Questo protocollo fornisce strumenti sperimentali per valutare l'assorbimento macropinocitico di nutrienti (carboidrati e proteine) da parte delle cellule iperattive di mTORC1. Vengono descritti i passaggi dettagliati per quantificare l'assorbimento del destrano marcato in fluorescenza e dell'albumina sierica bovina (BSA).
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Articolo metodologico
Valutazione quantitativa della macropinocitosi in cellule iperattive mTORC1 mediante citometria a flusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
La macropinocitosi è un processo endocitico altamente conservato, dipendente dall'actina, che consente l'assorbimento di materiale extracellulare, comprese proteine e lipidi. Nelle cellule proliferanti, la macropinocitosi può fornire nutrienti extracellulari al lisosoma, trasformati in blocchi critici delle macromolecole. Studi recenti hanno evidenziato la dipendenza di più tumori dalla macropinocitosi, tra cui il cancro al seno, al colon-retto e al pancreas. Si ritiene che le mutazioni di Ras siano gli eventi driver dietro l'inizio della macropinocitosi, portando all'attivazione di processi anabolici cellulari attraverso la via di segnalazione mTORC1. È interessante notare che mTORC1 può anche essere attivato dalla macropinocitosi indipendentemente da Ras. Pertanto, la macropinocitosi rappresenta una vulnerabilità metabolica che può essere sfruttata per colpire i tumori macropinocitici limitando terapeuticamente il loro accesso ai nutrienti.
Nel complesso della sclerosi tuberosa (TSC) e nella linfangioleiomiomatosi (LAM), l'iperattivazione di mTORC1 porta a un aumento della macropinocitosi e della riprogrammazione metabolica. Qui, descriviamo un protocollo basato sulla citometria a flusso per valutare quantitativamente la macropinocitosi nelle cellule di mammifero. Vengono impiegati MEF carenti di TSC2, che mostrano un'attivazione aberrante di mTORC1 e hanno dimostrato di avere un aumento della macropinocitosi rispetto alle cellule che esprimono TSC2. Le cellule trattate con inibitori farmacologici della macropinocitosi vengono incubate con destrano (BSA) marcato in fluorescenza, fissabile con lisina, o albumina sierica bovina (BSA) marcata in fluorescenza, dosata mediante citometria a flusso. Ad oggi, sono state sviluppate solide tecniche basate su immagini per valutare quantitativamente la macropinocitosi nelle cellule tumorali in vitro e in vivo. Questa analisi fornisce una valutazione quantitativa della macropinocitosi in molteplici condizioni sperimentali e integra le tecniche esistenti basate su immagini.
Introduzione
La macropinocitosi è un processo endocitico dedicato all'assorbimento di massa di materiale extracellulare seguito dalla formazione di macropinosomi, riciclati nella membrana plasmatica o fusi con lisosomi per degradare il carico internalizzato 1,2. Sebbene l'assorbimento del carico non sia selettivo, la macropinocitosi è un processo a più fasi, strettamente regolato dalle GTPasi Rab e dai fosfolipidi di membrana 3,4. In particolare, le cellule tumorali impiegano la macropinocitosi per internalizzare i nutrienti extracellulari, tra cui proteine, polisa....
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Protocollo
1. Trattamento cellulare
Giorno 1
- Seme di fibroblasti embrionali di topo (MEF) carenti di TSC2 e TSC2 esprimenti in triplicato, in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti utilizzando DMEM, integrati con il 10% di FBS. Le cellule dovrebbero essere confluenti al 60-70% entro il giorno 3.
- Seminare pozzetti di controllo aggiuntivi per ogni condizione farmacologica che non saranno colorati con FITC-destrano o TMR-BSA.
Giorno 2
- Aspirare accuratamente il terreno e sciacquare ....
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Risultati
La ritanserina inibisce la macropinocitosi nelle cellule carenti di TSC2
Abbiamo precedentemente dimostrato che l'assorbimento macropinocitico dei nutrienti è aumentato di tre volte nelle cellule carenti di TSC2 rispetto alle cellule che esprimono TSC2 16. Nella TSC e nella LAM, la macropinocitosi è mediata dalla diacilglicerolo chinasi alfa (DGKA). Il prodotto metabolico della DGKA è l'acido fosfatidico (PA), un comp.......
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Discussione
Qui, descriviamo un approccio quantitativo per valutare la macropinocitosi utilizzando la citometria a flusso. Questo metodo fornisce una misurazione accurata e rapida del destrano e dell'albumina del carico macropinocitico marcati in fluorescenza. Studi precedenti hanno accuratamente caratterizzato l'indice macropinocitico delle cellule tumorali utilizzando approcci di microscopia confocale15,20. Sebbene questi metodi quantifich.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il premio per lo sviluppo della carriera della Fondazione LAM. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com. La lettura critica è stata eseguita da Hilaire C. Lam.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Terreno di crescita |
| EIPA (amiloride) | Sigma Aldrich | A3085 | Inibitore della macropinocitosi |
| FBS | R& D Systems | S11150 | Siero fetale bovino |
| FITC-destrano | Invitrogen | D1822 | Polisaccaride fluorescente (70kDa) |
| Parafolmadehyde | Pierce | 28906 | Agente di fissazione |
| PBS | Gibco | 10010-023 | Tampone fosfato |
| Soluzione salina Penicilina/Streptomicina | Sigma Aldrich | P4458-100ML | Antibiotici per |
| colture cellulariAcido fosfatidico | Avanti | 840101P | Fosfolipide derivato dall'uovo |
| Ritanserin | Tocris | 1955 | Inibitore DGBA |
| TFR-BSA | Invitrogen | A23016 | Albumina fluorescente |
| Tripsina | Sigma Aldrich | 25300-054 | Agente di dissociazione |
Riferimenti
- Yoshida, S., Pacitto, R., Inoki, K., Swanson, J. Macropinocytosis, mTORC1 and cellular growth control. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (7), 1227-1239 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-t....
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Ristampe e permessi
