Descriviamo una tecnica di trasduzione rapida transitoria in diversi stadi di sviluppo di Echinococcus granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Trasduzione transitoria delle forme strobilate di Echinococcus granulosus
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'echinococcosi cistica o malattia idatide è una delle più importanti malattie parassitarie zoonotiche causate da Echinococcus granulosus, una piccola tenia ospitata nell'intestino dei canini. C'è un urgente bisogno di ricerca genetica applicata per comprendere i meccanismi di patogenesi e controllo e prevenzione delle malattie. Tuttavia, la mancanza di un efficace sistema di valutazione genica impedisce l'interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, compresa la specie Echinococcus . Il presente studio dimostra il potenziale della trasduzione transitoria del gene lentivirale nelle forme metacestolodiche e strobilate di E. granulosus. I protoscoleces (PSC) sono stati isolati dalle cisti idatide e trasferiti in specifici terreni di coltura bifasici per svilupparsi in vermi strobilati. I vermi sono stati trasfettati con lentivirus di terza generazione raccolti, insieme a cellule HEK293T come controllo del processo di trasduzione. Una fluorescenza pronunciata è stata rilevata nei vermi strobilati per 24 ore e 48 ore, indicando una trasduzione lentivirale transitoria in E. granulosus. Questo lavoro presenta il primo tentativo di trasduzione transitoria basata sul lentivirus nelle tenie e dimostra i risultati promettenti con potenziali implicazioni negli studi sperimentali sulla biologia dei vermi piatti.
Introduzione
L'echinococcosi cistica (CE) è una delle più importanti malattie da elminti causata da Echinococcus granulosus, una piccola tenia della famiglia Taeniidae 1,2. Sono stati condotti studi approfonditi sullo sviluppo immunodiagnostico e vaccinale per E. granulosus. Tuttavia, una conoscenza inadeguata delle basi molecolari della biologia dei parassiti pone importanti limitazioni nella diagnosi, gestione e prevenzione della malattia idatide 3,4,5,6.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Questo studio è stato approvato dal National Institute for Medical Research Development e dal Research Ethics Review Committee, n. 958680. I lentivirus sono classificati come organismi BSL-2; quindi, tutte le procedure di coltura di laboratorio in questo protocollo sono state eseguite utilizzando pratiche di laboratorio sterili e condotte sotto una cappa a flusso laminare secondo le linee guida NIH. La Figura 1 mostra una presentazione schematica del protocollo di studio per i diversi stadi di E. granulosus .
1. Raccolta di cisti idatidi
- Raccogli cisti idatidi epatiche da pec....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Qui, descriviamo una tecnica di trasduzione transitoria rapida ed efficiente in E. granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione. Abbiamo coltivato PSC in un terreno di coltura bifasico per ottenere vermi strobilati, come descritto in precedenza25,26. I protoscoleces si sviluppano in vermi strobilati dopo 6 settimane in vitro. Diversi stadi di E. granulosus sono stati osservati nel terreno di coltura bifasico, tra cui .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Comprendere le basi molecolari dei nematodi e la biologia di Platyhelminthes è fondamentale per comprendere la patogenicità dei parassiti zoonotici27. La mancanza di un efficace sistema di valutazione genica è un grosso ostacolo all'interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, tra cui la specie Echinococcus 12,27. Il presente studio dimostra l'eccellente potenziale del lentivirus nella trasduzione t.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Elite Researcher Grant Committee con il numero di premio 958680 del National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastre di coltura a 12 pozzetti | SPL Life Sciences | 30012 | |
| pallone di coltura da 25 cm2 | SPL Life Sciences | 70325 | |
| piastre di coltura a 6 pozzetti | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Cloruro di calcio | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Concentrazione di lavoro: 2,5 mM |
| CMRL 1066 medio | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubatore | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Bile | Isolato da un cane soppresso e sterilizzato da 0,2 μ m filtro siringa | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | preparare lo 0,1% di Eosina per il test di esclusione |
| funzionante Siero fetale bovino (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Inattivazione del calore di FBS (30 min in 40 ° C) |
| Siero fetale di vitello (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Inattivazione termica di FCS (30 min in 40 ° C) |
| HEK293T cellule | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Rene embrionale umano 293T |
| HEPES soluzione salina tamponata (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrato |
| Microscopio a fluorescenza invertita | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillina | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Concentrazione di lavoro: 100 UI/mL |
| Pepsina | Roche | 10108057001 | Concentrazione di lavoro: 2 mg/mL, pH 2 |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | Questo reagente si risolve in meno di 1 minuto in D.W |
| Polybrene (reagente di trasfezione) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomicina | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Concentrazione di lavoro: 100 μ g/mL |
| Plasmide lentivirale di terza generazione (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Vettore di trasferimento (ottenuto commercialmente dal Dipartimento di Ricerca di Medicina Molecolare del Centro Accademico Iraniano per l'Istruzione, la Cultura e la Ricerca (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Plasmide lentivirale di terza generazione (pLPI e pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Vettore helper (ottenuto commercialmente dal Dipartimento di Ricerca di Medicina Molecolare del Centro Accademico Iraniano per l'Educazione, la Cultura e la Ricerca (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Plasmide lentivirale di terza generazione (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Vettore helper (ottenuto commercialmente dal Dipartimento di Ricerca di Medicina Molecolare del Centro Accademico Iraniano per l'Istruzione, la Cultura e la Ricerca (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x soluzioni di lavoro (pH 7,4– 7.6) |
Riferimenti
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315(2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
