Trasduzione transitoria delle forme strobilate di Echinococcus granulosus

Summary

Descriviamo una tecnica di trasduzione rapida transitoria in diversi stadi di sviluppo di Echinococcus granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione.

Abstract

L'echinococcosi cistica o malattia idatide è una delle più importanti malattie parassitarie zoonotiche causate da Echinococcus granulosus, una piccola tenia ospitata nell'intestino dei canini. C'è un urgente bisogno di ricerca genetica applicata per comprendere i meccanismi di patogenesi e controllo e prevenzione delle malattie. Tuttavia, la mancanza di un efficace sistema di valutazione genica impedisce l'interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, compresa la specie Echinococcus . Il presente studio dimostra il potenziale della trasduzione transitoria del gene lentivirale nelle forme metacestolodiche e strobilate di E. granulosus. I protoscoleces (PSC) sono stati isolati dalle cisti idatide e trasferiti in specifici terreni di coltura bifasici per svilupparsi in vermi strobilati. I vermi sono stati trasfettati con lentivirus di terza generazione raccolti, insieme a cellule HEK293T come controllo del processo di trasduzione. Una fluorescenza pronunciata è stata rilevata nei vermi strobilati per 24 ore e 48 ore, indicando una trasduzione lentivirale transitoria in E. granulosus. Questo lavoro presenta il primo tentativo di trasduzione transitoria basata sul lentivirus nelle tenie e dimostra i risultati promettenti con potenziali implicazioni negli studi sperimentali sulla biologia dei vermi piatti.

Introduction

L'echinococcosi cistica (CE) è una delle più importanti malattie da elminti causata da Echinococcus granulosus, una piccola tenia della famiglia Taeniidae ^1,2. Sono stati condotti studi approfonditi sullo sviluppo immunodiagnostico e vaccinale per E. granulosus. Tuttavia, una conoscenza inadeguata delle basi molecolari della biologia dei parassiti pone importanti limitazioni nella diagnosi, gestione e prevenzione della malattia idatide 3,4,5,6.

Protocol

Questo studio è stato approvato dal National Institute for Medical Research Development e dal Research Ethics Review Committee, n. 958680. I lentivirus sono classificati come organismi BSL-2; quindi, tutte le procedure di coltura di laboratorio in questo protocollo sono state eseguite utilizzando pratiche di laboratorio sterili e condotte sotto una cappa a flusso laminare secondo le linee guida NIH. La Figura 1 mostra una presentazione schematica del protocollo di studio per i diversi stadi di E. granulosus .

1. Raccolta di cisti idatidi

1. Raccogli cisti idatidi epatiche da pec....

Results

Qui, descriviamo una tecnica di trasduzione transitoria rapida ed efficiente in E. granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione. Abbiamo coltivato PSC in un terreno di coltura bifasico per ottenere vermi strobilati, come descritto in precedenza^25,26. I protoscoleces si sviluppano in vermi strobilati dopo 6 settimane in vitro. Diversi stadi di E. granulosus sono stati osservati nel terreno di coltura bifasico, tra cui .......

Discussion

Comprendere le basi molecolari dei nematodi e la biologia di Platyhelminthes è fondamentale per comprendere la patogenicità dei parassiti zoonotici²⁷. La mancanza di un efficace sistema di valutazione genica è un grosso ostacolo all'interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, tra cui la specie Echinococcus ^12,27. Il presente studio dimostra l'eccellente potenziale del lentivirus nella trasduzione t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
piastre di coltura a 12 pozzetti	SPL Life Sciences	30012
pallone di coltura da 25 cm2	SPL Life Sciences	70325
piastre di coltura a 6 pozzetti	SPL Life Sciences	30006
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C4901-500G	Concentrazione di lavoro: 2,5  mM
CMRL 1066 medio	Thermo Fisher Scientific	11530037
CO2 incubatore	memmert	ICO150
D-(+)-Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
DMEM	Life Technology	12100046
Bile			Isolato da un cane soppresso e sterilizzato da 0,2 μ m filtro siringa
Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009-5G	preparare lo 0,1% di Eosina per il test di esclusione
funzionante Siero fetale bovino (FBS)	DNAbiotech	DB9723-100ml	Inattivazione del calore  di  FBS (30 min in 40 ° C)
Siero fetale di vitello (FCS)	DNAbiotech	DB9724-100ml	Inattivazione termica  di  FCS (30 min in 40 ° C)
HEK293T cellule	BONbiotech	BN_0012.1.14	Rene embrionale umano 293T
HEPES soluzione salina tamponata (HBS)	Sigma-Aldrich	51558-50ML	2x concentrato
Microscopio a fluorescenza invertita	OLYMPUS	IX51
Penicillina	Sigma-Aldrich	P3032-10MU	Concentrazione di lavoro: 100 UI/mL
Pepsina	Roche	10108057001	Concentrazione di lavoro: 2 mg/mL, pH 2
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	DNAbiotech	DB0011	Questo reagente si risolve in meno di 1 minuto in D.W
Polybrene (reagente di trasfezione)	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RPMI medium	BioIdea	BI-1006-05
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
Streptomicina	Sigma-Aldrich	S9137-25G	Concentrazione di lavoro: 100 μ g/mL
Plasmide lentivirale di terza generazione (pCDH513b)	SBI System Biosciences (BioCat GmbH)	CD513B-1-SBI	Vettore di trasferimento (ottenuto commercialmente dal Dipartimento di Ricerca di Medicina Molecolare del Centro Accademico Iraniano per l'Istruzione, la Cultura e la Ricerca (ACECR), Mashhad, Iran)
Plasmide lentivirale di terza generazione (pLPI e pLPII)	Invitrogen (Life Technologies)	K4975-00	Vettore helper (ottenuto commercialmente dal Dipartimento di Ricerca di Medicina Molecolare del Centro Accademico Iraniano per l'Educazione, la Cultura e la Ricerca (ACECR), Mashhad, Iran)
Plasmide lentivirale di terza generazione (pMD2G)	Addgene	Plasmid 12259	Vettore helper (ottenuto commercialmente dal Dipartimento di Ricerca di Medicina Molecolare del Centro Accademico Iraniano per l'Istruzione, la Cultura e la Ricerca (ACECR), Mashhad, Iran)
Tris/EDTA Buffer (TE)	DNAbiotech	DB9713-100ml
Tripsina	Sigma-Aldrich	T9935-50MG	1x soluzioni di lavoro (pH 7,4– 7.6)