massimo di 7-10 giorni) o posizionarli all'interno dei pozzetti con mezzo di placcatura (vedere la composizione nella Tabella 2 e i volumi di lavoro nella Tabella 3). Aggiungere il mezzo di placcatura direttamente ai pozzetti delle piastre a 12 pozzetti (Tabella 3).
   NOTA: I neuroni sono molto sensibili alla qualità del siero fetale bovino (FBS). Diversi lotti di FBS dovrebbero essere testati per identificare il lotto in cui le cellule sembrano più sane. Una volta identificato un buon lotto di FBS, si consiglia di procurarsene una grande quantità e conservarlo a -80 °C. Questo protocollo potrebbe essere adattato ad altri tipi di CV e targhe (vedere i diversi volumi di lavoro nella Tabella 3).

Media di placcatura
MEM		42.5	Ml
10% Siero di cavallo o FBS*		5	Ml
30% glucosio (0,6% concentrazione finale)		1	Ml
PS (penicillina, 10000 U/mL; streptomicina, 10 mg/mL);		0.5	Ml
Mezzo di elettroporazione
Opti-MEM
Medium neuronale
Terreno neurobasale		48.5	Ml
B-27		1	Ml
Glutamax 200 mM		0.125	Ml
PS (penicillina, 10000 U/mL; streptomicina, 10 mg/mL);		0.5	Ml
OGD Medium (Tasca, et al. 2014)
CaCl2		1	millimetro
Kcl		5	millimetro
NaCl		137	millimetro
KH2PO4		0.4	millimetro
Na2HPO4		0.3	millimetro
MgCl2		0.5	millimetro
MgSO4		0.4	millimetro
HEPES		25	millimetro
NaHCO3		4	millimetro

Tabella 2: Composizione dei diversi media utilizzati.

Superficie di pozzetti e piastre			Volume di lavoro
Piastra a 96 pozzetti	0.32	cm2	0.1	Ml
Piastra a 24 pozzetti	1.9	cm2	0.5	Ml
Piastra a 12 pozzetti	3.8	cm2	1	Ml
Piastra a 6 pozzetti	9.5	cm2	2.5	Ml
Piastra da 60 mm	21.5	cm2	6	Ml

Tabella 3: Superficie dei diversi tipi di piastre e volumi di lavoro.

2. Preparazione della coltura neuronale
   1. Preriscaldare (37 °C) ed equilibrare (in un'atmosfera di CO₂ al 5%) il mezzo di placcatura, il mezzo neuronale e il mezzo di elettroporazione (vedere la composizione nella Tabella 2) in un flacone parzialmente aperto all'interno dell'incubatore cellulare per un minimo di 2 ore. Lascia che la tripsina si riscaldi a RT. Pre-riscaldare 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) a 37 °C a bagnomaria.
   2. Preimpostare i parametri di elettroporazione (Tabella 4).

CONDIZIONI DI ELETTROPORAZIONE: Impulso poroso
Lunghezza	V	Intervallo	N	D. Tasso	Polarità
2 ms	175	50	2	10	più
CONDIZIONI DI ELETTROPORAZIONE: Impulso di trasferimento
Lunghezza	V	Intervallo	N	D. Tasso	Polarità
50	20	50	5	40	più/meno

Tabella 4: Impostazioni di elettroporazione per NEPA21.

3. Dissezione cerebrale e raccolta di topi CD-1 embryos all'E15 post-coito
   1. Sacrificare la femmina incinta mediante lussazione cervicale senza sedazione. Sterilizzare la pancia con etanolo al 70%; Tagliare e aprire l'addome con forbici affilate.
   2. Estrarre l'utero e metterlo in una capsula di Petri con 1x HBSS freddo. Lasciarlo sul ghiaccio all'interno della cappa di coltura cellulare con una pinza comune.
   3. Estrarre un embrione dall'utero con l'aiuto di pinze e forbici e decapitarlo con un solo taglio usando le forbici.
   4. Tenere la testa e introdurre una pinza (ad es. pinza fine Dumont) nell'orbita dell'occhio.
   5. Usando l'ago (siringa da 30 G) come lama, tagliare la bregma e sfondare la parte posteriore della testa.
   6. Introdurre una pinza affilata attraverso l'incisione verticalmente nella bregma e rompere il sottile strato di pelle della regione anteriore. Tirare la pinza per seguire la fessura longitudinale tra i due emisferi senza danneggiare la corteccia.
   7. Usa le piccole pinze con un angolo di 45°, dalla parte anteriore a quella posteriore, per rimuovere il cervello dalla testa.
   8. Sposta il cervello in una capsula di Petri da 3,5 cm con 1x HBSS ghiacciato sotto uno stereomicroscopio.
4. Dissezione delle cortecce
   NOTA: Il protocollo per la coltura neuronale è adattato dalla procedura descritta da Dotti e Banker¹⁰.
   1. Usa la pinza Dumont (11 cm) per tenere il talamo e un ago inclinato di un angolo di 45° per separare la corteccia di ciascun emisfero dal mesencefalo. Assicurarsi che la corteccia non mostri tracce di altri tessuti; Usa una pinza affilata per rimuovere le meningi.
      NOTA: Le meningi formano una sottile membrana elastica che avvolge il cervello e sono facilmente riconoscibili per il loro colore rosso. Fare movimenti morbidi a zig-zag aiuterà a rimuovere le meningi. Assicurati che tutte le meningi siano state rimosse in quanto sono tossiche per la coltura.
   2. Sposta la corteccia pulita in una capsula di Petri pulita da 3,5 cm con 1x HBSS ghiacciato e posizionala sul ghiaccio.
5. Disaggregazione
   1. Taglia ogni corteccia in due metà e usa una pinza o un ago affilato (30 G) per facilitare l'effetto della tripsina nel passaggio successivo.
   2. Trasferire i pezzi in 7 mL di tampone tripsina-EDTA a temperatura ambiente in una provetta da 15 mL utilizzando una pipetta P1000 (tagliare 3-4 mm del puntale). Attendere che affondino sul fondo del puntale prima di rilasciarli dal puntale della pipetta. Mescolare inclinando.
   3. Incubare a 37 °C per 12 minuti a bagnomaria. Mescolare inclinando ogni 4-5 minuti.
      NOTA: Il tempo di incubazione può variare da 12 a 15 minuti.
   4. Lascia che il tessuto affondi per gravità e rimuovi con cura la tripsina. Lavare il fazzoletto due volte con 8 ml di 1x HBSS e agitare delicatamente inclinandolo. Rimuovere con cautela l'1x HBSS utilizzando una pipetta P1000 ma utilizzando un puntale non tagliato.
   5. Lavare il fazzoletto una volta con 5 ml di terreno di placcatura. Agitare inclinandolo. Rimuovere con cautela il mezzo di placcatura utilizzando una pipetta P1000.
   6. Aggiungere 1,5 mL di terreno di placcatura. Disaggregare meccanicamente la miscela utilizzando una pipetta P1000 aspirando il fluido dal fondo della provetta e rilasciandolo delicatamente sulle pareti per un massimo di 8-12 volte.
   7. Filtrare attraverso un filtro cellulare sterile (70 μm) posizionato su una provetta da 50 mL. Aggiungere 10 mL o un altro volume desiderato di terreno di placcatura alla provetta.
   8. Introdurre 5 μl della sospensione cellulare nella camera di conteggio delle cellule, aggiungere 5 μl di blu di tripano (0,4% p/v) e contare le cellule.
   9. Placcare le cellule (vedere paragrafo 1.6) trasferendo un volume adeguato della sospensione cellulare in modo da avere il numero desiderato di cellule per l'elettroporazione (ad esempio,^10-6 cellule) in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare le celle a 250 × g per 5 min. Procedere alla sezione 1.6.
6. Celle di placcatura
   1. Piastra la densità desiderata della sospensione cellulare non centrifugata del passaggio 1.5.7 in ciascun pozzetto contenente il mezzo di placcatura.
      NOTA: In questo protocollo, da 100.000 a 200.000 cellule/pozzetto sono state seminate in una piastra a 12 pozzetti. Come riferimento, targare almeno 3 CV per condizione sperimentale per tenere conto della variabilità sperimentale. Un tipico ambiente sperimentale può comportare l'imaging di 4-5 campi per CV (ad esempio, utilizzando un obiettivo 20x, ogni campo dovrebbe essere largo ~1,3 mm² ).
   2. Spostare la piastra nella cappa di coltura cellulare in tutte le direzioni cardinali per distribuire uniformemente le cellule.
7. Elettroporazione
   NOTA: Possono essere utilizzati altri sistemi di trasfezione. Il sistema NEPA21 utilizzato in questo protocollo ha il vantaggio di essere un "sistema aperto". Il protocollo può essere modificato dall'utente e non richiede reagenti specifici per la trasfezione di speciali cuvette utilizzate per l'elettroporazione. Questo protocollo è stato modificato dal ⁵.
   1. Continuare dal passaggio 1.5.9. Risospendere il pellet cellulare con 5 mL di terreno di elettroporazione in una provetta da 15 mL. Centrifugare la provetta a 250 × g per 5 min.
   2. Ripetere il passaggio 1.7.1. Risospendere con mezzo di elettroporazione per ottenere una concentrazione di^10-6 cellule/mL in ciascuna delle cuvette di elettroporazione. Mescola le cellule con la quantità desiderata di DNA nella cuvetta.
      NOTA: Per l'espressione della GFP, sono stati utilizzati 3 μg di plasmide per milione di cellule. A causa dell'elevata variabilità, si consiglia di testare la concentrazione ottimale per ciascun plasmide. Sono stati testati tra 2 e 24 μg di plasmidi per milione di cellule. Diversi plasmidi possono essere combinati nella stessa cuvetta per eseguire una doppia trasfezione. Nel caso della co-trasfezione, trasfettare il gene di interesse in eccesso rispetto alla GFP (ad esempio, 3:1 è un rapporto ottimale che dovrebbe essere testato) per garantire che la maggior parte delle cellule che esprimono GFP co-esprimano il gene di interesse.
   3. Posizionare la cuvetta nella camera della cuvetta (Figura 2). Premere il pulsante Start per eseguire il programma preimpostato (vedere le condizioni di elettroporazione nella Tabella 4). Registra i valori delle correnti e dei joule visualizzati nel riquadro Misure .
      NOTA: L'utente può modificare condizioni specifiche. Ad esempio, la diminuzione del voltaggio può ridurre l'efficienza della trasfezione ma aumentare la sopravvivenza neuronale.
   4. Estrarre la cuvetta dalla camera. Aggiungere 500 μl del mezzo di placcatura nella cuvetta subito dopo l'elettroporazione e trasferire il campione dalla cuvetta in una provetta da centrifuga da 1,5 mL utilizzando una pipetta.
      NOTA: Più veloce è l'aggiunta di terreno, migliore è la sopravvivenza dopo l'elettroporazione in quanto aiuta a evitare danni alle cellule.
   5. Piastra il numero desiderato di celle elettroporate in ciascun pozzetto.
      NOTA: Piastra da 20.000 a 100.000 celle in una piastra a 12 pozzetti. A seconda delle condizioni, solo il 5-10% delle celle elettroporate può sopravvivere. Il numero esatto deve essere testato e adattato dall'utente.
   6. Incubare per 2-4 ore in condizioni standard (37 °C, 5% CO₂, umidità satura).
      NOTA: Dopo il periodo di incubazione, osservare le cellule al microscopio. Se la coltura è sana, la maggior parte delle cellule avrebbe aderito alla superficie e avrebbe iniziato a germogliare estensioni di neuriti visibili.
   7. Cambiare il mezzo di placcatura in mezzo neuronale (volumi e composizione rispettivamente nella Tabella 1 e nella Tabella 2).
8. Mantenimento delle cellule
   1. Per rinfrescare il terreno, rimuovere metà del terreno e aggiungere un volume uguale di terreno fresco pre-bilanciato dopo 7 giorni di coltura.
   2. Il 10° giorno di coltura, sostituire metà del volume con un terreno neuronale fresco senza l'integratore di glutammina (vedere la Tabella dei materiali). Ripeti questo passaggio a giorni alterni dopo il giorno 10.
      NOTA: Dopo 10 giorni di coltura, le cellule producono glutammato da sole.

2. Costruzione della camera ipossica

1. A tale scopo, utilizzare qualsiasi contenitore ermetico con coperchio a vite o un sistema di tenuta equivalente (Figura 3A). Praticare due fori nella parete del contenitore di plastica e introdurre un tubo di plastica in ciascuno di essi. Sigillarli con silicone in modo che il contenitore sia sigillato ermeticamente (Figura 3).
   NOTA: Qui, per costruire la camera è stato utilizzato un contenitore cilindrico di plastica (misura 1 litro) con coperchio a vite. Assicurarsi che il contenitore sia sufficientemente grande da contenere i CV necessari per l'esperimento. Per trattare più CV nello stesso spazio, le piattaforme di plastica possono essere impilate l'una sull'altra (Figura 3A).
2. Per preparare la camera di gorgogliamento (vedere 3.2), praticare un foro nel tappo di un pallone, utilizzando un trapano meccanico standard con un trapano leggermente più piccolo del tubo, e introdurre un tubo di plastica attraverso il foro nel pallone. Sigillare il foro con parafilm per mantenere la tenuta ermetica (Figura 3B).
3. Sterilizzare il contenitore e il pallone con etanolo al 70% e irradiare con luce ultravioletta per un ciclo prima di utilizzarli.

3. Deprivazione di ossigeno-glucosio (OGD)

NOTA: Il protocollo per l'OGD è adattato da Tasca et ^al.7

1. Preparare la soluzione di OGD con una soluzione di fosfato (Tabella 2) precedentemente integrata con antibiotici.
   NOTA: Per ogni piastra da 35 mm, utilizzare 5 mL; per una piastra da 100 mm, utilizzare 10 mL.
2. Aggiungere la soluzione di OGD all'interno della camera di gorgogliamento (Figura 3B) e metterla in un bagno d'acqua (già preriscaldato a 37 °C). Collegare il pallone con la fonte di azoto (N₂, 100%).
   NOTA: Si prega di notare che poiché la soluzione OGD contiene HEPES come tampone, non richiede CO₂. Se la soluzione OGD è basata su un sistema tampone a base di bicarbonato, utilizzare il 5% di CO₂ e il 95% di N₂ per saturare la soluzione ipossica e la camera.
3. Saturare la soluzione OGD con azoto leggermente gorgogliante. Lasciare la soluzione in uno stato leggermente gorgogliante per 20-30 minuti.
4. Trasferire immediatamente il pallone nella cappa di coltura cellulare e aggiungere 5 mL di soluzione OGD senza ossigeno in piastre da 35 mm o 10 mL in piastre di coltura da 100 mm.
5. Spostare i CV con le cellule coltivate sulle piastre con OGD. Senza coprire le piastre, spostatele nella camera dell'ipossia e chiudetele saldamente ma con cura.
   NOTA: I passaggi 3.4 e 3.5 devono essere completati il più rapidamente possibile. Mantenere i CV di controllo (Neuronal Medium in normoxia) nelle piastre a pozzetti all'interno dell'incubatrice. In alternativa, esporre i neuroni di controllo al terreno OGD normossico integrato con glucosio (10 mM) per esaminare gli effetti dell'ipossia e della privazione di glucosio in modo più selettivo.
6. Collegare il sistema di azoto alla camera di ipossia e verificare che i tubi siano aperti. Saturare la camera con N₂ per alcuni minuti a una pressione di 2-3 bar (es. 2-3 min; 1 bar = 750 mmHg) (Figura 3C).
   NOTA: Non dimenticare di far bollire nuovamente la soluzione OGD per 15 minuti tra più punti temporali.
7. Ridurre la pressione dell'azoto a 1,3-1,5 bar e chiudere entrambi i tubi della camera di ipossia (Figura 3C). Lasciare la camera nell'incubatore per il tempo necessario (ad es. 60 min) a 37 °C, 5% CO₂.
   NOTA: La durata dell'OGD può richiedere un aggiustamento a seconda delle condizioni sperimentali e degli obiettivi di ricerca. Un breve tempo di incubazione (ad esempio, 30 minuti) simulerebbe un'ipossia lieve. Due ore di OGD sono di solito molto dure nei confronti dei neuroni. Si raccomanda di testare una durata dell'OGD compresa tra 45 e 90 minuti prima di iniziare lo studio. Naturalmente, la durata dell'OGD avrà un impatto sulla sopravvivenza totale e sull'insorgenza relativa della morte neuronale dopo il recupero dall'OGD. Se l'obiettivo è analizzare la morte neuronale in tempo reale, cerca di raggiungere condizioni di OGD che provochino la morte cellulare poche ore dopo il recupero dall'OGD per un'analisi più efficace.
8. Aprire la camera e spostare i CV sulla piastra multipozzetto originale per il recupero. Dopo questo passaggio, considerare due alternative: 1) per esperimenti su piccola scala, procedere alla sezione 4 per l'immunofluorescenza e l'analisi delle immagini; 2) Per lo screening ad alto contenuto, procedere alla Sezione 5 per l'analisi nell'analizzatore cellulare (o piattaforma equivalente).
   NOTA: L'imaging dal vivo offre un approccio più flessibile perché consente il monitoraggio in tempo reale dei diversi punti sperimentali.

4. Analisi mediante immunofluorescenza standard e ImageJ

NOTA: Il tempo di recupero può variare da 1 a 24 ore a seconda delle condizioni.

1. Lavare i neuroni con 1x PBS per 10 minuti.
   NOTA: Questo passaggio è facoltativo in quanto esistono diversi modi per procedere e analizzare le immagini.
2. Fissare i neuroni con paraformaldeide al 4% per 10 minuti a RT. Lavarli tre volte con 1x PBS per 10 minuti ad ogni lavaggio.
   NOTA: Poiché la paraformaldeide è tossica, lavorare sotto una cappa chimica.
3. Permeabilizzare i neuroni aggiungendo 1x PBS contenente lo 0,1% di Triton X-100 per 10 minuti. Lavare rapidamente le celle con 1x PBS. Ripetere la fase di lavaggio due volte per 10 minuti ad ogni lavaggio.
4. Aggiungere 350 μL di soluzione bloccante (1x PBS contenente il 2% di albumina sierica bovina) ai CV e lasciarli agire per almeno 30 minuti. Centrifugare l'anticorpo primario (AB) (5 × g per 30 s) e mescolarlo con la soluzione bloccante alla diluizione richiesta, ad esempio anti-GFP a 1:600.
   1. Trasferire i vetrini coprioggetti in parafilm in una camera umidificata (una scatola con fazzoletto imbevuto d'acqua per mantenere l'umidità ed evitare l'evaporazione). A seconda delle dimensioni dei CV, aggiungere con cautela 60 o 80 μL di diluizione dell'anticorpo primario a ciascun CV e assicurarsi che le cellule siano a contatto con l'anticorpo. Incubare i CV o/n a 4 °C.
      NOTA: Sulla superficie CV deve essere formata una gocciolina che copra l'intera superficie CV. Evitare di disturbare le cellule durante il pipettaggio della soluzione anticorpale sui CV. Il tempo di incubazione potrebbe essere ridotto a 2 ore alla RT.
5. Lavare i CV con 1x PBS per 10 minuti sopra il parafilm. Ripetere la fase di lavaggio due volte.
6. Diluire l'AB secondario, ad esempio Alexa 488 (1:500) e il 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1:2.000) in soluzione bloccante. A seconda delle dimensioni dei CV, aggiungere una gocciolina da 60-80 μl della soluzione AB secondaria sulle cellule. Incubare i CV per 1 ora al buio a RT. Lavare l'AB secondario e il DAPI dai neuroni con 1x PBS per 10 minuti e ripetere questo passaggio due volte.
7. Montare i CV nel terreno di montaggio (vedere la Tabella dei materiali) per l'analisi in immunofluorescenza e conservarli al buio a 4 °C dopo l'essiccazione.
8. Acquisizione e analisi delle immagini.
   NOTA: È stato utilizzato un microscopio invertito per scattare le immagini a 20x (Figura 4A, vedere la Tabella dei materiali).
   1. Utilizzare il software open-source ImageJ per analizzare le immagini e ottenere la maschera per il canale GFP (Figura 4C).
      NOTA: Esistono diversi modi per l'imaging e l'analisi dei neuroni, a seconda della disponibilità dell'attrezzatura e del formato sperimentale. Il seguente flusso di lavoro è fornito come esempio di base in cui l'obiettivo è identificare il soma dei singoli neuroni che esprimono GFP presenti nell'immagine. I valori specifici qui presentati, come il valore soglia e la dimensione delle particelle, devono essere testati dall'utente in base alle sue specifiche condizioni sperimentali. Inoltre, possono essere aggiunti diversi filtri e fasi di elaborazione. Ad esempio, i filtri ImageJ Sottrai sfondo e Elimina macchie spesso aiutano a pulire l'immagine all'inizio dell'elaborazione. L'ottimizzazione del flusso di lavoro per specifiche condizioni sperimentali richiede una precedente esperienza nell'analisi delle immagini e la conoscenza dei concetti di base dell'analisi quantitativa delle immagini. Poiché una guida approfondita sull'analisi delle immagini esula dall'ambito del protocollo corrente, si consiglia di utilizzare le seguenti risorse: Guida per l'utente di ImageJ, https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/; per esempi e tutorial, https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm; Pacchetto MBF ImageJ, https://imagej.net/mbf/index.htm.
   2. Per la segmentazione, selezionare la segmentazione dell'intensità con i parametri necessari per isolare il soma, che è la regione più luminosa dei neuroni.: Menu | Immagine | Regola | Soglia | Impostazione della soglia minima (ad esempio, 100) | clicca su Applica.
   3. Ripetere la soglia da 4.8.2. a tutte le immagini per vedere la maschera (cioè l'immagine segmentata) per i somi dei neuroni (Figura 4E).
   4. Per ottenere il numero di celle sopravvissute in ogni immagine ed esportare i risultati in un foglio di calcolo per eseguire i calcoli, selezionare Menu | Analizza | Analizza le particelle e inserisci i valori dei parametri necessari (ad esempio, Dimensione: 50-infinity pixel; Circolarità: 0,5-1,00). Si consideri che a t = 0 h, il numero di cellule contate è il numero totale di cellule identificate, e si calcoli la percentuale di cellule sopravvissute nei diversi punti temporali.
      NOTA: Una soglia di dimensioni più bassa è utile per filtrare gli oggetti più piccoli rispetto al soma (ad esempio, 60-80 μm²).
   5. Utilizzare la funzione Registra macro di ImageJ per automatizzare e ripetere l'analisi: Menu | Plugin | Macro | Registra | fare clic su Crea per generare la macro.

5. Analisi in tempo reale con IN Cell Analyzer 2200

1. Inserire la piastra a 12 pozzetti nell'analizzatore di celle, collegare il sistema di CO₂ e impostare la temperatura a 37 °C.
   NOTA: Questo passaggio può essere facilmente scalato in questa piattaforma, eseguendo un esperimento simile in neuroni placcati in una piastra a 96 pozzetti.
2. Seleziona l'obiettivo 20x, seleziona casualmente 5 campi per pozzetto (che coprono il 2,33% del pozzetto in questo esempio) e focalizzali automaticamente per ogni canale di fluorescenza (isotiocianato di fluoresceina [FITC] in questo caso). Selezionare i parametri di acquisizione (time-lapse di 30 minuti per 16 ore). Premi Start e attendi.
   NOTA: Il numero di campi di imaging deve essere determinato dallo sperimentatore e deve essere sufficiente per tenere conto della variabilità all'interno di un singolo pozzetto.
3. Utilizzare IN Cell Developertoolbox v1.9 per impostare il flusso di lavoro appropriato per l'analisi.
4. Analizzare le immagini dei neuroni (canale FITC) per generare una maschera per il soma dei neuroni (Figura 4).
   NOTA: L'obiettivo è identificare il soma dei singoli neuroni presenti nell'immagine. Questa analisi segue passaggi equivalenti a quelli descritti nella sezione 4 per ImageJ. Si prega di fare riferimento alla sezione 4 per il flusso di lavoro e le considerazioni generali. La soglia di intensità viene determinata per selezionare il soma, che è la regione più luminosa dei neuroni.
   1. Per la segmentazione, selezionare la segmentazione Intensità con i parametri necessari (in questo caso, una soglia minima di 20005.40).
   2. Per la post-elaborazione, selezionate l'opzione Setaccia , mantenendo i target con un'area maggiore di un valore predeterminato (in questo caso, 189 pixel (~80 μm²)).
   3. Selezionare il parametro Somma per contare e sommare tutti i neuroni identificati nella maschera (neuroni sopravvissuti) per ogni campo e per tutti i campi di un pozzetto in ogni punto temporale dell'andamento temporale.
   4. Esporta i risultati in un foglio di calcolo. A t = 0 h, considera che il numero di cellule contate sono le cellule totali identificate e calcola la percentuale di cellule che sono sopravvissute nei diversi punti temporali. Calcola il tempo in cui il 50% delle celle è morto per facilitare il confronto tra le condizioni.
      NOTA: I parametri per le fasi di segmentazione e post-elaborazione devono essere regolati dall'utente per diversi canali fluorescenti a seconda delle strutture da identificare.

Risultati

Questo protocollo mira a stabilire un modello in vitro di ictus. È importante ottenere un'adeguata densità neuronale, che consentirà il riconoscimento dei singoli neuroni elettroporati per analizzarli individualmente. Anche la fase della coltura neuronale dopo la piastratura è cruciale. La maturazione dei neuroni in coltura è progressiva. La dipendenza dai fattori di crescita, dalla crescita dei neuriti, dalla connettività e dall'attività elettrofisiologica varierà notevolmente a seconda dello stadio. In queste ...

Discussione

Questo protocollo mostra un modo efficace per modellare un ictus in vitro. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo proposto la marcatura sparsa dei neuroni corticali utilizzando il sistema di elettroporazione NEPA21⁵. Si tratta di un sistema aperto che consente la personalizzazione del protocollo con un costo operativo minimo rispetto ad altri sistemi che impiegano kit o dispositivi specifici. La coltura mista di neuroni naïve ed elettroporati consente ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di Petri da 10 cm	FISHER SCIENTIFIC, S.L.	1130-9283
Piastre di Petri da 3,5 cm	Sterilin
75 cm2 pallone	Corning	430641U
B-27	Life Technologies	17504-044
Piastre per colture cellulari	Incorporazione Corning Costar®	3513
Incubatore cellulare	Thermo Electron Corporation	Modello 371
Filtro cellulare 70 µ m	Falcon	352350
Luci fredde	Schott	223488	KL 1500
LCD Vetrini coprioggetti (15 mm)	Marienfeld	111530
CU500 Camera per cuvette	Nepa Gene
CU600 Supporto per cuvette	Nepa Gene
DAPI	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	D9542-10MG	1:2000
DMSO	Panreac	A3672
Dumont Fine Ropeps	FST	11254-20
Dumont Fine Forceps	FST	11252-00
EC-002S NEPA Electroporation Cuvette, 2mm gap	Nepa Gene
Filter Filtro	Falcon	352350
Fine Forbici-Affilato-Blunt	FST	14028-10
Forbici fini-ToughCut r	FST	14058-09
GFP pollo IgY	Aves Labs	GFP-1010	1:600
Glucosio	Sigma	68769-100ml
GlutaMAX-I Integratore 200 mM 100 ml	Fisher Scientific	35050-061
HBSS	Thermofisher	14175-095	https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 M	ThermoFisher	15630-080
Siero di cavallo	Invitrogen	26050088
MEM	Thermofisher	11095080	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
Vetrino per microscopio (polilisina)	VWR	631-0107	Dimensioni: 25 x 75 x 1 mm
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	81381-250G
Aghi gialli, calibro 30	BD Microlance™ 3	304000
NEPA21 elettroporatore	Nepa Gene
Neubauer camera	Blau Marca	717805
Neurobasal Medium	ThermoFisher	21103-49
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
Parafilm	Cole-Parmer	PM996
Paraformaldeide (PFA), 95%	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	158127-500G	Utilizzare la soluzione: 4%
PEI	Polysciences	23966-1
Plasmide per GFP			pCMV-GFP-ires-Cre, descritto in Fazzari et al., Nature, 2010
Poly-L-Lysine	SIGMA	P2636
PS ( Penicillina, Streptomicina)	ThermoFisher	15140122
Forcipe seghettato	FST	11152-10
Stereomicroscopio	WORLD PRECISION INSTRUMENTS
Siringhe	BD Plastipak 1ml	303176
Triton X-100	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	Numero MDL: MFCD00128254
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25300054
Provette 15 mL	Fisher	05-539-4
Provette 50 mL	VWR	21008-242
Tupperware	-	-	Tupperware ermetico con coperchio a vite. SP Berner - Taper 1 L Redondo con Rosca. Qualsiasi Tupperware ermetico equivalente può essere acquistato in qualsiasi supermercato.
Bagnomaria	SHELDON LABORATORY MODEL 1224	1641951

non ionico