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Articolo metodologico

Una finestra permanente per indagare sulle metastasi del cancro al polmone

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DOI:

10.3791/62761

⸱

1 luglio 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Integrated Imaging Program, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Cente, 5Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per l'impianto chirurgico di una finestra ottica permanentemente a dimora per il torace murino, che consente l'imaging intravitale ad alta risoluzione del polmone. La permanenza della finestra la rende adatta allo studio dei processi cellulari dinamici nel polmone, in particolare quelli che si stanno lentamente evolvendo, come la progressione metastatica delle cellule tumorali disseminate.

Abstract

Le metastasi, che rappresentano circa il 90% della mortalità correlata al cancro, comportano la diffusione sistemica delle cellule tumorali dai tumori primari ai siti secondari come l'osso, il cervello e il polmone. Sebbene ampiamente studiati, i dettagli meccanicistici di questo processo rimangono poco compresi. Mentre le modalità di imaging comuni, tra cui la tomografia computerizzata (TC), la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la risonanza magnetica (MRI), offrono vari gradi di visualizzazione grossolana, ognuna manca della risoluzione temporale e spaziale necessaria per rilevare la dinamica delle singole cellule tumorali. Per risolvere questo problema, sono state descritte numerose tecniche per l'imaging intravitale di siti metastatici comuni. Di questi siti, il polmone si è dimostrato particolarmente difficile da accedere per l'imaging intravitale a causa della sua delicatezza e del suo ruolo critico nel sostenere la vita. Sebbene in precedenza siano stati descritti diversi approcci per l'imaging intravitale a singola cellula del polmone intatto, tutti comportano procedure altamente invasive e terminali, limitando la durata massima possibile dell'imaging a 6-12 ore. Qui è descritta una tecnica migliorata per l'impianto permanente di una finestra ottica toracica minimamente invasiva per l'imaging ad alta risoluzione del polmone (WHRIL). In combinazione con un approccio adattato alla microcartografia, l'innovativa finestra ottica facilita l'imaging intravitale seriale del polmone intatto a risoluzione a singola cellula in più sessioni di imaging e per più settimane. Data la durata senza precedenti del tempo in cui i dati di imaging possono essere raccolti, il WHRIL può facilitare la scoperta accelerata dei meccanismi dinamici alla base della progressione metastatica e di numerosi processi biologici aggiuntivi all'interno del polmone.

Introduzione

Responsabile di circa il 90% dei decessi, la metasta è la principale causa di mortalità correlata al cancro1. Tra i principali siti di metastasi clinicamente osservate (ossa, fegato, polmone, cervello)2, il polmone si è dimostrato particolarmente impegnativo per l'imaging in vivo tramite microscopia intravitale. Questo perché il polmone è un organo delicato in moto perpetuo. Il movimento continuo dei polmoni, ulteriormente aggravato dal movimento cardiaco intratoracico, rappresenta una barriera sostanziale per l'imaging accurato. Pertanto, a causa della sua relativa inaccessibilità alle modalità per l'imaging ottico intravitale ad alta risoluzione, la crescita del cancro all'interno del polmone è stata spesso considerata un processo occulto3.

In ambito clinico, le tecnologie di imaging come la tomografia computerizzata (TC), la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la risonanza magnetica (MRI) consentono la visualizzazione in profondità all'interno di organi vitali intatti come il polmone4. Tuttavia, mentre queste modalità forniscono eccellenti viste dell'organo grossolano (spesso anche rivelando la patologia prima dell'insorgenza dei sintomi clinici), sono di risoluzione inadeguata per rilevare le singole cellule tumorali disseminate mentre avanzano attraverso le prime fasi delle metastasi. Di conseguenza, nel momento in cui le modalità di cui sopra forniscono qualsiasi indicazione di metastasi al polmone, i focolai metastatici sono già ben consolidati e proliferanti. Poiché il microambiente tumorale svolge un ruolo fondamentale nella progressione del cancro e nella formazione di metastasi5,6,c'è un grande interesse nello studio dei primi passi della semina metastatica in vivo. Questo interesse è ulteriormente alimentato dal maggiore apprezzamento che le cellule tumorali si diffondono anche prima che il tumore primario venga rilevato7,8 e dalla crescente evidenza che sopravvivono come singole cellule e in uno stato dormiente per anni o decenni prima di crescere in macro-metastasi9.

In precedenza, l'imaging del polmone a risoluzione monocellulare ha necessariamente coinvolto preparati ex vivo o di espianto10,11,12,13,limitando le analisi a singoli punti temporali. Mentre questi preparati forniscono informazioni utili, non forniscono alcuna visione della dinamica delle cellule tumorali all'interno dell'organo collegato a un sistema circolatorio intatto.

I recenti progressi tecnologici nell'imaging hanno permesso la visualizzazione intravitale del polmone intatto a risoluzione unicellulare per periodi fino a 12 h14,15,16. Ciò è stato realizzato in un modello murino utilizzando un protocollo che prevedeva la ventilazione meccanica, la resezione della gabbia toracica e l'immobilizzazione polmonare assistita dal vuoto. Tuttavia, nonostante offra le prime immagini a risoluzione cellulare singola del polmone fisiologicamente intatto, la tecnica è altamente invasiva e terminale, precludendo così ulteriori sessioni di imaging oltre la procedura di indice. Questa limitazione, quindi, impedisce la sua applicazione allo studio di passaggi metastatici che richiedono più di 12 ore, come la dormienza e il riavvio dellacrescita 14,15,16. Inoltre, i modelli di comportamento cellulare osservati utilizzando questo approccio di imaging devono essere interpretati con cautela, dato che i differenziali di pressione indotti dal vuoto possono causare deviazioni nel flusso sanguigno.

Per superare queste limitazioni, è stata recentemente sviluppata una finestra minimamente invasiva per l'imaging ad alta risoluzione del polmone (WHRIL), che facilita l'imaging seriale per un periodo prolungato di giorni o settimane, senza la necessità di ventilazione meccanica17. La tecnica prevede la creazione di una 'gabbia toracica trasparente' con una cavità toracica sigillata per il mantenimento della normale funzione polmonare. La procedura è ben tollerata, consentendo al mouse di recuperare senza alterazioni significative dell'attività e della funzione di base. Per localizzare in modo affidabile esattamente la stessa regione polmonare in ogni rispettiva sessione di imaging, a questa finestra18è stata applicata una tecnica nota come microcartografia. Attraverso questa finestra, è stato possibile catturare immagini di cellule mentre arrivano al letto vascolare del polmone, attraversano l'endotelio, subiscono la divisione cellulare e crescono in micro-metastasi.

Qui, lo studio presenta una descrizione dettagliata di un protocollo chirurgico migliorato per l'impianto del WHRIL, che semplifica l'intervento chirurgico aumentando contemporaneamente la sua riproducibilità e qualità. Mentre questo protocollo è stato progettato per consentire lo studio dei processi dinamici alla base delle metastasi, la tecnica può essere applicata alternativamente alle indagini di numerosi processi di biologia e patologia polmonare.

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Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti per l'uso di animali vertebrati, compresa l'approvazione preventiva da parte dell'Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Passivazione delle finestre

  1. Risciacquare i telai delle finestre ottiche (Figura supplementare 2) con una soluzione all'1% (p/v) di detergente enzimaticamente attivo.
  2. All'interno di un barattolo di vetro, immergere gli infissi ottici in soluzione di idrossido di sodio al 5% (p/v) per 30 minuti a 70 °C.
  3. Rimuovere e lavare i telai delle finestre con acqua deionizzata.
  4. All'interno di un nuovo barattolo di vetro, immergere i telai delle finestre ottiche in soluzione di acido citrico al 7% (p/v) per 10 minuti a 55 °C.
  5. Ancora una volta, rimuovere e lavare i telai delle finestre con acqua deionizzata.
  6. Ripetere il passaggio 1.2; quindi, rimuovere e lavare i telai delle finestre con acqua deionizzata.

2. Preparazione per la chirurgia

  1. Condurre l'intervento chirurgico in un cappuccio o in un armadio a flusso laminare. Per evitare la contaminazione del campo operatorio, garantire aree distinte e separate rispettivamente per la preparazione, l'intervento chirurgico e il recupero.
  2. Prima dell'intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave. Se sono previste procedure successive, risterilizzare gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore a caldo. Per questa procedura chirurgica, viene utilizzata una tecnica di soli suggerimenti.
  3. Accendere lo sterilizzatore chirurgico riscaldato per perline e perline.
  4. Anestetizzare il mouse con il 5% di isoflurano nella camera di anestesia.
  5. Per rimuovere i peli, applicare generosamente la crema depilatoria sul sito di incisione toracica in alto a sinistra. Dopo non più di 20 s, asciugare saldamente i capelli e la crema depilatoria usando carta velina inumidita. Ripetere se necessario per rimuovere tutti i capelli dal sito chirurgico.
  6. Usando la sutura di seta 2-0, legare un nodo alla base di un catetere da 22 G, lasciando code lunghe 2 pollici (vedi Figura 1A).

3. Chirurgia della finestra polmonare

  1. Lavarsi le mani con sapone antisettico.
  2. Prima di ogni nuovo intervento chirurgico, indossare nuovi guanti sterili.
  3. Per prevenire l'essiccazione corneale e danni agli occhi del topo, applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi.
  4. Diluire 10 μL (0,1 mg/kg) di buprenorfina in 90 μL di PBS sterile e quindi iniettare per via sottocutanea per garantire l'analgesia preoperatoria.
  5. Intubare il topo con il catetere 22 G legato alla sutura di seta15. Utilizzando un bulbo di gonfiaggio, confermare il successo dell'intubazione notando l'aumento bilaterale del torace alla compressione del bulbo.
  6. Fissare il catetere di intubazione legando la sutura di seta 2-0 attorno al muso del topo (vedere Figura 1B).
  7. Posizionare il mouse sul supporto chirurgico riscaldato e posizionarlo nel decubito laterale destro per esporre il torace sinistro.
  8. Collegare il ventilatore al catetere di intubazione.
  9. Garantire una ventilazione controllata e stabile sul ventilatore e quindi abbassare l'isofluorano al 3%. All'inizio della procedura e periodicamente per tutta la durata della procedura, valutare l'adeguatezza dell'anestesia eseguendo un test del pizzico della punta.
  10. Usando nastro di carta, fissare cranicamente e caudally gli arti anteriori e posteriori, rispettivamente, alla fase chirurgica riscaldata. Posizionare un altro pezzo di nastro lungo la lunghezza della schiena del mouse per massimizzare l'esposizione al campo chirurgico (vedere Figura 1C).
  11. Aprire tutti gli strumenti chirurgici sotto il cofano per la conservazione della sterilità.
  12. Sterilizzare il sito chirurgico con una generosa applicazione di antisettico sulla pelle del topo.
  13. Usando la pinza, sollevare la pelle e fare un'incisione circolare di ~ 10 mm, ~ 7 mm a sinistra dello sterno e ~ 7 mm superiore al margine subcostale (Figura 1D).
  14. Identificare attentamente eventuali navi principali. Se è necessaria la divisione dei vasi, cauterizzare ad entrambe le estremità con la penna elettrocauterizzata per mantenere l'emostasi.
  15. Asportare i tessuti molli sovrastanti le costole.
  16. Elevare la6a o la7a costola usando una pinza. Utilizzando una singola lama delle forbici smussate micro-dissezionanti, il lato arrotondato verso il polmone, perforare con cura il muscolo intercostale tra la6a e la7a costola per entrare nello spazio intratoracico (Figura 1E).
  17. Scaricare delicatamente il contenitore di aria compressa al difetto per far collassare il polmone e separarlo dalla parete toracica. Sparare l'aria compressa in brevi raffiche per prevenire lesioni polmonari iatrogene.
  18. Posizionare il punzone della biopsia sull'utensile da taglio (Figura supplementare 1) e manovrare attentamente la base dell'utensile da taglio attraverso l'incisione intercostale (Figura 1F).
  19. Orientare la base dell'utensile da taglio in modo che sia parallela alla parete toracica. Forare un foro circolare di 5 mm attraverso la gabbia toracica (Figura 1G).
    NOTA: Assicurarsi che il tessuto polmonare esposto sia rosa, senza segni di danno.
  20. Utilizzando la sutura di seta 5-0, creare un punto a corda di borsa ~ 1 mm dal foro, circonferenzialmente, intrecciandosi con le costole (Figura 1H).
  21. Posizionare il telaio della finestra in modo che i bordi del difetto circolare si allineino all'interno della scanalatura della finestra (vedere figura 1I).
  22. Bloccare saldamente la finestra impiantata legando saldamente la sutura di seta 5-0.
  23. Caricare 100 μL di adesivo gel cianoacrilato nella siringa da 1 mL.
  24. Asciugare il polmone applicando un flusso costante e delicato di aria compressa per ~ 10-20 s (Figura 1J).
  25. Utilizzando una pinza per afferrare il telaio della finestra dal suo bordo esterno, sollevare delicatamente per garantire la separazione del polmone dal sottosuolo del telaio della finestra.
  26. Erogare un sottile strato di adesivo cianoacrilato lungo il sottosuolo del telaio ottico della finestra (Figura 1K).
  27. Aumentare la pressione positiva di fine espirazione (PEEP) sul ventilatore per gonfiare il polmone.
  28. Tenendo premuto per 10-20 s, applicare una pressione delicata ma decisa per fissare il telaio della finestra ottica sul tessuto polmonare (Figura 1L).
  29. Erogare una goccia di 5 mm dell'adesivo gel cianoacrilato rimanente su una slitta rettangolare.
  30. Raccogli il coperchio da 5 mm usando pickup a vuoto. Immergere il sottosuolo del coverslip nell'adesivo, quindi raschiare via l'adesivo in eccesso tre volte contro il lato del coverslip rettangolare, in modo tale che rimanga solo uno strato molto sottile (Figura 1M).
  31. Posizionare con attenzione il coperchio per adattarlo all'interno della rientranza al centro del telaio della finestra ottica e viene tenuto sopra il tessuto polmonare ad angolo. Bloccare brevemente il ventilatore per generare una pressione positiva, ipergonfiando il polmone. Utilizzando un movimento rotatorio, orientare il coverslip parallelamente al tessuto polmonare per creare un'apposizione diretta tra la superficie del polmone e il sottosuolo del coverslip. Mantenere una pressione delicata, consentendo all'adesivo cianoacrilato di fissarsi (~ 25 s).
  32. Utilizzare la pinza per separare il coverslip dai pickup sottovuoto (Figura 1N).
  33. Usando la sutura di seta 5-0, crea di nuovo un punto a corda di borsa, questa volta <1 mm circonferenzialmente dal bordo tagliente dell'incisione cutanea. Infilare la pelle in eccesso sotto il bordo esterno del telaio della finestra prima di legarlo saldamente con nodi di bloccaggio.
  34. Per garantire una tenuta ermetica tra il coperchio e il telaio della finestra, erogare una piccola quantità di cianoacrilato liquido all'interfaccia metallo-vetro (vedere figura 1O).
  35. Attaccare un ago sterile a una siringa da insulina da 1 mL. Inserire l'ago sotto il processo xifoideo, avanzando verso la spalla sinistra, entrando nella cavità toracica attraverso il diaframma. Aspirare delicatamente sulla siringa per rimuovere l'aria residua dalla cavità toracica (vedere Figura 1P).
  36. Rimuovere il nastro dal mouse.
  37. Disattivare l'isoflurano.
  38. Continuare la ventilazione con ossigeno al 100% fino a quando il mouse appare pronto a svegliarsi.
  39. Tagliare con cura la sutura di seta 2-0 attorno al muso del topo ed estubare il mouse.
  40. Trasferire il mouse in una gabbia pulita e monitorarlo fino a completo recupero. Eutanasia del topo se sono presenti segni di difficoltà respiratorie.
  41. Fornire analgesia postoperatoria iniettando per via sottocutanea 10 μL (0,1 mg/kg) di buprenorfina diluita in 90 μL di soluzione tamponata con fosfato sterile (PBS).

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Risultati

Le fasi della procedura chirurgica descritte in questo protocollo sono riassunte e illustrate nella Figura 1. In breve, prima dell'intervento chirurgico, i topi vengono anestetizzati e i peli sul torace sinistro vengono rimossi. I topi sono intubati e ventilati meccanicamente per consentire la sopravvivenza in caso di violazione della cavità toracica. I tessuti molli sovrastanti le costole vengono asportati e viene creato un piccolo difetto circolare, che copre le costole6 ° e

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Discussione

Nei siti di metastasi a distanza come il polmone, l'imaging ottico ad alta risoluzione fornisce informazioni sulle elaborate dinamiche delle metastasi delle cellule tumorali. Consentendo la visualizzazione in vivo di singole cellule tumorali e delle loro interazioni con il tessuto ospite, l'imaging intravitale ad alta risoluzione si è dimostrato strumentale alla comprensione dei meccanismi alla base delle metastasi.

Qui è descritto un protocollo chirurgico migliorato per l'impianto to...

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Dichiarazioni

Gli autori non rivelano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561 di Montefiore, METAvivor Early Career Award, Gruss-Lipper Biophotonics Center e il suo Integrated Imaging Program, e Jane A. e Myles P. Dempsey. Vorremmo ringraziare l'Analytical Imaging Facility (AIF) presso l'Einstein College of Medicine per il supporto di imaging.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione all'1% (p/v) di detergente enzimaticoattivo Alconox IncN/A  detergente anionico concentrato con enzima proteasi per pulizia manuale e ad ultrasuoni
2 & micro; m microsfere fluorescentiInvitrogenF8827
5 mm vetrino coprioggettiMicroscopia elettronica Scienze72296-05
5% (p/v) soluzione di idrossido di sodioSigma-AldrichS8045
5% IsofluranoHenry Schein, Inc29405
5-0 seta intrecciata con ago da taglio RB-1Ethicon, Inc.774B
Soluzione al 7% (p/v) di acido citricoSigma-Aldrich251275
telaio della finestra in acciaio inox da 8 mmN/AN/ASu misura, Supplementare Figura 2
9 cm 2-0 cravatta di setaEthicon, Inc.LA55G
Punzone per biopsia monouso da 5 mmIntegra 33-35-SH
Forbici per micro-dissezione smussateRobozRS-5980
Portautensili per finestre in ottoneN/AN/ASu misura, Figura supplementare Figura 3
BuprenorfinaHospira0409-2012-32
Penna per cauzioneBraintree ScientificGEM 5917
Clorexidina gluconato  Becton, Dickinson and Company260100ChloraPrep Tampone singolo 1,75 mL
Bomboletta di aria compressaFalconDPSJB-12
Adesivo cianoacrilatoHenkel AdesiviLOC1363589
Illuminatore a fibre otticheO.C. White CompanyFL3000
Sterilizzatore di perlineCellPoint ScientificGER  5287-120VGerminatore 500
Pinze GraefeRobozRS-5135
Lampada termica a infrarossiBraintree ScientificHL-1
Siringhe da insulinaBecton Dickinson329424
Vaporizzatore di isofluranoSurgiVetVCT302
Porta aghi Jacobson con bloccoKalson SurgicalT1-140
Applicatori con punta lunga in cotoneMedline IndustriesMDS202055
NairChurch & Dwight Co., Inc.
Neomicina/polimixina B/bacitracinaJohnson & Johnson501373005Unguento antibiotico
Unguento oftalmicoDechra Veterinary Products17033-211-38
Nastro di cartaFisherScientific S68702
Ventilatore murinoKent ScientificPS-02PhysioSuite
Copertura rettangolare in vetroCorning2980-225
Supporto per intubazione per roditoriBraintree Scientific RIS100
Bulbo per l'inflazione polmonare di piccoli animaliApparecchio Harvard72-9083
Utensile da taglio in acciaio inossidabileN/AN/ASu misura, Supplementare Figura 1
Sulfametossazolo e Trimetoprim antibiotico oraleHi-Tech Pharmacal Co.50383-823-16
Piattaforma chirurgica multifunzionale SurgiSuite per topi, con riscaldamentoKent ScientificSURGI-M02Piattaforma chirurgica riscaldata
Catetere trachealeExelint International26746Catetere da 22 G
Sistema di prelievo a vuoto sonda metallicaTed Pella, Inc.528-112
40002957

Riferimenti

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