Summary
O objetivo geral deste procedimento é descrever um método de autoadministração de medicamentos que podem ser usados em modelos de camundongos de alimentação e obesidade.
Abstract
Estudos pré-clínicos em camundongos muitas vezes dependem de protocolos invasivos, como injeções ou gavage oral, para fornecer medicamentos. Essas rotas estressantes de administração têm efeitos significativos em parâmetros metabólicos importantes, incluindo ingestão de alimentos e peso corporal. Embora uma opção atraente para contornar isso seja compor a droga em alimentos de roedores ou dissolvê-la na água, essas abordagens também têm limitações, pois são afetadas pela estabilidade da droga à temperatura ambiente por longos períodos de tempo, a solubilidade da droga na água, e que a dosagem é altamente dependente do tempo de consumo alimentar ou de água. A disponibilidade constante da droga também limita a relevância translacional sobre como os medicamentos são administrados aos pacientes. Para superar essas limitações, as drogas podem ser misturadas com alimentos altamente palatáveis, como a manteiga de amendoim, permitindo que os ratos auto-administrem compostos. Os camundongos consomem de forma confiável e reprodutiva a droga/pelota de manteiga de amendoim em um curto espaço de tempo. Essa abordagem facilita uma abordagem de entrega com estresse mínimo comparado com uma injeção ou gavage. Este protocolo demonstra a abordagem da preparação de medicamentos, aclimatação animal ao parto de placebo e entrega de medicamentos. As implicações dessa abordagem são discutidas em estudos relacionados ao tempo da administração de drogas e ao ritmo circadiano.
Introduction
O objetivo deste método é entregar drogas em camundongos através de um procedimento não invasivo e minimamente estressante. Estudos pré-clínicos em camundongos muitas vezes dependem de rotas estressantes e invasivas da administração de medicamentos que podem ter impactos significativos nos parâmetros metabólicos. Por exemplo, o gavage oral diário repetitivo pode diminuir significativamente a ingestão calórica e o ganho de peso em camundongos1. Além disso, o gavage oral pode ser tecnicamente desafiador e tem o potencial de causar lesões. Como alternativa, os camundongos podem auto-administrar compostos que são misturados em seus alimentos ou dissolvidos em sua água potável 2. No entanto, essa abordagem tem uma grande limitação, ou seja, depende do tempo natural circadiano da ingestão de alimentos ou água. Além disso, a estabilidade ou solubilidade de medicamentos na água pode ser problemas importantes quando entregues cronicamente desta forma. Para superar essas limitações, as drogas podem ser misturadas com alimentos altamente palatáveis, como massa de biscoito 3,geleia 4,5 ou manteiga de amendoim 6 para incentivar a autoadministração em camundongos em um momento especificado. Essa abordagem tem a vantagem de facilitar a entrega de medicamentos com o mínimo de estresse comparado com uma injeção ou gavagediário 1. Este procedimento pode ser adaptado para fornecer uma grande variedade de drogas para camundongos. Este protocolo demonstra o processo de preparação de medicamentos, treinamento, seguido de entrega de medicamentos em alimentos altamente palatáveis. Como exemplo, este método é usado para administrar a droga antipsicótica risperidona para camundongos c57BL/6J fêmeas. A risperidona é bem conhecida por ter potentes efeitos hiperfágicos e de ganho de peso em pacientes 7 que é bem modelado em roedores 6,8. Este sistema de administração facilita um modelo altamente translacional que poderia ser usado para estudar uma grande variedade de drogas e seus efeitos em caminhos que regulam a ingestão de alimentos e o peso corporal 9.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia, San Diego.
1. Fazendo a pelota de manteiga de amendoim
- Calcule a quantidade de droga necessária para fazer a dose desejada de droga em uma pelota de manteiga de amendoim e dimensione para o tamanho do lote necessário para um experimento. É importante ressaltar que as pelotas podem ser mantidas a -80 °C, dependendo da estabilidade da droga.
- Pulverize os comprimidos de droga usando uma argamassa e pilão.
- Pesar a quantidade calculada de manteiga de amendoim exigida colocando-a em um barco de pesagem em uma balança asfaltada.
- Coloque a manteiga de amendoim sobre um béquer de água morna até derreter.
- Adicione a quantidade necessária de droga pulverizada no amendoim derretido e misture bem.
- Deixe a mistura de manteiga de amendoim esfriar para que possa ser facilmente colocada nos moldes de borracha.
- Coloque a mistura de manteiga de amendoim em um molde. O usado aqui é um molde de pelota de corticosterona de borracha e cria aproximadamente ~100 mg de pelotas de manteiga de amendoim. O ajuste da razão entre a droga e a manteiga de amendoim pode ser necessário para garantir a palatabilidade.
- Repita estes passos com manteiga de amendoim sozinho para fazer pelotas de placebo.
- Congele o molde a -20 °C ou -80 °C (dependendo da estabilidade da droga) para permitir que a manteiga de amendoim endureça até o uso.
2. Configuração do mouse
- Ratos de casa singly em gaiolas de rato padrão. Linha com roupa de cama de papel altamente absorvente e enriquecimento, incluindo toalhas de papel e cúpula de habitação. Esta cama de papel facilita medidas precisas de consumo alimentar, permitindo a quantificação de alimentos derramados de fezes e roupas de cama.
NOTA: A aprovação do ENsure IACUC para a habitação de camundongos foi obtida. - Forneça comida e água ad libitum e permita que os ratos se aclimatar à carcaça por aproximadamente 3 dias.
3. Treinamento para auto-dosagem de manteiga de amendoim
- Planeje e selecione a hora ideal do dia para a administração de drogas.
- Acelere os ratos por 24 horas e certifique-se de que a aprovação do IACUC tenha sido recebida para a duração do jejum escolhido.
- Tire o molde do congelador, deixe o molde de borracha suavizar para que as pelotas possam ser facilmente extrudadas para fora do molde. Todo o treinamento pode ser concluído usando pelotas de controle placebo.
- Coloque uma pelota de manteiga de amendoim de controle placebo na parede da gaiola aproximadamente 1,5 polegadas da base. No primeiro dia, pode levar aproximadamente 1 hora para o mouse consumir a pelota de manteiga de amendoim devido à novidade.
- Após a sessão de treinamento, o Ad libitum tem acesso a comida e água.
- No dia seguinte, coloque a pelota de manteiga de amendoim na parede da gaiola no mesmo local para mais treinamento em ratos não em jejum.
- Repita o treinamento em ratos alimentados por aproximadamente 3 dias. O tempo de consumo da manteiga de amendoim será inferior a 30 minutos até o terceiro dia de treinamento.
4. Experimento
- Randomize camundongos para grupos de tratamento com base no peso corporal para que os grupos tenham o mesmo peso corporal médio antes do tratamento.
- Planeje administrar as pílulas de manteiga de amendoim (tratamento ou placebo) aos camundongos ao mesmo tempo em que foram treinados para receber as pelotas de manteiga de amendoim.
- Pese a comida e o rato e regissuem os valores.
- Certifique-se de que as pílulas de manteiga de amendoim (tratamento ou placebo) sejam colocadas no mesmo local da gaiola estabelecido durante o treinamento.
- Continue o procedimento de dosagem diariamente durante a duração do experimento.
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Representative Results
No exemplo apresentado aqui, a manteiga de amendoim foi usada para entregar risperidona aos ratos diariamente por 14 dias.
Este estudo mostra que a entrega crônica de risperidona por meio deste método facilita o aumento altamente reprodutível na ingestão de alimentos e no peso corporal em comparação com o controle (Figura 1a,b). Além disso, esse método de entrega resulta em dados altamente consistentes em comparação com abordagens alternativas de entrega mais estressantes, como injeções intraperitoneais (Figura 1c,d).
Figura 1. O efeito dos métodos de entrega de medicamentos na ingestão de alimentos e no ganho de peso em camundongos. Os camundongos fêmeas C57BL/6J foram tratados com risperidona (3 mg/kg) em uma pelota de manteiga de amendoim ou pelota de controle placebo diariamente às 8:00 am durante 14 dias. Os camundongos tratados com risperidona na manteiga de amendoim apresentaram maior ingestão diária de alimentos (a) e ganharam significativamente mais peso (b) em comparação com o tratamento de controle. Além disso, a entrega intraperitoneal de risperidona (3 mg/kg) não teve efeitos tão robustos na ingestão de alimentos (c) ou ganho de peso(d)em comparação com a auto-entrega na manteiga de amendoim. Os dados são expressos como ± SEM e analisados pelo t-teste estudantil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ao conduzir este protocolo, é importante ser consistente com a precisão das medidas de ingestão de alimentos e peso corporal e o tempo de administração de medicamentos ao longo do estudo. Embora este método de autoadministração exija uma fase significativa de treinamento, isso é particularmente importante para aclimatar os ratos à novidade da manteiga de amendoim e garantir que os ratos consumam a droga no momento dado. Uma vez estabelecido, ele também oferece grande flexibilidade experimental e pode ser modificado e adaptado para fornecer medicamentos várias vezes por dia em várias doses. Esta técnica funciona melhor quando os camundongos estão consumindo a comida normal como sua principal fonte de nutrição. Quando os camundongos são alimentados com dietas altamente palatáveis de alto teor de açúcar, isso pode tornar a fase de treinamento mais desafiadora, pois alguns camundongos são menos motivados a consumir a manteiga de amendoim nessas condições e podem ser uma limitação dessa técnica.
Comparado com os métodos existentes, como injeções ou gavage oral, este método de auto-entrega de medicamentos causa estresse mínimo e resulta em dados robustos e consistentes relacionados a efeitos induzidos por drogas em fenótipos metabólicos, incluindo ingestão de alimentos e peso corporal. As aplicações futuras desta técnica incluem estudos sobre o tempo de entrega de medicamentos sobre o consumo de alimentos e o ganho de peso no contexto de ritmos circadianos e saúde metabólica10.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo subsídio dos Institutos Nacionais de Saúde R01DK117872 concedido à OO e à Bolsa da Fundação Larry L Hillblom concedida ao RCZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57B6/J mice | Jackson Labs, Sacramento, CA, USA | 664 | |
| corticosterone pellet mold | Ted Pella Inc, Redding, CA, USA | 106A | |
| Mouse igloo | VWR, Visalia, CA, USA | 89067-850 | cage enrichment |
| peanut butter | Jif Peanut Butter, Orrville, OH, USA | Creamy peanut butter | |
| pestle and mortar | VWR, Visalia, CA, USA | 470148-960 | |
| risperidone | Patriot Pharmaceuticals, Horsham, PA, USA | 50458-593-50 | |
| rodent chow | LabDiet, St. Louis, MO, USA | 5001 | |
| weigh boat | VWR, Visalia, CA, USA | 10803-148 | |
| weighing scale | Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland | MS104TS | |
| Wypall paper X60 | Kimberly-Clark, Corinth, MS, USA | 34865-05 | absorbent paper bedding |
References
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