Questo articolo presenta un metodo unico per analizzare le interazioni ospite-microbioma utilizzando un nuovo sistema di coltura di organi intestinali per esperimenti ex vivo.
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Articolo metodologico
Un sistema di coltura di organi intestinali intestinali per l'analisi delle interazioni ospite-microbiota
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La struttura del tessuto intestinale facilita le interazioni strette e mutualistiche tra l'ospite e il microbiota intestinale. Questi colloqui incrociati sono cruciali per mantenere l'omeostasi locale e sistemica; le modifiche alla composizione del microbiota intestinale (disbiosi) si associano a una vasta gamma di malattie umane. I metodi per sezionare le interazioni ospite-microbiota comprendono un compromesso intrinseco tra la conservazione della struttura fisiologica dei tessuti (quando si utilizzano modelli animali in vivo) e il livello di controllo sui fattori dell'esperimento (come nei semplici sistemi di coltura cellulare in vitro). Per affrontare questo compromesso, Yissachar et al. hanno recentemente sviluppato un sistema di coltura di organi intestinali. Il sistema preserva una costruzione naïf del tessuto del colon e meccanismi cellulari e consente anche uno stretto controllo sperimentale, facilitando sperimentazioni che non possono essere prontamente eseguite in vivo. È ottimale per sezionare le risposte a breve termine di vari componenti intestinali (come elementi epiteliali, immunologici e neuronali) a perturbazioni luminali (inclusi microbi anaerobici o aerobici, campioni interi di microbiota di topi o esseri umani, farmaci e metaboliti). Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di un protocollo ottimizzato per la coltura di organi di più frammenti intestinali utilizzando un dispositivo di coltura intestinale personalizzato. Le risposte dell'ospite alle perturbazioni luminali possono essere visualizzate mediante colorazione immunofluorescenza di sezioni di tessuto o frammenti di tessuto a montaggio intero, ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) o imaging time-lapse. Questo sistema supporta una vasta gamma di lettura, tra cui il sequenziamento di nuova generazione, la citometria a flusso e vari saggi cellulari e biochimici. Nel complesso, questo sistema di coltura di organi tridimensionali supporta la coltura di tessuti intestinali grandi e intatti e ha ampie applicazioni per l'analisi ad alta risoluzione e la visualizzazione delle interazioni ospite-microbiota nell'ambiente intestinale locale.
Introduzione
L'intestino è un organo altamente complesso contenente una vasta gamma di tipi di cellule (cellule epiteliali, cellule del sistema immunitario, neuroni e altro) organizzati in una particolare struttura che consente alle cellule di interagire e comunicare tra loro e con il contenuto luminale (microbiota, cibo, ecc.) 1. Attualmente, il toolbox di ricerca disponibile per l'analisi delle interazioni ospite-microbiota comprende colture cellulari in vitro e modelli animali in vivo 2. I modelli animali in vivo forniscono una costruzione fisiologica del tessuto3 ma con scarso controllo sperimentale e limitata capacità di manipolare le condizioni dell'esperimento. I sistemi di coltura in vitro, d'altra parte, utilizzano cellule primarie o linee cellulari che possono essere integrate con microbi4, offrendo uno stretto controllo sui parametri dell'esperimento ma mancano della complessità cellulare e dell'architettura tissutale. I moderni saggi in vitro consentono l'uso avanzato di campioni di tessuto umano sani e patologici, come organoidi epiteliali derivati da fonti murine o umane5,6,e campioni che imitano il microambiente mucoso7. Un altro esempio è il test "gut on a chip", che include la linea cellulare epiteliale del colon umano (Caco2), la matrice extracellulare e i canali microfluidici per imitare la condizione fisiologica dell'invariante intestinale8. Tuttavia, per quanto avanzati e innovativi possano essere i campioni in vitro, non mantengono una normale architettura tissutale o una composizione cellulare ingenua.
Per affrontare questo problema, Yissachar et al. hanno recentemente sviluppato un sistema di coltura di organi ex vivo 9 (Figura 1) che mantiene intatti i frammenti intestinali ex vivo, beneficiando dei vantaggi di modelli sia in vivo che in vitro. Questo sistema di coltura di organi intestinali ex vivo si basa su un dispositivo di coltura personalizzato che supporta una coltura multiplexata di sei tessuti del colon, consentendo di esaminare gli input sperimentali in condizioni comparabili controllando gli input e gli output del sistema. Lavori recenti hanno dimostrato che questo sistema è prezioso per analizzare le risposte intestinali ai singoli batteri intestinali9,campioni di microbiota umano intero10 e metaboliti microbici11. Questo sistema consente, per la prima volta, lo studio di queste prime interazioni ospite-microbiota con un alto livello di controllo sulle componenti ospiti, microbiche e ambientali. Inoltre, consente di monitorare e manipolare il sistema durante l'esperimento, in tempo reale.
Figura 1: Schemi del dispositivo di coltura intestinale. Un intero frammento di tessuto intestinale è attaccato alle porte di uscita e di ingresso della camera (in alto), con pompe che regolano il flusso medio all'interno del lume e nella camera media esterna. L'intero dispositivo (in basso) contiene 6 di queste camere. Questa cifra è stata modificata da Yissachar et al. 2017. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocollo
Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali approvate dal comitato etico per il benessere degli animali.
1. Preparazione dell'esperimento
- Fabbricazione del dispositivo di coltura dell'organo intestinale (3 giorni)
- Utilizzando una stampante 3D, stampare gli stampi in plastica riutilizzabili per il dispositivo di coltura dell'organo (il dispositivo ha 6 pozzette, con 24 fori piccoli e grandi, e per il coperchio del coperchio del dispositivo) (file 3D allegati).
NOTA: Questi stampi in plastica possono essere utilizzati per la fabbricazione di numerosi dispositivi. - Inserire gli aghi smussati (22 G e 18 G) nella posizione appropriata all'interno dello stampo del dispositivo e gettare circa 20 g di miscela di polidimetilsilossano (PDMS) (rapporto peso 1:10, base al catalizzatore) per un set del dispositivo e coperchio.
- Posizionare gli stampi in una camera a vuoto per 30 minuti, per rimuovere le bolle d'aria dalla miscela PDMS.
- Incubare gli stampi a 55 °C durante la notte, per completare la polimerizzazione PDMS.
- Quando il PDMS è impostato, estrarre gli aghi dallo stampo e rilasciare con attenzione il dispositivo di coltura e il coperchio dagli stampi in plastica.
- Rimuovere i residui di PDMS dal contorno del pozzo utilizzando una lama chirurgica. Collegare il dispositivo PDMS e il coperchio del dispositivo su un vetro di copertura (micro vetrini da 75 mm x 50 mm) utilizzando adesivo siliconico non tossico e lasciare le parti da sistemare durante la notte (applicare la colla sul lato liscio del dispositivo).
- Inserire dodici aghi da 22 G per il lume e dodici aghi da 18 G per il pozzo. Fissare tutti gli aghi in posizione con silicone e lasciarlo impostare durante la notte. Inserire due aghi da 18 G nel coperchio di copertura per un corretto flusso d'aria dentro e fuori dal dispositivo di coltura degli organi intestinali.
- Controllare tutti gli aghi per le perdite utilizzando una siringa piena d'acqua. Controllare che non ci siano perdite dai pozzi riempiendo i pozzi con acqua.
- Posizionare due nodi chirurgici su ogni ago da 22 G che sarà collegato al colon. Posizionare il dispositivo e il coperchio in un sacchetto di carta per autoclave e sterilizzare in autoclave.
- Utilizzando una stampante 3D, stampare gli stampi in plastica riutilizzabili per il dispositivo di coltura dell'organo (il dispositivo ha 6 pozzette, con 24 fori piccoli e grandi, e per il coperchio del coperchio del dispositivo) (file 3D allegati).
- Terreno di coltura (0,5 h)
- In una cappa biologica, mescolare quanto segue (in tubo da 50 ml): 37 mL di Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 10 mL di sostituzione del siero KSR, 1 mL di integratore B27, 0,5 mL di supplemento N2, 0,5 mL di tampone HEPES da 1 M e 0,5 mL di aminoacidi non essenziali.
- Filtrare e conservare il mezzo completo a 4 °C.
- Preparazione di tubi e strumenti chirurgici
- Tagliare la lunghezza appropriata dei tubi per il lumen di ingresso, il pozzo di ingresso, il lumen di uscita e il pozzo di uscita (12 tubi corti e 12 tubi lunghi). Collegare un adattatore appropriato a ciascun lato del tubo.
- Preparare gli strumenti chirurgici: forbici dritte, pinza sottile 4x e pinza affilata 2x.
- Posizionare i tubi e gli strumenti chirurgici in un sacchetto di carta per autoclave e sterilizzarli con un'autoclave.
- Preparare l'input luminale (stimolazione desiderata - batteri, feci, farmaci, ecc.).
- Prima dell'esperimento, determinare la carica batterica della coltura batterica, mediante diluizioni seriali12,e la coltura in condizioni aerobiche e/o anaerobiche.
- Dopo aver calcolato la carica batterica, diluire le colture batteriche in terreno di coltura tissutale sterile per ottenere la concentrazione batterica richiesta. Per i campioni fecali, filtrare utilizzando un filtro da 100 μm.
NOTA: Per la stimolazione non batterica (farmaci, metaboliti, ecc.), diluire la sostanza alla concentrazione richiesta utilizzando il terreno di coltura intestinale.
2. Preparazione della configurazione dell'esperimento
- All'interno dell'incubatore di colture d'organo, accendere l'unità di riscaldamento e impostarla a 37 °C.
- Impostare le pompe e le siringhe di ingresso e uscita.
- Input del terreno di coltura tissutale
- In una cappa a flusso biologico o laminare, riempire le siringhe del pozzo di ingresso con un terreno di coltura completo. Il volume finale dipende dalla durata dell'esperimento e dalla portata; di solito 1 mL/h più mezzo aggiuntivo per lo spurgo.
- Collegare i tubi alle siringhe utilizzando l'adattatore Luer-lock. Posizionare le siringhe riempite nelle pompe a siringa.
- Eliminare le siringhe di ingresso. Assicurarsi che il mezzo del pozzo fuoriesca da tutti i tubi in un vetro di scarto.
- Ingresso luminale
- Riempire le siringhe di ingresso luminale con un trattamento di stimolazione (batteri, farmaci, ecc.). Il volume dipende dalla durata dell'esperimento e dalla portata (di solito 30 μL/h più mezzo aggiuntivo per lo spurgo).
- Collegare i tubi alle siringhe utilizzando l'adattatore Luer-lock. Posizionare le siringhe riempite nelle pompe a siringa.
- Eliminare le siringhe di ingresso. Assicurati che la stimolazione fluisca da tutti i tubi in un vetro di scarto. Fare attenzione a non contaminare le diverse stimolazioni.
- Uscite
- Posizionare le siringhe vuote nelle pompe a siringa di uscita (impostare la modalità pompa su "prelievo").
- Configurazione del dispositivo
- Impostare il regolatore che controlla la portata della miscela di gas (95% O2 + 5% CO2) per un flusso delicato e minimo.
- Esaminare il dispositivo in un cappuccio laminare.
- Lavare gli aghi del dispositivo con IMDM sterile per lavare gli aghi.
- Aggiungere 500 μL di terreno di coltura sterile in ciascun pozzo del dispositivo.
- Preparazione per la dissezione dei tessuti
- Mettere gli strumenti chirurgici sterili all'interno del cappuccio laminare.
- Riempire una siringa da 10 ml con IMDM sterile e collegare un ago sterile (autoclavato) da 22 G per il lavaggio del colon.
3. Colture d'organo
- Sacrificio di topi e dissezione dei tessuti
- In un cappuccio laminare, sacrifica topi di 12-14 giorni per decapitazione. Spruzzare i topi con il 70% di etanolo e posizionare i topi su una piastra di plastica.
- Usando forbici affilate e pinza, seziona il topo ed estrai il tratto digestivo dallo stomaco all'ano tagliando tutto il grasso e i tessuti connettivi. Tagliare il colon e posizionarlo su un nuovo piatto.
NOTA: Ridurre al minimo il contatto con il tessuto del colon. Non toccare la parte centrale del tessuto del colon. Tenere il tessuto delicatamente e solo ai bordi del tessuto.
- Colon lavare e lavare
- Al microscopio di dissezione, lavare delicatamente il contenuto del colon con IMDM sterile (nel lato prossimale) con la siringa da 10 mL preparata (passo 2.7.2). Dopo aver rimosso le feci dal tessuto intestinale, posizionare il colon in una nuova piastra a 6 pozzetti riempita con 0,5 ml di IMDM sterile.
- Collegamento dei due punti al dispositivo
- Prendi il tessuto e collegalo con cura all'ago da 22 G e fai una cravatta stretta con i due fili. A questo punto, è imperativo mantenere il corretto orientamento del colon al flusso lume (prossimale = ingresso, distale = uscita). Ripetere i passaggi 3.2-3.3 per tutti e 6 i tessuti.
- Verificare che le serrature Luer dell'ago di ingresso siano vuote dal supporto. In caso contrario, svuotarli. Aggiungere stimolazioni all'ago di ingresso Luer lock (per evitare l'ingresso di bolle d'aria nel lume). Ripeti questo passaggio per ogni colon con la stimolazione appropriata.
- Verificare che tutti i tessuti siano collegati e posizionare il coperchio di copertura sulla parte superiore del dispositivo.
- Collegamento del dispositivo di coltura dell'organo alle pompe
- Posizionare il dispositivo nella camera termoriscaldata preriscaldata (37 °C).
- Collegare il flusso di gas
- Collegare l'adattatore del gas al coperchio di copertura utilizzando l'apposito ago di ingresso.
- Collegare i tubi di ingresso e uscita al dispositivo.
NOTA: collegare il lato prossimale del colon alle vasche di ingresso.
- Spurgare il lume con gli input di stimolazione.
- Far scorrere delicatamente la stimolazione luminale attraverso l'intestino e verificare il flusso medio nei tubi di uscita.
- Lavare il mezzo esterno.
- Lavare il mezzo esterno 3 volte (impostare le pompe ad una velocità di 600 μL/min sia per l'ingresso che per l'uscita). Ogni lavaggio richiede 1 minuto (iniziando svuotando il pozzo).
- Avviare l'esperimento.
- Avviare le pompe alle seguenti velocità:
Portata: lumen: ingresso- 30 μL/h, uscita- 35 μL/h
Supporto esterno: ingresso- 1000 μL/h, uscita- 950 μL/h
NOTA: il tempo dell'esperimento può variare da 30 minuti a 24 ore.
- Avviare le pompe alle seguenti velocità:
- Fine dell'esperimento (fino a 24 ore per colture di organi del colon)
- Scollegare tutti i tubi dal dispositivo.
- Scollegare i tessuti dagli aghi e continuare con le lette desiderate.
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Risultati
Il sistema di coltura degli organi intestinali mantiene la vitalità dei tessuti ex vivo. La valutazione della vitalità dei tessuti è stata effettuata durante tutto il periodo di coltura. I frammenti di tessuto del colon sono stati incubati nel sistema di coltura degli organi intestinali e fissati dopo la coltura di 2/12/24 ore. L'integrità dello strato di cellule epiteliali intestinali (IEC) è stata convalidata mediante colorazione immunofluorescenza utilizzando anticorpi E-caderina e citocheratina-18. Allo ste...
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Discussione
Questo articolo descrive un protocollo ottimizzato per le colture di organi intestinali ex vivo che Yissachar et al. hanno recentemente sviluppato (pubblicato9 e dati non pubblicati). Il sistema di coltura degli organi intestinali supporta la coltura multiplexata di frammenti intestinali intatti mantenendo il flusso luminale. Fornisce il pieno controllo sull'ambiente intra ed extra-luminale (compresa la dose di stimolazione, il tempo di esposizione e la portata) e preserva la struttura na...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri passati e presenti del laboratorio Yissachar per il loro prezioso contributo nell'ottimizzazione del protocollo del sistema di coltura degli organi intestinali. Ringraziamo Yael Laure per l'editing critico del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Israel Science Foundation (sovvenzione n. 3114831), dall'Israel Science Foundation - Broad Institute Joint Program (sovvenzione n. 8165162) e dal Gassner Fund for Medical Research, Israele.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Device | |||
| 18 Gauge Aghi smussati | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 gauge Aghi smussati | Mcmaster | 75165a758 | |
| Adesivo per tutti gli usi Selant 100% silicone | DAP | 688 | |
| Essiccatore a vuoto cubico VDC-21+ 2 ripiani | AAAD4021 | ||
| vetrino 1 mm di spessore | Corning | 2947-75X50 | |
| Mini incubatrice im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E POMPA | VI-412711 | ||
| Tappi di accoppiamento per tubo a rotazione rapida in plastica | Mcmaster | 51525k121 | |
| Prese di accoppiamento per tubo a rotazione rapida in plastica | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Elastomero siliconico | Dow | Polidimetilsilossano, PDMS | |
| Tubo | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Materiali: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 Integratore (50x), Thermo Fisher | Scientific | senza siero | |
| HEPES Buffer (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium con rosso fenolo (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Knock-Out Serum | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non Aminoacido essenziale (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Strumenti chirurgici | |||
| Forbici grandi | Aseltech | 11-00-10 | |
| Pinze affilate | FST | 11297-10 | |
| Filo chirurgico intrecciato in seta | SMI | 8010G | |
| Forbici dritte | FST | 14091-09 | |
| Pinze sottili | F.S.T | 11051-10 | |
| Organ System | |||
| 0.1 µ m | Filtro Life Gene | ||
| 0.22 µ m Filter | Life Gene | ||
| 5 mL Luer Lock Siringa | B-D | 309649 | |
| Greenough Stereomicroscopio | ZEISS | Stemi 305 | |
| Riscaldatore d'aria di precisione a ricircolo "CUBE"CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| Pompa a siringa | New Era Pump Systems inc | nep-ne-1600-em |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
