Trasduzione transitoria delle forme strobilate di Echinococcus granulosus

L'echinococcosi cistica (CE) è una delle più importanti malattie da elminti causata da Echinococcus granulosus, una piccola tenia della famiglia Taeniidae ^1,2. Sono stati condotti studi approfonditi sullo sviluppo immunodiagnostico e vaccinale per E. granulosus. Tuttavia, una conoscenza inadeguata delle basi molecolari della biologia dei parassiti pone importanti limitazioni nella diagnosi, gestione e prevenzione della malattia idatide 3,4,5,6.

Negli ultimi anni, a causa dello sviluppo del sequenziamento del genoma e dei metodi trascrittomici, una vasta gamma di studi molecolari è stata condotta sui platelminti da diversi gruppi di ricerca ^7,8,9. Tuttavia, nel mondo dei parassiti, i progressi nella tecnologia di trasferimento genico nei vermi piatti parassiti sono ancora limitati rispetto ai metodi di trasduzione transitoria altamente riproducibili sviluppati per alcuni protozoi 10,11,12.

L'uso di sistemi di consegna virale è emerso come uno strumento essenziale per la consegna transgenica e le indagini geniche / proteiche negli ultimi due decenni¹³. Il lentivirus infetta sia le cellule in divisione che quelle non in divisione, rendendo così possibile infettare le cellule postmitotiche 14,15,16. Prove recenti indicano che l'utilizzo di un sistema di trasduzione basato su lentivirus nelle cellule di mammifero offre il potenziale per superare la maggior parte dei limiti delle precedenti tecniche di knock-in / knock-down. La progettazione e la costruzione di vettori lentivirali di espressione con marcatori molecolari appropriati, come l'espressione GFP, sono stati descritti in precedenza¹⁶. Pertanto, valutiamo la trasduzione transitoria lentivirale di un gene reporter GFP nei protoscoleces e nei vermi strobilati di E. granulosus.

Questo studio è stato approvato dal National Institute for Medical Research Development e dal Research Ethics Review Committee, n. 958680. I lentivirus sono classificati come organismi BSL-2; quindi, tutte le procedure di coltura di laboratorio in questo protocollo sono state eseguite utilizzando pratiche di laboratorio sterili e condotte sotto una cappa a flusso laminare secondo le linee guida NIH. La Figura 1 mostra una presentazione schematica del protocollo di studio per i diversi stadi di E. granulosus .

1. Raccolta di cisti idatidi

1. Raccogli cisti idatidi epatiche da pecore naturalmente infette macellate regolarmente in un mattatoio.
2. Sterilizzare completamente la superficie della cisti utilizzando una garza sterile e alcool al 70% prima di aspirare i protoscoleces (PSC).
3. Aspirare 20-50 mL di liquido idatidico in tubi conici sterili da 50 mL.
4. Dopo il drenaggio, asciugare la cisti con una lama affilata, trasferire lo strato germinale in un tubo conico sterile da 50 ml e agitarlo per un breve periodo (~ 2 min) per aumentare la raccolta di PSC. Trasferire lo strato germinale in un nuovo tubo da 1,5 ml per la caratterizzazione molecolare.
5. Lavare i PSC 3-5x con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
6. Osservare i PSC in eosina allo 0,1% per 5 minuti per determinare la vitalità del PSC al microscopio ottico. Utilizzare PSC con almeno il 95% di vitalità per la cultura.
7. Trattare il precipitato PSC con 2 mL di pepsina (2 mg/mL, pH 2) per 15-20 min.
8. Per isolare i singoli PSC, risospese il sedimento PSC in PBS e passarlo attraverso due strati di garza sterile in un nuovo tubo conico sterile da 50 ml.
   NOTA: Calcolare la media di tre conteggi su 50 μL di sedimenti PSC utilizzando un microscopio ottico. Per le prove successive, utilizzare il valore stimato per determinare le PSC/μL. Ogni isolato di cisti idatidica deve essere caratterizzato sulla base di polimorfismi nucleotidici mediante metodi molecolari, come il sequenziamento PCR¹⁷ o l'analisi della curva di fusione ad alta risoluzione¹⁸.

2. Coltivazione bifasica di PSC di E. granulosus per ottenere vermi adulti

NOTA: le PSC isolate devono essere coltivate in condizioni sterili in un armadio a flusso laminare di classe II. Preparare separatamente le fasi solida e liquida del terreno di coltura bifasico prima di procedere ai passaggi successivi¹⁹.

1. Preparare il terreno di coltura bifasico in modo che consista in due fasi.
   1. Per la fase solida, aggiungere 10 mL di siero bovino in un matraccio da 25 mL e lasciarlo coagulare a 76 °C per 20-30 min.
   2. Per la fase liquida (CMRL modificata), mescolare 100 mL di siero fetale di vitello inattivato dal calore (FCS), 36 mL di estratto di lievito al 5%, 5,6 mL di glucosio al 30% (in acqua distillata), 1,4 mL di bile di cane al 5% in PBS, tampone HEPES da 20 mM e 10 mM NaHCO₃ in 260 mL di mezzo CMRL-1066. Infine, aggiungere penicillina (100 UI / mL) e streptomicina (100 mg / mL) alla miscela.
2. Aggiungere 10 mL del mezzo di fase liquida a ciascun pallone di coltura di 25 cm² .
3. Aggiungere circa 5.000 PSC al matraccio di coltura e trasferire il matraccio all'incubatore a CO₂ (37 °C, 5% CO₂).
4. Dopo 24-48 ore, trasferire gli sportelli unici in un nuovo matraccio con la fase solida (siero bovino) e aggiungere 1 mL dello stesso mezzo di fase liquido fresco per matraccio. Trasferire i palloni nell'incubatore a CO₂ (37 °C, 5% CO₂).
5. Ogni 5-7 giorni, sostituire il mezzo con un mezzo di fase liquido fresco in base ai cambiamenti nel colore del terreno di coltura e alla proporzione stimata di PSC differenziati.
   NOTA: Le protoscoleces rispondono rapidamente ai cambiamenti ambientali dopo essere state coltivate e la maggior parte di esse subisce la differenziazione entro 2-3 settimane. A causa del consumo di sostanze nutritive e della crescita e dello sviluppo dei protoscoleces, il pH del terreno di coltura cambia e il suo colore si sposta verso l'arancione e il giallo.

3. Coltivazione monofasica di PSC di E. granulosus

1. Assicurarsi che la coltivazione monofasica sia fatta 24-48 ore prima della trasduzione.
   1. Coltura ~ 5.000 PSC in un matraccio di coltura^{di 25 cm 2} con RPMI e siero bovino fetale al 10% (FBS).
   2. Trasferire i palloni nell'incubatore a CO₂ (37 °C, 5% CO₂) fino all'uso.

4. Coltura cellulare per la produzione e la preparazione del virus

NOTA: Le cellule del rene embrionale umano 293T (HEK293T) sono state ottenute per la produzione di vettori dal Pathology and Stem Cell Research Center, Kerman University of Medical Sciences.

1. Trasferire 5 × 10⁵ cellule HEK293T in un matraccio da^{25 cm 2} contenente 5 mL di DMEM con il 10% di FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina.
2. Incubare le cellule HEK293T a 37 °C in 5% di CO₂ e passarle nel terreno di coltura completo ogni 48 ore. Infine, utilizzare celle HEK293T a passaggio basso per la trasduzione²⁰.

5. Produzione e preparazione del virus con i vettori lentivirali di terza generazione

NOTA: Il vettore di lentivirus pCDH513b (vettore di trasferimento) e PLPII, PLPI e PMD2G (vettori helper) sono stati utilizzati per esprimere il gene reporter GFP. Vedere la tabella dei materiali e la figura supplementare S1.

1. Giorno 1:
   1. Dopo aver tripsinato le cellule HEK293T²¹ in piastre di coltura a 6 pozzetti, il seme 7 × 10⁴ cellule per pozzetto con DMEM fresco privo di antibiotici contenente il 10% di FBS.
   2. Utilizzare cellule con una confluenza del 50%-60% per la trasduzione con il metodo del fosfato di calcio.
2. Giorno 2:
   1. Sostituire il terreno di coltura cellulare 2-3 ore prima dell'esperimento con DMEM fresco privo di antibiotici contenente il 2% di FBS.
   2. In un tubo da 1,5 mL, mescolare i plasmidi lentivirali di terza generazione, tra cui 7 μg/μL pCDH513b (vettore di trasferimento), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI e 2 μg/μL PMD2G (vettori helper).
   3. Aggiungere il tampone HEPES (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES e 1,5 mM Na₂HPO₄; intervallo di pH ottimale, 7,00-7,28) alla miscela per un volume di 422 μL.
   4. Aggiungere 16 μL di tampone Tris-EDTA (TE) all'1% alla miscela.
   5. Aggiungere 62 μL di cloruro di calcio da 2,5 mM ai tubi e mescolare bene.
   6. Aggiungere 500 μL di 2x soluzione salina tamponata con HEPES (HBS) alla miscela, goccia a goccia, entro 1-2 minuti utilizzando una pipetta Pasteur. Mescolare delicatamente fino ad ottenere una soluzione semi-opaca e incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente.
   7. Aggiungere lentamente il composto a ciascun piatto e distribuirlo con lenti movimenti circolari.
   8. Incubare le piastre a 37 °C in un incubatore a CO_{2 al} 5% e sostituire il mezzo dopo 4-6 ore con DMEM privo di antibiotici contenente il 10% di FBS.
3. Giorno 3:
   1. Confermare la trasduzione transitoria e la vitalità cellulare di successo utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita.
4. Giorno 4:
   1. Raccogliere i virus dal terreno di coltura raccogliendo il surnatante di ciascun pozzo e conservarli a -70 °C fino all'uso.
      NOTA: I lentivirus raccolti potrebbero essere concentrati e titolati per una trasfezione precisa²².

6. Trasduzione transitoria di diversi stadi di E. granulosus con il virus

1. Giorno 1:
   1. Utilizzare una piastra di coltura a 12 pozzetti per il trasferimento genico. Coltura 5 × 10^3-5 × 10⁴ celle HEK293T in triplice copia, con mezzo DMEM completo come riferimento interno.
   2. Cultura 150 PSC freschi in triplice copia in RPMI e 10% FBS.
   3. Coltura 30 vermi strobilati in triplice copia in DMEM contenente il 10% di FBS inattivato dal calore.
      NOTA: tutti i mezzi di trasduzione devono essere privi di antibiotici. Mantenere tre pozzi di controllo non trattati per celle HEK293T, PSC e vermi strobilati nel processo.
   4. Preparare una miscela di 1 × 10⁶ virus con reagente di trasfezione da 4 μg/mL (vedere la Tabella dei materiali) per trasdurre le cellule HEK293T e le diverse fasi del worm.
   5. Aggiungere lentamente il composto a ciascun piatto e distribuirlo con lenti movimenti circolari. Incubare le piastre per 4-6 ore in un incubatore a CO₂ (37 °C, 5% CO₂). Sostituire il mezzo per ciascun campione con lo stesso terreno di coltura completo per ridurre al minimo gli effetti tossici del reagente di trasfezione.
2. Giorno 2:
   1. Ripetere i passaggi 6.1.4-6.1.5 per aumentare l'efficienza della trasduzione transitoria per le celle HEK293T, i PSC e i vermi strobilati.
   2. Incubare tutte le piastre per 24-48 ore in un incubatore a CO₂ con le stesse condizioni di coltura in base al tipo di mezzo cellulare.
3. Giorno 3:
   1. Verificare se la trasduzione ha successo utilizzando la microscopia a fluorescenza.
      NOTA: Prendere in considerazione l'utilizzo di ulteriori test di conferma come PCR / qPCR^20,23 o Western blotting²⁴ tecniche nella procedura di trasferimento genico.

Qui, descriviamo una tecnica di trasduzione transitoria rapida ed efficiente in E. granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione. Abbiamo coltivato PSC in un terreno di coltura bifasico per ottenere vermi strobilati, come descritto in precedenza25,26. I protoscoleces si sviluppano in vermi strobilati dopo 6 settimane in vitro. Diversi stadi di E. granulosus sono stati osservati nel terreno di coltura bifasico, tra cui PSC invaginati (Figura 2A), PSC evaginati (Figura 2B) e vermi strobilati con prima e terza formazione di proglottidi (Figura 2C-E). I protoscoleces e i vermi strobilati ottenuti rispettivamente da colture monofasiche e bifasiche sono stati trasfettati con lentivirus che esprimono GFP (Figura 3). Per evitare effetti di autofluorescenza, le osservazioni microscopiche sono state confrontate con la fluorescenza di fondo in tutti e tre i gruppi di campioni e tutti i campioni al di sopra di questo livello di fondo sono stati considerati trasfettati.

Abbiamo regolato l'illuminazione del campo e abbassato l'otturatore per evitare qualsiasi possibile emissione di autofluorescenza nei campioni di controllo per ogni trattamento. Abbiamo quindi controllato campioni lentivirali trattati con vettori, in cui l'emissione di luce verde contro un campo nero era considerata un'efficace trasduzione transitoria. Celle HEK293T - il controllo del processo di trasduzione transitoria - GFP chiaramente espresso (Figura 3D). I vermi adulti hanno espresso GFP più distintamente nello strato tegumentale (Figura 3F); tuttavia, gli sportelli unici hanno dimostrato un livello leggermente inferiore di espressione della GFP dopo 48 ore. Alcuni residui di fluido cisti e / o detriti dello strato germinale intorno alle PSC hanno causato una certa fluorescenza sullo sfondo nei campioni trasfettati. L'intensità della fluorescenza nelle cellule HEK293T e nei vermi strobilati è aumentata dopo 24 ore e 48 ore (sono stati osservati cambiamenti minori nelle PSC).

Figura 1: Una presentazione schematica del protocollo di studio. Abbreviazione: PSCs = protoscoleces. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: I diversi stadi di Echinococcus granulosus nel terreno di coltura bifasico. (A) PSC invaginati, (B) PSC evaginati, (C, D) vermi in fase di strobilazione, (E) vermi strobilati con terza formazione proglottide, (F) vermi in diversi stadi di strobilazione nel terreno di coltura. Barre di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Trasduzione transitoria di diversi stadi di Echinococcus granulosus e della linea cellulare di controllo in microscopia leggera e fluorescenza. (A,D) Cellule HEK293T come controllo del processo di trasduzione, (B, E) protoscoleces e (C, F) vermi strobilati. (G, H, I) Microscopia mista a luce e florescenza. Barre di scala = 50 μm, 100 μm e 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Mappa del vettore di clonazione ed espressione del cDNA pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro. Fare clic qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.