Costruzione e implementazione di array di microelettrodi in fibra di carbonio per registrazioni in vivo croniche e acute

Sommario

Questo protocollo descrive una procedura per la costruzione di array di microelettrodi in fibra di carbonio per registrazioni elettrofisiologiche croniche e acute in vivo nel topo (Mus musculus) e nel furetto (Mustela putorius furo ) da più regioni del cervello. Ogni passaggio, dopo l'acquisto di fibre di carbonio grezze per l'impianto di array di microelettrodi, è descritto in dettaglio, con particolare attenzione alla costruzione di array di microelettrodi.

Abstract

Gli array di elettrodi multicanale offrono informazioni sul cervello funzionante e servono a chiarire i processi neurali a livello di singola cellula e circuito. Lo sviluppo di questi strumenti è fondamentale per comprendere comportamenti e cognizione complessi e per far progredire le applicazioni cliniche. Tuttavia, rimane una sfida registrare densamente da popolazioni cellulari in modo stabile e continuo per lunghi periodi di tempo. Molti elettrodi popolari, come tetrodi e array di silicio, presentano grandi diametri incrociati che producono danni all'inserimento e suscitano risposte croniche del tessuto reattivo associate alla morte neuronale, ostacolando la registrazione di un'attività neurale stabile e continua. Inoltre, la maggior parte dei fasci di fili presenta un'ampia spaziatura tra i canali, precludendo la registrazione simultanea da un gran numero di celle raggruppate in una piccola area. Gli array di microelettrodi in fibra di carbonio descritti in questo protocollo offrono una soluzione accessibile a queste preoccupazioni. Lo studio fornisce un metodo dettagliato per fabbricare array di microelettrodi in fibra di carbonio che possono essere utilizzati sia per registrazioni acute che croniche in vivo. Le proprietà fisiche di questi elettrodi li rendono ideali per registrazioni stabili e continue a lungo termine ad alte densità di cellule, consentendo al ricercatore di effettuare registrazioni robuste e inequivocabili da singole unità per mesi.

Introduzione

Elettrodi e array di elettrodi sono strumenti preziosi per capire come il cervello elabora le informazioni a livello neuronale. Mentre le registrazioni elettrofisiologiche sono realizzabili da oltre due secoli¹, non è ancora possibile misurare contemporaneamente l'attività di interi circuiti neurali alla risoluzione spaziale e temporale necessaria per catturare il picco dei singoli neuroni. Sebbene i metodi non invasivi, come l'elettroencefalografia², la topografia dell'emissione di^{positroni 3}e la risonanza magnetica funzionale⁴ consentano misurazioni dell'intero cervello, non possono raggiungere la risoluzione spaziale e temporale necessaria per risolvere l'attività dei circuiti neurali^2,5. Al contrario, i metodi di imaging come l'imaging ottico che utilizza coloranti sensibili alla tensione o indicatori di calcio geneticamente codificati possono raggiungere una risoluzione spaziale a singola unità, ma pongono problemi come bassa risoluzione temporale e scarsa selettività^3,4,5,6. Le registrazioni elettriche sono una potente alternativa a questi metodi. Gli elettrodi di registrazione forniscono una risoluzione temporale senza precedenti e consentono all'utente di effettuare misurazioni con precisione spike-time in qualsiasi regione del cervello⁷. Inoltre, gli array multielettrodi (MEA) impiantati cronicamente consentono registrazioni su larga scala (da decine a centinaia di cellule) di singole cellule negli animali che si comportano per un periodo da giorni ai mesi^8,9. Tuttavia, le sonde di silicio che registrano a densità più elevate hanno un grande ingombro e sono altamente invasive, e gli array impiantati cronicamente spesso generano una risposta infiammatoria, incapsulamento tissutale e morte neuronale^10,11,12,13.

Le limitazioni degli elettrodi esistenti hanno portato a recenti innovazioni che consentono registrazioni stabili, ad alta risoluzione e a lungo termine. Gli elettrodi tipici sono costituiti da un conduttore metallico, come il tungsteno o il platino-iridio, o sono a base di silicio o polimeri. Mentre gli array di microfili a base di metallo possono mantenere registrazioni stabili a lungo termine, hanno un ingombro molto più grande, con un diametro di un singolo filo che va da 10-200 μm¹⁴. Al contrario, gli array di elettrodi a base di silicio producono registrazioni con alta risoluzione spaziale, ma a causa del loro design relativamente rigido, in genere non sono in grado di mantenere il segnale e registrare dagli stessi neuroni per molti mesi¹⁵. I recenti sviluppi negli array a base di silicio hanno portato a elettrodi in grado di eseguire in modo affidabile registrazioni croniche, ma questi array non possono essere utilizzati per registrare da regioni cerebrali profonde in animali più grandi e sono destinati a registrazioni lineari⁹. I progressi negli array polimerici hanno portato a una maggiore flessibilità e stabilità di registrazione delle singole unità e offrono il potenziale per registrazioni ad alta densità nel prossimo futuro, ma con disponibilità limitata al momento^8,16,17. Le fibre di carbonio consentono registrazioni ad alta densità con materiali pronti all'uso descritti qui.

I microelettrodi di registrazione in fibra di carbonio sono stati utilizzati per decenni, con i primi elettrodi in fibra di carbonio costituiti da una singola fibra di carbonio inserita in una micropipetta di vetro. Questi microelettrodi sono stati utilizzati per registrazioni extracellulari a singola unità e, sebbene il rapporto segnale-rumore fosse paragonabile ai migliori microelettrodi di tungsteno in vetro, erano vantaggiosi per la loro flessibilità, valori di impedenza inferiori e semplicità di produzione^18,19. Gli sforzi per sviluppare array di elettrodi in fibra di carbonio hanno recentemente accelerato a causa delle capacità di biorilevamento delle fibre di carbonio. Oltre alla loro maggiore biocompatibilità e all'eccezionale conduttività elettrica, presentano un insieme unico di proprietà, tra cui resistenza alle alte temperature, bassa densità relativa, elevata resistenza alla trazione, bassa rigidità di flessione, elevata sensibilità di rilevamento e una piccola area di sezione trasversale^10,12. Tutte queste proprietà hanno motivato lo sviluppo di array di microelettrodi in fibra di carbonio (CFEA) che facilitano le registrazioni croniche, stabili e ad alto rendimento di singoli neuroni. Tali CFEA possono ora essere realizzati a mano^20,21 (Figura 1),producendo array di microelettrodi che possono contenere singoli neuroni per mesi. Qui è descritto un processo di costruzione accessibile per i CFEA che è stato adattato in due modi per le registrazioni acute e croniche di singoli neuroni in due specie.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dalla Brandeis University o dalla Washington University Animal Care and Use Committee. I dati mostrati sono stati raccolti da un furetto femmina e un topo maschio.

1. Preparazione di fibre di carbonio e strumenti

1. Preparazione di fibre di carbonio commerciali
   1. Tagliare strisce di 8 cm dal fascio di fibre di dimensioni epossidiche. Posare le strisce parallele in un crogiolo e cuocere in forno a 400 °C per 6 ore per rimuovere la resina epossidica dalle fibre commerciali. Quindi, conservare le fibre cotte in una capsula di Petri standard o in un tubo conico.
      NOTA: Sono state utilizzate fibre con un diametro di 7 μm. Altri gruppi hanno utilizzato fibre da 4 μm^20,21.
   2. Preparare le cassette per contenere le singole fibre. Utilizzare una stampante 3D o un cutter laser per creare le cassette e il supporto per cassette associato (vedere la Figura 2).
   3. Caricare le fibre sulle cassette. Iniziare posando un pezzo di nastro biadesivo sui due lati lunghi della cassetta, allineando il bordo del nastro con il bordo interno della cassetta. Separare le singole fibre dal fascio cotto e posarle parallelamente al lato corto della cassetta, mantenendo 2-3 mm tra le fibre. Assicurarsi di montare 20-30 fibre su ogni cassetta. Sigillare le fibre in posizione posando del nastro trasparente sul nastro biadesivo. Posizionare le cassette riempite nel supporto della cassetta.
      NOTA: per un costruttore esperto, il riempimento di una cassetta di fibre richiederà ~ 1 ora. Per il costruttore alle prime armi, questo processo richiederà probabilmente ~ 1,5-3 ore. Ci sono dieci cassette in una scatola e due portacassette possono stare nella camera di deposizione del parylene.
   4. Rivestire le singole fibre con parylene C utilizzando una camera di deposizione sottovuoto commerciale. Per il rivestimento è necessaria una singola corsa. Misurare 2,3 g di parylene per ogni corsa. Due portacassette si inseriscono nella camera alla volta. La procedura di rivestimento richiede ~ 2 ore per corsa.
      NOTA: una misura di 2,3 g di parylene C fornisce circa 1 μm di rivestimento. Le fibre rivestite possono essere conservate a tempo indeterminato.
2. Preparazione dello strumento di manipolazione della fibra di carbonio
   1. Avvolgere un piccolo pezzo di pellicola adesiva flessibile attorno a un ago da 30 G, formando un punto affilato ma flessibile con la pellicola adesiva.
      NOTA: avvolgere una punta dell'ago con parafilm e allungare il parafilm in tal modo, crea un lieve effetto adesivo che consente all'utente di raccogliere e manovrare le singole fibre.

2. Progettazione e fabbricazione

1. Selezionare il design della maschera appropriato necessario in base alle specifiche dell'elettrodo da costruire. Questo si baserà sul numero di canali necessari, insieme a eventuali aggiunte di design.
   NOTA: Jig si riferisce al blocco stampato in 3D che fornisce un ancoraggio per elettrodi e connessioni elettriche.
2. Creare o modificare il progetto specifico della maschera utilizzando un software CAD (Computer-Aided Design).
3. Utilizzare una società di stampa 3D o il laboratorio di maker istituzionale per stampare le maschere utilizzando una stampante 3D SLA ad alta risoluzione.

3. Assemblaggio dell'array di microelettrodi in fibra di carbonio (CFEA)

NOTA: questo passaggio richiede ~ 2 ore per un costruttore esperto e ~ 6 ore per un costruttore alle prime armi. Esegui tutte le fasi di assemblaggio CFEA e le fasi di raggruppamento delle fibre sotto uno stereomicroscopio 10x. Assemblaggio completo del CFEA in un ambiente con un movimento d'aria minimo, in quanto ciò potrebbe disturbare il processo di costruzione.

1. Scegli la maschera appropriata necessaria per costruire l'elettrodo desiderato.
2. Utilizzando tagliafili metallici, tagliare due pezzi di filo di tungsteno di diametro 0,003 in (76,2 μm), circa 7 cm di lunghezza.
3. Alimentare ogni filo attraverso il canale appropriato all'estremità del connettore della maschera (GND e REF). Alimenta abbastanza fino a quando le due estremità sono uguali in lunghezza, quindi ruotale insieme per fissarle sulla maschera.
   NOTA: per il design acuto a 16 canali, assicurarsi che il filo metallico si adatti alla cresta della maschera.
   1. Applicare cemento dentale polimerizzato uv per fissare il filo. Assicurarsi di non ottenere cemento dentale all'interno del canale aperto attraverso il quale viene alimentato il filo.
      NOTA: l'utente deve indossare una protezione per gli occhi con filtraggio UV durante tutte le procedure relative ai raggi UV per prevenire potenziali danni agli occhi. Molte bacchette di polimerizzazione UV hanno filtri di visualizzazione integrati.
   2. Usando la bacchetta di polimerizzazione UV, curare il cemento dentale per 20 s.
   3. Fissare la maschera nella morsa del gioiello da uno dei bracci della maschera. Orientare la maschera in modo che una delle facce laterali sia parallela al terreno.
   4. Orientare la maschera e la morsa sotto il microscopio in modo che l'estremità del connettore, il bacino e la punta dell'imbuto siano visibili. Orientare la maschera in modo che l'imbuto sia rivolto lontano dall'utente e l'estremità del connettore sia rivolta verso l'utente.
   5. Raccogli gli strumenti in fibra di carbonio e un ago da 25 G con punta affilata.
   6. Posizionare una cassetta con fibre rivestite di parylene-C su un foglio di carta bianco, lato nastro in alto in modo che le fibre non siano direttamente sulla carta.
   7. Utilizzare l'ago da 25 G per tagliare una singola fibra di carbonio dalla cassetta. Fallo facendo scorrere la punta dell'ago contro la cassetta da cui emerge la fibra da rimuovere.
      1. Se si costruisce utilizzando mezze fibre, tagliare un'estremità della fibra come descritto sopra. Orientare la fibra in modo che sia dritta e, usando l'ago, tagliare la fibra a metà tagliando la fibra contro la carta. Per tagliare l'altra metà, che è ancora collegata alla cassetta, tenere la punta libera della fibra con lo strumento in fibra di carbonio che è stato realizzato in precedenza, quindi utilizzare l'ago per tagliare la fibra ancora collegata alla cassetta come descritto sopra.
      2. Se si costruisce utilizzando fibre piene, tagliare un'estremità della fibra come descritto sopra. Utilizzare lo strumento in fibra di carbonio precedentemente realizzato e tenere l'estremità libera della fibra che è stata appena tagliata. Usando l'ago, tagliare l'altra estremità della fibra lontano dalla cassetta.
   8. Raccogli la fibra di carbonio utilizzando lo strumento in fibra di carbonio precedentemente realizzato. Raccogli la fibra in modo che un'estremità abbia circa 1 cm di lunghezza dallo strumento.
   9. Utilizzare lo strumento in fibra di carbonio con la fibra attaccata e alimentare l'estremità più corta della fibra attraverso il pezzo di imbuto dal bacino centrale della maschera. Usa un microscopio per visualizzare.
      1. Continuare ad alimentare la fibra attraverso l'imbuto della maschera fino a quando la maggior parte della lunghezza della fibra è passata (vedere figura 3A).
      2. Alimenta la parte posteriore della fibra attraverso un canale disponibile utilizzando lo strumento in fibra di carbonio precedentemente realizzato. Alimenta la fibra attraverso la parte posteriore fino a quando circa 5 mm di fibra sporge dalla parte posteriore. Tagliare a misura se necessario (vedere Figura 3B).
         NOTA: non alimentare le fibre in canali che contengono i fili metallici.
   10. Riempi il resto dei canali con fibre su un lato della maschera, seguendo le indicazioni sopra riportate.
       NOTA: quando si alimentano le fibre nell'imbuto, alimentare metà delle fibre in ciascuna divisione dell'imbuto, con la metà destra dei canali nella divisione destra e la metà sinistra dei canali nella divisione sinistra. Quando le fibre sono a stretto contatto all'interno dell'imbuto, c'è un attrito sfavorevole tra le fibre che porta a fibre esistenti tirate allentate o rotte mentre alimentano nuove fibre nella maschera. Questa divisione in quattro sezioni fornisce un certo sollievo, poiché le fibre sono mantenute in fasci più piccoli fino a un passaggio successivo.
   11. Utilizzare un accendino a ruota a scintilla standard e passare rapidamente la fiamma sulle fibre esposte all'estremità del connettore. Assicurarsi che l'isolamento di tutte le fibre venga rimosso alle estremità (vedere Figura 3C).
       NOTA: la parte delle fibre che sono state esposte alla fiamma dovrebbe apparire leggermente più sottile rispetto al resto della fibra.
   12. Alimenta la fibra fiammata attraverso la maschera in modo che la parte della fibra esposta alla fiamma sia ora all'interno del canale. Assicurarsi che nessuna fibra sporga dal retro della maschera (vedere la Figura 3D).
       NOTA: utilizzare lo strumento fibra di carbonio per afferrare la fibra dall'interno del bacino e alimentare la fibra fiammata attraverso la maschera. Non toccare la porzione delle fibre esposte alla fiamma, in quanto questa porzione è più fragile.
   13. Applicare cemento dentale polimerizzato UV alle fibre nel bacino della maschera. Riempire l'intero bacino per coprire le aperture dei canali e l'apertura dell'imbuto (vedi Figura 3E).
       1. Utilizzare la luce UV e curare il cemento dentale per 20 s. Cura per ulteriori 20 s se il cemento dentale non è completamente indurito.
          NOTA: Assicurarsi che il cemento dentale non viaggi all'interno dei canali.
   14. Rimuovere la maschera dalla morsa, capovolgerla e fissare la maschera nella morsa come precedentemente fissato. Assicurati che il lato contenente le fibre sia ora rivolto verso il basso.
   15. Riempire il lato vuoto della maschera con fibre di carbonio esattamente come descritto sopra.
   16. Una volta che tutti i canali hanno fibre e le fibre sono fissate con cemento dentale, rimuovere la maschera dalla morsa e orientare la maschera in modo che l'imbuto sia rivolto verso il basso. Fissare la maschera nella morsa in modo che l'estremità del connettore sia rivolta verso l'alto.
   17. Raccogliere un ago da 25 G con punta affilata, una siringa da 1 mL, vernice conduttiva argentata, applicatori con punta in cotone, diluente per vernici, salviette per tessuti e il connettore headstage appropriato.
       NOTA: Assicurarsi che la vernice conduttiva d'argento sia ben miscelata e sia una soluzione omogenea. Non lasciare asciugare la vernice.
   18. Aspirare 0,3 mL di vernice argentata nella siringa da 1 mL, quindi attaccare l'ago da 25 G con punta affilata.
   19. Inserire con attenzione l'ago in un canale fino a quando non viene fermato dal cemento dentale. Premere lentamente la siringa mentre si rimuove l'ago dal canale per riempire il canale con vernice (vedere Figura 3E).
   20. Pulire qualsiasi vernice dall'ago, quindi continuare fino al canale successivo.
       1. Riempi tutti i canali con la vernice.
          NOTA: potrebbero essere necessari passaggi aggiuntivi nei canali poiché la vernice si inserisce nei canali per i primi minuti.
   21. Immergere un applicatore con punta di cotone nel diluente per vernici, quindi pulire la base della maschera di qualsiasi vernice sulla superficie. Alcuni applicatori con punta di cotone possono essere necessari per questo.
       NOTA: gli applicatori con punta in cotone non immersi nel diluente per vernici possono anche essere utili per pulire la maschera.
   22. Inserire il connettore headstage nell'orientamento corretto allineando i pin con i canali. Assicurarsi che il connettore dell'headstage sia dritto in posizione verticale e sia il più possibile a filo con la maschera (vedere la Figura 3F).
   23. Lasciare che la maschera si polimerizzi per 24 ore.
   24. Fissare il connettore dell'headstage alla maschera utilizzando cemento dentale polimerizzato UV applicando cemento dentale lungo il bordo in cui il connettore del palco principale incontra il maschera. Polimerizzazione UV utilizzando una luce UV per 20 s.

4. Imballaggio del fascio di fibre

Nota : ci vogliono circa 30 minuti per eseguire questo passaggio. Completa questo passaggio per gli elettrodi utilizzati nei modelli animali con uno spesso strato di pia madre. Rinforzare il fascio di fibre per ridurre al minimo la flessione. Nelle procedure del mouse, questo passaggio potrebbe non essere necessario.

1. Riunire il fascio di fibre in un unico albero usando la tensione dell'acqua. Utilizzare una pipetta di trasferimento per far scorrere una goccia d'acqua dalla punta dell'imbuto alla punta del fascio mentre l'elettrodo è fissato in posizione verticale in una morsa.
2. Inizia con l'applicazione di uno strato di cemento dentale di circa 1,5 mm di spessore attorno al fascio sulla punta dell'imbuto. Curare il cemento dentale con 20 s di luce UV.
   NOTA: Per le registrazioni corticali, non è necessario alcun ulteriore imballaggio. Per le regioni cerebrali più profonde, fissare un tubo guida attorno al fascio.
3. Costruzione del tubo guida e inserimento del fascio nel tubo guida
   1. Misurare e tagliare la lunghezza desiderata del tubo in poliimmide. Assicurarsi che la lunghezza del tubo in poliimmide lasci liberi 2 mm di punte in fibra di carbonio. Misurare e tagliare un pezzo di tubo metallico da 30 G 2 mm più corto del tubo in poliimmide. Utilizzare uno strumento rotante per rimuovere eventuali spigoli vivi sul tubo metallico. Inserire il tubo in poliimmide all'interno del tubo metallico.
   2. Posizionare l'elettrodo in una morsa con il fascio in fibra di carbonio rivolto verso l'alto. Fissare il tubo assemblato a un micromanipolatore e, utilizzando un microscopio, abbassarlo con attenzione sul fascio di fibre. Fissare il tubo alla base di cemento dentale esistente utilizzando uno strato aggiuntivo di cemento dentale. Curare il cemento dentale con 20 s di luce UV.
      NOTA: il processo di costruzione può essere sospeso qui.

5. Preparazione della punta dell'elettrodo

Nota : ci vogliono circa 30 minuti per matrice per eseguire questo passaggio.

1. Tagliare gli elettrodi alla lunghezza desiderata.
   1. In preparazione per il taglio della punta dell'elettrodo, impilare note adesive per costruire una piattaforma alta circa 1,5 mm. Misurare, dal bordo della piattaforma, la lunghezza dell'elettrodo desiderata e segnare questa distanza. La piattaforma fungerà da guida per il taglio.
   2. Abbassare l'elettrodo in un becher di acqua deionizzata o distillata fino a quando la punta dell'imbuto è completamente sommersa, punta prima e mantenuta normale alla superficie. Riunire le singole fibre di carbonio rimuovendo l'elettrodo dall'acqua. La tensione superficiale riunirà i fasci. Lasciare asciugare l'elettrodo all'aria per 30 minuti.
   3. Attaccare la lama del bisturi #10 al manico. Congelare il bisturi e l'elettrodo mettendoli in un congelatore a -18 °C per almeno 5 minuti.
   4. Posare l'elettrodo in modo che le fibre giacciano a filo sulla superficie della guida (preparato al punto 5.1.1). Tagliare le fibre alla lunghezza desiderata con il bisturi, usando un movimento di rotolamento. Completare rapidamente questo passaggio per assicurarsi che l'elettrodo e il bisturi siano ancora congelati (vedere figura 3G).
2. Iniettare corrente positiva per ridurre l'impedenza delle punte degli elettrodi.
   1. Collegare l'elettrodo al tester di impedenza multielettrodo utilizzando l'adattatore appropriato (vedere Tabella dei materiali). Punta inferiore dell'elettrodo ~ 2 mm in un tubo microcentrifuga di 0,1 M soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Inserire il filo di messa a terra nel tubo della microcentrifuga.
   2. Iniettare corrente con l'ampiezza e la durata scelte.
      NOTA: questo passaggio ha lo scopo di ridurre i valori di impedenza sulla punta del CFEA. In questo studio, i seguenti parametri sono stati inseriti nell'interfaccia utente grafica del software galvanico: Corrente: 0,100 μA; Durata: 10 s; Pausa: 1 s. Questo processo può essere ripetuto se necessario, per canale, fino a quando le impedenze degli elettrodi soddisfano i valori desiderati (vedere Figura 4C).
   3. Una volta che i valori di impedenza sono come desiderato, sciacquare le fibre in acqua deionizzata o distillata per pulire.
3. Piastra elettrolitica nella soluzione di placcatura in oro.
   NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito poco prima dell'impianto (lo stesso giorno).
   ATTENZIONE: Alcune delle sostanze chimiche utilizzate nella preparazione delle punte CFEA sono corrosive, inclusa la soluzione di placcatura in oro. Consultare la SDS prima dell'uso e determinare le misure precauzionali appropriate da adottare per gestire la soluzione in modo sicuro.
   NOTA: Per fornire rigidità al fascio di fibre, l'utente può creare una soluzione di placcatura in oro solubilizzando prima PEG8000 in acqua deionizzata o distillata a 1 mg / mL. Quindi, combinare la soluzione di placcatura in oro solubilizzata PEG8000 e 375 μL solubilizzata e la soluzione a vortice per 10 s da miscelare. Il PEG8000 si dissolverà dopo l'inserimento di fibre nel cervello.
   1. Abbassare la punta del fascio di elettrodi ~ 2 mm nel tubo microcentrifuga della miscela di placcatura. Inserire il filo di messa a terra nel tubo microcentrifuga.
   2. Impostare i parametri appropriati per la galvanostegia. In questo studio, i seguenti parametri sono stati inseriti nell'interfaccia utente grafica del software galvanico: Corrente: -0,05 μA; Durata: 30 s; Pausa: 5 s.
   3. Risciacquare accuratamente le fibre con acqua deionizzata o distillata. A questo punto, misurare nuovamente i valori di impedenza, se lo si desidera.

6. Inserimento nel cervello: chirurgia di sopravvivenza, topo(Mus musculus)e chirurgia di non sopravvivenza, furetto(Mustela putorius furo)

NOTA: le procedure chirurgiche devono seguire il protocollo standard in conformità con IACUC. Per informazioni dettagliate vedere Ma et al.²² per il protocollo di chirurgia di sopravvivenza e Popovic et al.²³ per il protocollo di chirurgia non di sopravvivenza. Seguire le procedure chirurgiche asettiche secondo le linee guida ASC per la chirurgia di sopravvivenza nelle specie di roditori. Questi includono l'autoclave di tutti gli strumenti e i materiali chirurgici a 135 ° C per 15 minuti e il trattamento dell'apparato stereotassico e dell'area chirurgica con il 70% di etanolo. Utilizzare guanti chirurgici sterili, un camice monouso e una maschera facciale durante la procedura.

1. Chirurgia di sopravvivenza, topo (Mus musculus).
   1. Anestetizzare i topi con il 2,5% di isoflurano in una scatola di induzione per ~ 1 minuto, fino a quando la frequenza respiratoria raggiunge 55-65 respiri / min. Quindi, somministrare il 2,0% di isoflurano attraverso un cono nasale per mantenere l'anestesia. Applicare un unguento veterinario su entrambi gli occhi per prevenire danni alla cornea. Eseguire un pizzicamento della punta per verificare il corretto grado di anestesia.
   2. Dopo la verifica, seguire le procedure chirurgiche di sopravvivenza dettagliate in Ma et al.²². Monitorare la frequenza respiratoria e mantenerla a 60 respiri/min. Mantenere la temperatura corporea a 37 °C utilizzando una piastra riscaldante termostaticamente controllata. Vedere i passaggi 6.3-6.5 (dettagliati di seguito) per le istruzioni sulla preparazione del cranio per la craniotomia, la durotomia e l'impianto di elettrodi.
   3. Dopo l'intervento chirurgico, riportare i topi in una gabbia di recupero, dotata di una piastra riscaldante a 37 °C, isolata dagli altri animali.
   4. Coprire le ferite chirurgiche nell'unguento antibiotico. Monitorare gli animali fino a quando non riacquistano una coscienza sufficiente per mantenere la reclinazione sternale e consentire loro di recuperare per un periodo di 2-5 giorni. Ospitali singolarmente e monitora continuamente i segni di infezione o disagio. Somministrare agli animali una dose di buprenorfina 72 ore a rilascio prolungato (0,5-1,0 mg/kg) il giorno dell'intervento come analgesico.
2. Chirurgia di non sopravvivenza, furetto (Mustela putorius furo)
   1. Anestetizzare il furetto inizialmente con ketamina (20 mg / kg, i.m.), quindi ventilare con 1,0% -2,0% di isoflurano in una miscela 2: 1 di protossido di azoto e ossigeno attraverso una maschera. Eseguire un pizzicamento della punta per verificare il corretto grado di anestesia.
   2. Dopo la verifica, seguire le procedure chirurgiche di non sopravvivenza dettagliate in Popovic et al.²³. Eseguire una tracheostomia e ventilare gli animali con l'1,0% -2,0% di isoflurano in una miscela 2:1 di protossido di azoto e ossigeno. Applicare un unguento veterinario su entrambi gli occhi per prevenire danni alla cornea.
   3. Mantenere la temperatura corporea a 37 °C utilizzando una piastra riscaldante termostaticamente controllata. Monitorare la frequenza cardiaca, i livelli di CO₂ di fine marea e la frequenza respiratoria. Mantenere la frequenza respiratoria entro l'intervallo fisiologico appropriato (3,5%-4,0%). Vedere i passaggi 6.3-6.5 (dettagliati di seguito) per le istruzioni sulla preparazione del cranio per la craniotomia, la durotomia e l'impianto di elettrodi.
   4. Monitorare continuamente l'ECG dell'animale per garantire un'adeguata anestesia e aumentare la percentuale di isoflurano se l'ECG indica qualsiasi disagio.
   5. Al completamento dell'esperimento, somministrare 1 mL di pentobarbital sodico e fenitoina sodica al furetto e monitorare fino a quando la frequenza cardiaca e la CO 2 di fine marea_misurano 0.
3. Preparazione del cranio
   1. Utilizzando una bava da 0,8 mm, forare una singola craniotomia di 4 mm x 4 mm nella posizione desiderata per l'impianto. Per il mouse, praticare un foro di bava aggiuntivo in un sito controlaterale per l'inserimento di viti rettificate in acciaio inossidabile.
      NOTA: Non eseguire una durotomia fino a quando l'elettrodo non è pronto per l'impianto.
   2. Stabilire un motivo/riferimento. Negli esperimenti di furetto acuto, utilizzare un ago da 18 G per perforare la pelle e lo strato di muscolo che circonda il cranio sul lato della testa dell'animale opposto alla craniotomia. Inserire l'estremità del filo dell'elettrodo di riferimento Ag/Cl nella punta dell'ago, quindi ritrarre l'ago dal muscolo / pelle in modo che il pellet sia ora saldamente seduto tra il muscolo e il cranio. Nel mouse, avvolgere il filo di terra argentato attorno alla vite di messa a terra in acciaio inossidabile. Sicuro con cemento dentale polimerizzato UV.
   3. Collegare l'elettrodo al supporto dell'elettrodo utilizzando una sottile striscia di nastro adesivo e fissare il supporto dell'elettrodo nel micromanipolatore. Collegare il filo di terra a una sorgente di messa a terra tramite una clip a coccodrillo. Attaccare il filo di riferimento all'elettrodo di riferimento incorporato nel muscolo dell'animale.
4. Durotomia e penetrazione pia
   1. Rimuovere la dura dalla craniotomia usando un plettro dura.
   2. Create un piccolo foro nella pia. Per fare questo, inserire e prelevare un microelettrodo metallico (raccomandato nel furetto). In alternativa, abbassare il CFEA ortogonale alla superficie del cervello per evitare qualsiasi vascolarizzazione. Una volta determinata questa posizione, sollevare l'elettrodo e tagliare delicatamente la superficie del cervello in quella posizione con un plettro dura, tirando verso l'alto con il plettro (consigliato nel mouse).
5. Impianto di elettrodi
   1. Abbassare la punta dell'elettrodo nella stessa posizione e, in modalità fine, iniziare a guidare l'elettrodo nel cervello ad una velocità di ~ 2 μm / s. Utilizzare un microscopio per assicurarsi che l'elettrodo entri senza intoppi e non si pieghi.
      NOTA: se l'elettrodo non entra senza intoppi, sollevarlo dal cervello e regolare nuovamente l'angolo. Se continua a piegarsi senza entrare senza intoppi, regola la posizione e ripeti il processo di nicking della superficie del cervello per la nuova posizione di ingresso.
   2. Eseguire l'impianto cronico e acuto utilizzando i seguenti passaggi.
      1. Per l'impianto cronico: cementare l'elettrodo in posizione utilizzando cemento dentale polimerizzato UV.
         1. Chiudere l'incisione usando suture chirurgiche 5-0 e costruire il cappuccio della testa.
         2. Per costruire un copricapo aggiungere ulteriore cemento dentale intorno al sito dell'impianto. Assicurati di coprire il naso della maschera.
         3. Tirare la pelle verso l'alto e intorno al cappuccio. Suturare l'incisione dietro il cappuccio della testa con suture chirurgiche 5-0.
         4. Applicare la crema di lidocaina e l'unguento antibiotico.
         5. Interrompere l'anestetico e seguire le procedure di recupero standard.
      2. Per l'impianto acuto: dopo aver abbassato l'elettrodo e raggiunto la profondità desiderata, attendere almeno 30 minuti prima di iniziare la registrazione elettrofisiologica per consentire all'elettrodo di depositarsi in posizione.

Risultati

Con il completamento di questo protocollo, saranno possibili registrazioni stabili dell'attività di spiking a singola unità. Questi array di microelettrodi sono personalizzabili in materiale, numero di canali e adattatore headstage in base alle esigenze del ricercatore. La galvanostegia delle fibre in oro si traduce in una diminuzione delle impedenze adatte alla registrazione (Figura 4 e Figura 5). Se l'utente intende registrare cronicamente, le misurazioni possono essere effettuate dopo che l'animale si è ripreso dalla procedura chirurgica. Le procedure croniche hanno portato a registrazioni stabili a singola unità per almeno 120 giorni. Una registrazione rappresentativa è mostrata nella Figura 6, che illustra l'attività elettrofisiologica stabile a 64 canali nella corteccia retrospleniale di un topo maschio adulto che si comporta liberamente. Se è prevista una preparazione acuta, le registrazioni possono iniziare poco dopo l'impianto (~ 30 minuti). Ciò consentirà all'elettrodo di depositarsi nel cervello. La Figura 7 fornisce un esempio rappresentativo di una registrazione CFEA acuta a 16 canali acquisita dalla corteccia visiva primaria di un furetto femmina adulto. Lo smistamento delle punte nel mouse e nel furetto è stato eseguito con il software di smistamento delle punte (vedi Tabella dei materiali).

Figura 1: Anatomia dei cfea a microelettrodi a 16 e 32 canali (CFEA). (A) Schemi di CFEA a 32 canali (in alto) e a 16 canali (in basso) da tre diverse viste. Il CFEA a 16 canali presenta un design esteso per scopi di movimentazione. Il design a 32 canali presenta una faccia piatta che consente di combinare due maschere per un CFEA a 64 canali. Entrambi i diagrammi hanno strutture identificative etichettate con dimensioni. L'estremità del connettore indica la posizione dell'inserimento del connettore e i canali GND/REF indicano dove è inserito il filo di messa a terra. Il bacino dell'imbuto si riferisce alla posizione in cui le fibre passano per essere sovrapposte con cemento dentale polimerizzato con luce UV, e la punta dell'imbuto indica il sito da cui le fibre escono dalla maschera. La punta dell'imbuto è divisa in quadranti per ridurre al minimo le fibre che si aggrappano insieme e creano danni. Le fibre vengono successivamente tirate in un unico fascio con l'uso del cemento dentale. Le maschere sono stampate in 3D utilizzando stampanti in resina SLA. I diagrammi sono ingranditi per mostrare i dettagli. (B) CFEA costruito. Il diagramma ha strutture identificative etichettate. La punta del fascio blu rappresenta il segmento delle fibre di carbonio che acquisiscono le misurazioni di registrazione. Il grigio all'interno del bacino dell'imbuto e che circonda il connettore è indicativo di cemento dentale polimerizzato ai raggi UV che mantiene le fibre di carbonio in posizione nel bacino dell'imbuto e fissa il connettore alla maschera. Il filo viola rappresenta il filo di messa a terra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Caricamento di fibre di carbonio grezze in cassette per il rivestimento in parylene C. (A) Le fibre di carbonio sono caricate su cartucce sovrapposte a due strisce di nastro biadesivo (blu). Ogni cassetta è caricata con ~ 25 fibre. (B) Le cassette vengono caricate in un supporto tagliato al laser (grigio) in preparazione del rivestimento in parylene C. Ognuno contiene dieci cassette. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Schema di costruzione del fascio CFEA (Carbon fiber microelectrode array). (A) 16 singole fibre di carbonio rivestite (nere) sono filettate attraverso la maschera stampata in 3D a 32 canali (grigio). (B)Le punte in fibra di carbonio vengono tagliate con microforbici, lasciando la fibra in eccesso pari all'altezza della base della maschera, estendendosi fuori dalla base della maschera. (C) Un accendino a ruota a scintilla in plastica standard viene rapidamente fatto passare sulla fibra in eccesso per rimuovere l'isolamento in parylene C. Lo schema in alto a destra mostra la rimozione del parilene da 9 delle 12 fibre. (D) Le fibre vengono reinserite nella maschera fino a quando l'estremità della fibra non è a filo con la base. Lo schema in alto a destra mostra il reinserimento di 9 fibre con punte di fibra non isolate (grigie) alloggiate all'interno della base della maschera. La maschera viene quindi capovolta e i passaggi A-D vengono ripetuti per infilare i 16 canali opposti. (E) La maschera è riempita con cemento dentale per fissare le fibre. La stampa argentata viene iniettata in ogni pozzetto della base della maschera. (F) Il connettore maschio è inserito nella base della maschera. (G) CFEA e bisturi sono congelati in un congelatore a -20 °C. La punta dell'array viene tagliata alla lunghezza desiderata, lasciando 32 fibre uniformi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Trattamento delle punte e galvanostegia. (A) Le punte degli elettrodi vengono prima collocate in PBS 0,1 M, dove la corrente viene fatta passare attraverso ciascun elettrodo. Le punte vengono quindi risciacquate e trasferite in una soluzione di placcatura in oro, dove vengono galvanizzate con la corrente. (B)Le immagini SEM della fibra di carbonio preparata mostrano la soluzione di placcatura in oro concentrata sulla punta. La barra della scala rappresenta 4 μm. (C) Valori di impedenza da 168 canali dopo il taglio iniziale (viola; 3,11 MΩ ± 0,42 MΩ, mediana ± SE, n = 168 fibre), iniezione di corrente positiva (rosa; 1,23 MΩ ± 0,36 MΩ, mediana ± SE, n = 168 fibre) e galvanica (arancione; 0,19 MΩ ± 0,15 MΩ, ± mediana SE, n = 168 fibre) mostrano valori di impedenza ridotti dopo ogni fase di lavorazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Le durate moderate della galvanostegia dell'oro producono piccoli depositi arrotondati sulle punte dei fasci di fibra di carbonio. Le punte in fibra di carbonio nella foto provengono tutte da diversi array di microelettrodi, riflettendo diverse durate della corrente iniettata per la riduzione dell'impedenza o la placcatura in oro. Le immagini raffigurano inoltre il rivestimento in parylene C, che isola le fibre di carbonio e impedisce qualsiasi acquisizione di segnale da una posizione diversa dalle punte delle fibre. (A) Immagine al microscopio elettronico a scansione delle punte in fibra di carbonio dopo il congelamento e l'esecuzione di un singolo taglio con una lama di rasoio. Le barre di scala rappresentano 10 μm. (B) Uguale ad A ma poi seguita con iniezione di corrente positiva per 10 s. (C) Uguale a B ma poi galvanizzata con oro per 5 s. (D) Uguale a B ma poi galvanizzata con oro per 15 s. (E) Uguale a B ma poi galvanizzata con oro per 30 s. (F) Uguale a B ma poi galvanizzata con oro per 120 s. Abbiamo scoperto che la galvanostegia per 30 s ad una corrente di -0,05 μA era ottimale per le registrazioni elettrofisiologiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Le registrazioni extracellulari croniche nella corteccia retrospleniale di topo che si comporta liberamente con array di microelettrodi in fibra di carbonio mostrano un'attività neurale persistente e stabile. (A) Undici tracce di tensione passabanda sono state registrate contemporaneamente. Le tracce successive registrate dal primo canale (riga superiore) sono tracciate in B per mostrare la durata nel tempo. Le restanti dieci righe dimostrano la coerenza della qualità di registrazione e mostrano un'attività robusta in tutto l'array. La barra della scala a sinistra di ogni traccia rappresenta un potenziale di 200 μV. (B) Dati passabanda dalla stessa fibra della traccia superiore in A, espansi per mostrare un'attività robusta attraverso una registrazione continua di 120 giorni. (C) Il clustering rivela un robusto rilevamento di singole unità nell'arco di mesi. Le tracce rappresentano la forma d'onda media di una singola unità rappresentativa osservabile in modo continuo per 120 giorni, estratta dalla fibra tracciata in B in ogni punto temporale. (D) Forme d'onda spike medie non normalizzate da C impilate per dimostrare la coerenza nel tempo. (E) Le registrazioni in fibra di carbonio dimostrano un livello di rumore stabile per molti mesi. La deviazione standard del livello di rumore (traccia meno attività di spiking) in B non mostra alcun cambiamento progressivo del rumore. Le barre rappresentano la contaminazione media. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. (F) Disegno in scala di un topo con cfea impiantato cronicamente e headstage. (G) Traccia di tensione grezza (superiore) 11 mesi dopo l'impianto mostra una robusta LFP. La traccia di tensione passa-banda (in basso) mostra un'attività neurale costante. (H) Forma d'onda spike media del neurone registrata sulla fibra da C, sottolineata dalle prime 1.000 incidenze di attività di spiking. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Registrazioni CFEA (Carbon fiber microelectrode array) dalla corteccia visiva primaria del furetto. (A) Forme d'onda di singole unità ordinate a picco registrate da un CFEA a 16 canali. I potenziali d'azione dei singoli neuroni erano spesso evidenti su più canali con ampiezze leggermente diverse. (B) Curve di sintonizzazione della direzione da neuroni selezionati. I colori corrispondono alle unità registrate in A. Le frecce indicano la direzione del movimento dello stimolo. Le barre di scala indicano il tasso di risposta. Le barre di errore indicano la risposta media con errore standard. La linea tratteggiata orizzontale rappresenta la velocità di sparo spontanea della stessa cella durante l'esposizione a uno schermo vuoto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo descrive ogni fase necessaria per la costruzione di un CFEA funzionale sia per uso acuto che cronico. Il processo descritto è personalizzabile in base alle esigenze del ricercatore, rendendolo un'opzione accessibile e poco costosa per il monitoraggio di singoli neuroni per mesi. Il protocollo dimostra la fattibilità di registrare sia una robusta attività di una singola unità entro pochi minuti dall'impianto in un animale anestetizzato, sia per quattro mesi in un animale sveglio e che si comporta, illustrando il potenziale di questi CFEA per studiare i cambiamenti a breve e lungo termine nelle risposte neurali.

I passaggi del protocollo descritto sono stati accuratamente testati e migliorati nel tempo per produrre una procedura efficiente che può essere completata rapidamente, a basso costo marginale (< $ 100,00), con la capacità di registrare singole unità inequivocabili, densamente e stabilmente per mesi. Le fasi di costruzione possono essere completate in meno di un giorno e produrranno segnali elettrofisiologici paragonabili a qualsiasi array commerciale leader. I CFEA hanno anche un ingombro molto più piccolo (il fascio di fibre a 16 canali ha un diametro di ~ 26 μm) rispetto a array commerciali simili e la loro biocompatibilità li rende adatti per l'uso a lungo termine¹³. È importante sottolineare che ci sono diversi passaggi critici e istruzioni che devono essere seguiti per produrre un CFEA funzionante con prestazioni comparabili.

A causa della fragilità delle fibre di carbonio, devono essere maneggiate con la massima cura. Maneggiarli con pinze affilate o altri strumenti può causare la rottura delle fibre. Inoltre, è importante costruire i CFEA in uno spazio con un movimento d'aria limitato in modo che le fibre non soffino via. Quando si infiamma la parte posteriore delle fibre, l'accendino deve solo essere spostato in un movimento avanti e indietro molto brevemente, per circa 1 s. I passaggi successivi a questa rimozione dell'isolamento sono cruciali per la costruzione di un elettrodo con canali di lavoro. Le punte fiammate devono essere alimentate nella maschera senza alcun contatto aggiuntivo. Quindi, quando si riempie il bacino con cemento dentale, è importante che il cemento venga applicato con cura e riempia completamente i canali e il bacino dell'imbuto, chiudendo le aperture senza riempirle. Il cemento dentale deve quindi essere completamente polimerizzato con luce UV prima di procedere. Una volta completato, la vernice argentata deve essere iniettata in ciascun canale fino a completo riempimento ma senza fuoriuscire. Questo è il passaggio più variabile del processo. Qualsiasi riempimento eccessivo può produrre diafonia tra i canali e un riempimento insufficiente può causare un errore di connessione. Se non è possibile iniettare vernice argentata utilizzando un ago da 25 G, è probabile che la soluzione sia troppo viscosa e, in questo caso, è possibile aggiungere una piccola quantità di diluente per creare una soluzione più fluida. Una volta riempiti tutti i canali e inserito il connettore headstage, è importante consentire all'array di polimerizzare per 24 ore prima di fissare il connettore con cemento dentale. Abbiamo scoperto che in caso contrario si riduceva il numero di canali collegati. Anche l'applicazione di una generosa quantità di cemento dentale è importante in modo che il connettore non si disconnetta quando si interfaccia con il sistema di acquisizione del segnale. Se si staccano, è possibile tentare la riconnessione con il riempimento ripetuto dei canali con vernice argentata, ma l'utente dovrebbe testare i valori di impedenza del CFEA per valutare il numero di canali collegati. Permettere al cemento dentale di polimerizzare durante la notte serve anche a prevenire un potenziale distacco.

La misurazione dell'impedenza dell'elettrodo fornirà una stima accurata dei canali collegati. Questo può essere fatto dopo aver immerso il terreno e i fili di riferimento e le punte in fibra di carbonio in PBS. Abbiamo osservato che un'alta impedenza (>15 MΩ) è indicativa di un canale aperto e non connesso. Prima di iniettare corrente e galvanica, un canale collegato può avere un intervallo di valori di impedenza che dovrebbero diminuire significativamente con questo processo. Il numero medio di canali collegati (impedenza < 4 MΩ dopo iniezione di corrente) per elettrodo a 16 canali era di 12,96 ± 2,74 (media ± SD; N = 48 elettrodi). Sono stati testati diversi tempi di galvanica e 30 s hanno prodotto un isolamento del segnale superiore tra i siti di registrazione (Figura 5). Mentre è stato ben stabilito che PEDOT-pTS^{12 , 24,25,26}e PEDOT-TFB²¹ forniscono opzioni affidabili per la preparazione di siti di registrazione in fibra di carbonio, abbiamo scoperto che la placcatura con oro, un metodo collaudato e affidabile per elettrodi galvanici per l'impianto cronico^27,28 , ha aumentato la facilità di impianto e ha impedito alle punte degli elettrodi di aggregarsi insieme. Producendo valori di impedenza finale inferiori a 0,2 MΩ in media, questo metodo risulta paragonabile ai valori ottenuti utilizzando PEDOT-TFB²¹ e PEDOT-pTS²⁶.

Quando si impianta l'array di microelettrodi, è importante seguire visivamente l'inserimento delle punte in fibra di carbonio al microscopio. Il successo dell'inserimento dovrebbe essere evidente, senza flessione delle fibre. Se le fibre sembrano cedere, è improbabile che entrino con successo nel cervello. In questo caso, l'angolo della sonda deve essere regolato per un secondo tentativo. Questo processo può continuare fino a quando l'inserimento della sonda non ha esito positivo. Una volta che l'elettrodo è alla profondità desiderata, abbiamo scoperto che aspettare almeno 30 minuti permetterà alla sonda di accontentarsi di un'acquisizione ottimale del segnale (registrazioni acute).

I CFEA descritti, oltre al loro ingombro ridotto e alla biocompatibilità, offrono un'alternativa robusta e personalizzabile agli array commerciali grazie alla loro facilità di costruzione e al basso costo. La più grande limitazione ai CFEA dettagliati in questo protocollo è la loro scalabilità. A causa della natura manuale della loro costruzione, scalare fino a progetti con centinaia di siti di registrazione potrebbe non essere pratico. Inoltre, i progressi nella fabbricazione di array di microelettrodi utilizzando la nanotecnologia consentiranno registrazioni della popolazione su larga scala rispetto ai metodi descritti qui. Tuttavia, questo protocollo offre l'accessibilità CFEA ai laboratori interessati alla fabbricazione da banco di elettrodi in fibra di carbonio. Non abbiamo osservato alcuna perdita di stabilità o diminuzione della robustezza dell'ampiezza del picco per tutta la durata degli esperimenti cronici di 120 giorni, come indicato da un singolo canale rappresentativo tipico delle nostre osservazioni su quella scala temporale (Figura 6A-E). Inoltre, i CFEA mostrano la capacità di attività persistente di una singola unità, poiché quattro singole unità sono rimaste distinguibili 11 mesi dopo l'impianto nel topo (Figura 6G,H). È anche possibile ottenere registrazioni stabili a singola unità in modo acuto (Figura 7), che offre un vantaggio rispetto a molti altri elettrodi commerciali per lo studio di singoli neuroni in brevi periodi di tempo. In futuro, lo sviluppo di tali sonde flessibili e biocompatibili con diametri minimi consentirà lo studio di processi complessi. Questi strumenti forniranno una notevole utilità nel progresso della tecnologia neurale, comprese le applicazioni nelle interfacce cervello-macchina (BMI), che richiedono una stabilità continua e a lungo termine²⁹.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
#10 lama per bisturi	Fisher Scientific	14-840-15	Strumento
di costruzione 16 canali CFEA Jig	Realize Inc.		Componente CFMA
Connettore Omnetics a 16 canali	Omnetics	A79014-001	Componente CFMA
Ago da 25 G	Fisher Scientific	14-840-84	Strumento da costruzione -
ago da 30 G	Fisher Scientific	14-841-03	Strumento da costruzione
Tubo tondo ipodermico in acciaio inox 304 da 31 G Small	Parts Inc	B000FMYN38	Per tubo guida
Maschera CFEA 32 canali	Realize Inc.		Componente CFMA
Connettore Omnetics a 32 canali	Omnetics	A79022-001	Componente CFMA
6 in applicatori di punte in cotone	Fisher Scientific	22-363-156	Strumento di costruzione
Acetone	Fisher Scientific	A16P4	Strumento di
costruzione Software di stampa 3D AutoCad	Strumento	progettazione assistita da computer Autodesk
Autodesk Fusion 360	Autodesk		Strumento di progettazione assistita da computer / software di modellazione 3D
Siringhe monouso BD	Fisher Scientific	14-823-30	1 mL
Fibre di carbonio	Good Fellow USA	C 005725	7 μ m Cassette
			Per il rivestimento di fibre
Nastro trasparente	Scotch		Per il rivestimento di fibre grezze Acqua
		deionizzata	Componente galvanico
Nastro biadesivo	Scotch		Per il rivestimento di fibre grezze
Composito dentale fluido	Pentron	Flow-It ALC	CFMA componente/ UV cemento dentale polimerizzato
Soluzione di placcatura in oro	Sifco ASC	5355	10,0-20,0% glicerolo, 1,0-5,0% etilendiammina, 1,0-5,0% acido acetico (etilendinitrilo)tetra-, sale dipotassico, 5,0-10,0% acido butanoico, sale sodico mercapto-monogold(1+), 1,0– 5,0% metabisolfito di potassio, 55,0-82,0% acqua
Morsetto per gioielli	Amazon	B00GRABH9K	Strumento di costruzione
JRClust			Software di smistamento delle punte di furetto
Accendino	BIC	LCP62DC	Strumento di costruzione
Micromanipolatore	Scientifica	PS-7000C	Per tubo guida
Microforbici	Fisher Scientific	08-953-1B	Strumento di costruzione
di smistamento dei picchi	MountainSort
Adattatore NanoZ a 16 canali	Sistemi multicanale	ADPT-nanoZ-NN-16	Componente galvanico
Adattatore NanoZ a 32 canali	Sostanza bianca	NZA-OMN-32 rev A	Componente galvanico Tester di
impedenza multi-elettrodo NanoZ	Componente
Parafilm	Fisher Stockroom	13-374-10	Film semitrasparente e flessibile con proprietà adesive
Sistemi di rivestimento speciali	in parylene 'C' Dimer	980130-C-01LBE	Per il rivestimento di fibre grezze
PEG 8000	Fisher Scientific	25322-68-3	Componente galvanico
Soluzione salina			Componente
galvanicoTubo in poliimmide	MicroLumen	BRAUNI001	Per tubo guida
Utensile rotante	Dremel	300124	Per tubo guida
Manico bisturi	Strumenti di scienza	fine 10003-12	Strumento di costruzione
Rivestimento conduttivo d'argento	MG Chemicals	842AR Super Shield	Componente CFMA
Stereomicroscopio con portata 6,7:1	Motic	SMZ-168	Edificio strumento
Post-it			Strumento da costruzione
Salviette per tessuti	Kimtech Science	34155	Strumento da costruzione
Filo di tungsteno	A-M Systems	797550
Bacchetta per polimerizzazione UV	CFMA Picchio		Strumento da costruzione
Camera di deposizione sottovuoto	Sistemi di rivestimento		Labcoter 2 (PDS 2010)