La modifica dell'array multielettrodo esistente o delle apparecchiature patch clamp rende l'elettroretinogramma ex vivo più ampiamente accessibile. Metodi migliorati per registrare e mantenere le risposte alla luce ex vivo facilitano lo studio della funzione dei fotorecettori e delle cellule bipolari ON nella retina sana, nei modelli animali di malattie degli occhi e nelle retine dei donatori umani.
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Articolo metodologico
Ottimizzazione della configurazione e delle condizioni per l'elettroretinogramma ex vivo per studiare la funzione della retina in occhi piccoli e grandi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le misurazioni delle risposte alla luce neuronale retinica sono fondamentali per studiare la fisiologia della retina sana, determinare i cambiamenti patologici nelle malattie retiniche e testare gli interventi terapeutici. L'elettroretinogramma ex vivo (ERG) consente la quantificazione dei contributi dei singoli tipi cellulari nella retina isolata mediante aggiunta di agenti farmacologici specifici e la valutazione dei cambiamenti intrinseci tissutali indipendentemente dalle influenze sistemiche. Le risposte alla luce retinica possono essere misurate utilizzando un supporto per campioni ERG ex vivo specializzato e una configurazione di registrazione, modificata da patch clamp o apparecchiature array di microelettrodi esistenti. In particolare, lo studio delle cellule ON-bipolari, ma anche dei fotorecettori, è stato ostacolato dal lento ma progressivo declino delle risposte luminose nell'ERG ex vivo nel tempo. L'aumento della velocità di perfusione e la regolazione della temperatura del perfufato migliorano la funzione retinica ex vivo e massimizzano l'ampiezza e la stabilità della risposta. L'ERG ex vivo consente unicamente lo studio dei singoli tipi di cellule neuronali retiniche. Inoltre, i miglioramenti per massimizzare le ampiezze e la stabilità della risposta consentono lo studio delle risposte alla luce in campioni di retina di animali di grandi dimensioni, nonché negli occhi di donatori umani, rendendo l'ERG ex vivo una preziosa aggiunta al repertorio di tecniche utilizzate per studiare la funzione retinica.
Introduzione
L'elettroretinografia misura la funzione retinica in risposta alla luce1. È parte integrante dello studio della fisiologia e della fisiopatologia della retina e della misurazione del successo delle terapie per le malattie della retina. L'ERG in vivo è ampiamente utilizzato per valutare la funzione retinica in organismi intatti, ma presenta limitazioni significative 2,3. Tra questi, l'analisi quantitativa dei singoli tipi di cellule retiniche nell'ERG in vivo è ostacolata, poiché registra la somma dei potenziali cambiamenti, e quindi delle risposte sovrapposte, da tutte....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per gli studi sugli animali dell'Università dello Utah. Gli occhi di maiale per la dimostrazione di questo video sono stati ottenuti postmortem dal macello (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Gli occhi sono stati ottenuti da donatori umani dopo la morte cerebrale o cardiaca con il consenso per l'uso nella ricerca attraverso la Utah Lions Eye Bank, la San Diego Eye Bank o Lifesharing, che sono pienamente accreditati dalla FDA, dall'Association of Organ Procurement Organizations (AOP....
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Risultati
Ex vivo ERG consente la registrazione di risposte fotorecettoriali e cellule bipolari riproducibili e stabili, ad esempio, dalla retina del topo (Figura 2A-C). La registrazione delle risposte dei fotorecettori dalle retine dei donatori umani è possibile con un ritardo postmortem fino a 5 ore dell'enucleazione (Figura 2D) e delle risposte delle cellule bipolari ON con un ritardo di enucleazione di <20 minuti (
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Discussione
Originariamente sviluppato nel 1865 da Holmgren per misurare le risposte alla luce retinica dalla retina anfibia10, i vincoli tecnici inizialmente impedirono all'ERG di essere ampiamente utilizzato. Tuttavia, studi seminali di Ragnar Granit e altri hanno identificato le origini cellulari dell'ERG e misurato le risposte dei fotorecettori e delle cellule bipolari ON ex vivo11,12,13. Da allora, meto.......
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Dichiarazioni
Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Eye Institute EY02665 e EY031706 e dall'International Retinal Research Foundation al Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800) e da una sovvenzione illimitata dalla ricerca per prevenire la cecità, New York, NY, al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive, Università dello Utah. Il Dr. Frans Vinberg ha anche ricevuto un Research to Prevent Blindness/Dr. H. James and Carole Free Career Development Award, e il Dr. Silke Becker di una sovvenzione ARVO EyeFind. Ringraziamo la dottoressa Anne Hanneken dello Scripps Research Institute per aver fornito l'occhio donatore utilizzato per ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Presa da 2 mm | WPI | 2026-10 | materiali per preparare l'elettrodo |
| Ag/AgCl Elettrodo | World Precision Instruments | EP1 | materiali per preparare l'elettrodo |
| Mezzo di perfusione | Sigma Aldrich | A1420 | Cloruro |
| bario | Sigma Aldrich | B0750 | bloccante dei canali del potassio |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | antagonista glutammatergico ad ampio spettro |
| Adattatore ERG OcuScience Ex Vivo OcuScience | n/a | portacampioni ERG ex vivo | |
| Connettore luer filettato | McMaster-Carr | 51525K222 o 51525K223 | materiali per preparare l'elettrodo |
Riferimenti
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 ....
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Ristampe e permessi
